方法論記事

多段鎖変位リソグラフィーを用いた遺伝子の機能的な面を固定化

DOI：

10.3791/58634

⸱

2018年10月25日

 ,  ,  , 
1Physics Department, Technical University of Munich

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

面上、バイオチップの無細胞遺伝子発現実験を行うため遺伝子長 DNA 分子の固定化のための単純な石版プロシージャについて述べる。

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

パターニング構造表面の遺伝子の固定化は、オープン マイクロ バイオリアクターで仕切られた遺伝子の研究の表現プロセスを許可します。人工のセルラ システムへの他のアプローチと対照をなしてこのようなセットアップを可能遺伝子式試薬と同時排出廃棄物の連続的な供給に。動的遺伝子制御フィード バック システムの実現のために重要である時間の長時間にわたって無細胞遺伝子発現プロセスの実装が容易になります。ここを用いたシンプルな使い平版 DNA ストランド変位反応に基づく市販コンポーネントを排他的に使用する遺伝のバイオチップの作製のための詳しいプロトコルを提供します。我々 もポリジメチルシロキサン (PDMS) で仕切られた遺伝子の統合のプロトコルを提供-を用いたマイクロ流体システム。さらに、システムが DNA と式ミックスに含まれている分子の分子間相互作用の直接観察に使用することができます内部全反射蛍光 (TIRF) 顕微鏡と互換性があることを示します。

概要