このプロトコルでは、ケージ分子接着剤タグを使用して生きている細胞での核内移行を光トリガーについて説明します。このメソッドは、サイト選択的核ターゲット ドラッグデリバリーの有望です。
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この記事について
サマリー
要約
細胞核は、遺伝子の複製の変調から最も重要な細胞内小器官の一つを細胞内薬物送達ターゲットとして、式は様々 な疾患の治療に有効です。ここでは、光トリガー核移行を利用するお客様のケージが複数のためイオン (Gu+) ペンダント (酪酸置換アニオン光分解性グループによって保護されて分子接着剤 (ケージ接着剤 R) タグを紹介します。nitroveratryloxycarbonyl;BANVOC)。ボールリテーナ入り接着剤-R が付いたお客様は生活に取り込まれ、細胞のエンドサイトーシスによってエンドソームのまま。しかし、光照射に伴い、ボールリテーナ入り接着剤-R がアンケージ分子接着剤 (Uncaged接着剤-R) 複数の区+ペンダントを運ぶエンドソーム脱出とゲストの後の核移行を容易にするに変換されます。このメソッドは、タグ付けのお客様は細胞核に続いて細胞質に移行できますので核ターゲット サイト選択の薬物送達のための有望な場合にのみ長。ケージ接着剤 R タグは、小分子のお客様だけでなく、量子ドット (Qd) など高分子のゲストを提供できます。ケージ接着剤 R タグは紫外線だけでなく、組織に深く浸透することができます, 二光子励起近赤外線 (NIR) ライトとケージですることができます。
概要
遺伝情報を運ぶ、細胞核の 1 つ最も重要な細胞内小器官細胞内薬物送達ターゲットとして遺伝子複製の変調から式は、がんを含むさまざまな病気の治療に有効と遺伝1,2,3 を障害します。薬のデリバリー、ペプチドの活用は、ような核局在化信号 (NLS)4,5,6が広く検討されているタグを付けます。ただし、望ましくない副作用を減らすために核移行の時空間的制御が必要です。
以前は、ケージ NLS7,8,9を使用して、細胞の核蛋白質の光トリガー転流を実現しています。NLS は、6細胞質輸送タンパク質に結合して細胞核に移行します。報告の方法でケージの NLS を軸受ゲスト蛋白質はマイクロインジェクション8で細胞質に組み込まれてまたは遺伝コードの拡張手法9を使用してターゲット細胞で発現直接。したがって、細胞内取り込みと光誘起核移行を実現できる手法は実用的なアプリケーションのために有利です。
ここで、細胞樹状突起のケージ分子接着 (ボールリテーナ入り接着剤-R は、図 1) タグを使用してお客様の核内移行を光トリガーをについて説明します。水溶性の分子接着剤10、11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,タンパク質11,12,13,14,15、しっかりと接着した23複数区+ペンダントをベアリングが以前開発されています。 16,17, 核酸18,19、20、リン脂質膜21、そして粘土ナノシート22,23を通じて、複数の塩橋区+ペンダントとターゲットにされグループの形成。ボールリテーナ入り接着剤-R の区+ペンダントは光分解性陰イオン グループ、酪酸置換 nitroveratryloxycarbonyl (BANVOC) によって保護されています。ボールリテーナ入り接着剤-R が付いたお客様は生活に取り込まれ、細胞のエンドサイトーシスによってエンドソーム (図 2) でご滞在。光照射に伴い、ボールリテーナ入り接着剤-R のBANVOC グループは、アンケージ分子接着剤 (Uncaged接着剤-R) 複数の区+ペンダントを運ぶタグ ゲストの移行を容易に屈する戸建します。細胞質は細胞核 (図 2) が続きます。ボールリテーナ入り接着剤 R タグが紫外線や深刻な毒性なし二光子励起近赤外線 (NIR) ライトへの露出によってケージですることができます。高分子のお客様だけでなく、小分子ボールリテーナ入り接着剤 R タグ量子ドット (Qd) と蛍光色素 (nitrobenzoxadiazole; を使用してお客様の時空制御の核配信を紹介します。NBD) の例として、それぞれ。
ボールリテーナ入り接着剤-R の図 1: 概略構造ボールリテーナ入り接着剤-R の 9 のためのイオン (Gu+) ペンダントが酪酸置換 nitroveratryloxycarbonyl (BANVOC) グループによって保護されています。BANVOC グループは二光子励起近赤外光照射によって裂かれます。ボールリテーナ入り接着剤研究の焦点のコアは nitrobenzoxadiazole (NBD) または dibenzocylooctyne (DBCO) のいずれかで修飾します。参照20から許可を得て転載。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: お客様の核内移行を光トリガーの模式図ボールリテーナ入り接着剤 R タグを持つ共役します。ゲスト/ボールリテーナ入り接着剤 R 共役は生活に取り込まれ、細胞のエンドサイトーシスを介して。光照射に伴い、ボールリテーナ入り接着剤 R タグはタグ ゲストのエンドソーム脱出を容易にすることができますUncaged接着剤 R タグを生成するケージではありません。その後、タグ付けのゲストは、細胞核に移行します。参照20から許可を得て転載。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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プロトコル
1. 接着剤-R のケージでお客様の準備のタグします。
- ボールリテーナ入り接着剤 NBD ソリューションを準備します。
- ボールリテーナ入り接着剤 NBD (図 1) を次の手順に説明した20を合成します。
- 乾燥ジメチルスルホキシド (DMSO) でボールリテーナ入り接着剤-NBD (10 mM) の原液を準備します。
注: は、暗闇の中で原液を保存します。ソリューションは、水性バッファーまたは使用時の細胞培養媒体で希釈することができます。
- ボールリテーナ入り接着剤 QD ソリューションを準備します。
- ボールリテーナ入り接着剤 dibenzocylooctyne (ボールリテーナ入り接着剤-DBCO) の合成 (図 1)20以前の手順を説明します。
- 乾燥 DMSO のボールリテーナ入り接着剤-DBCO (10 mM) の原液を準備します。
- ボールリテーナ入り接着剤-量子ドットの作製、アジ化修飾ドット (アジ化量子ドット; をまず準備します。図 3)。DMF の 400 μ L に 100 μ L のアジド PEG4 NHS エステル (図 3) のジメチル ホルムアミド (DMF、125 μ M) ソリューションを追加 (500 nM) アミン修飾 PEG (アミン QD; でコーティングされた量子ドット (Qd) のソリューション図 3)。室温で 1 h の混合物をかき混ぜなさい。
- 24 h 3,500 分子量カットオフ (MWCO) で再生セルロース膜を使用して DMF の 800 mL に対しての得られた溶液を dialyze します。
- ボールリテーナ入り接着剤-DBCO 50 μ m に DMF の原液を希釈します。後透析液 (図 3) にソリューションの 200 μ L を追加し、室温で 3 h の混合物をかき混ぜなさい。
- 再生セルロース膜 (25,000 MWCO) を使用して DMF の 800 mL に対して 24 時間の結果のソリューションを dialyze します。
- 200 に得られた溶液を希釈 DMF の nM。
図 3:ボールリテーナ入り接着剤-量子ドットの作製の模式図.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
2. 顕微鏡観察の Hep3B 細胞サンプルの調製
- イーグル最小必須培地 (実装された EMEM) 37 ° C で 5% 未満 10% 牛胎児血清 (FBS) を含む人間の肝細胞癌 Hep3B 細胞を維持 CO2。
- 種細胞実験の前日。実装された EMEM の 8 室のガラス基板のウェルあたりの種子 5.0 × 103
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結果
、光照射前にボールリテーナ入り接着剤 NBD と培養 Hep3B 細胞展示、インテリアから点状蛍光性の放出 (λext = 488 nm;図 4 aと4 C、緑)。543 で励起による得られた類似の顕微鏡写真、エンドソームにボールリテーナ入り接着剤 NBD がローカライズされているを示す赤色蛍光色素 (図 4 b 4 C、赤) の nm。したがって、ボールリテーナ入り接着剤 NBD (図 4、緑) に割り当てることができる蛍光性の放出がヘキスト 33342 で可視化された細胞の核外観察された (λext = 710 nm、光子。図 4青)。UV...
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ディスカッション
タンパク質の光トリガーの転流、細胞の核の前の調査は、ケージ NLS7,8,9を使用して達成されています。前述したように、これらのメソッドに NLS タグ付きタンパク質の細胞質を組み込む付加的な技術が必要です。対照的に、私たちボールリテーナ入り接着剤 R タグにより誘起核移行だけでなく、ゲストの細胞内取り込みできます。ボールリテーナ入り接着剤 R タグのこの機能は、生体内でアプリケーションで有利です。
ボールリテーナ入り接着剤 R タグは、量子ドットなど、細胞の核のゲスト高分子を提供できます。ここで採用されているドットが大きい直径 (DH = 15 ~ 20 nm) 核気孔より (〜 5 nm)24核に拡散できない受動的他の高分子を提供する可能性を...
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開示事項
著者が明らかに何もありません。
謝辞
ナノバイオの統合、東京の大学中心を認めます。この作品は文部の若手研究 (B) (26810046) k. o. して、部分的にサポート費補助金特別推進研究 (25000005). a. r. m. のおかげで日本社会の研究奨学金のための科学振興) 若手研究者の博士課程教育リーディング (GPLLI) のためのプログラム。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| アジド-PEG4-NHS エステル | クリックケミストリーツール | AZ103 | |
| Q-dot 655 ITK | Invitrogen | Q21521MP | |
| 再生セルロース膜 (MWCO 3,500) | 日本ジェネティクス | TOR-3K | |
| 再生セルロース膜 (MWCO 25,000) | ハーバード大学装置 | 7425-RC25K | |
| Hep3B 細胞 | ATCC | HB-8064 | |
| 8チャンバーガラス基板 | Nunc | 155411JP | |
| 96ウェル培養プレート | Nunc | 167008 | |
| Eagle's minimal essential medium (EMEM) | Thermo Fisher Scientific | 10370-021 | |
| ウシ胎児血清 (FBS) | GE Healthcare | SH30406.02 | |
| ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水 (D-PBS) | 和光純薬Industries | 045-29795 | |
| LysoTracker Red | Lonza Walkersville | PA-3015 | |
| Hoechst 33342 | 同人堂 | H342 | |
| Cell Counting Kit-8 | 同人堂 | CK04 | |
| 共焦点レーザー走査顕微鏡 | Carl-Zeiss | LSM 510 | 2光子励起レーザー(Mai Tai laser, Spectra-Physics)搭載 |
| 共焦点レーザー走査型顕微鏡 | ライカ | TCS SP8 | |
| キセノン光源 | アサヒスペクトル | LAX-102 | |
| マイクロプレートリーダー | 分子デバイス | SpectraMax パラダイム |
参考文献
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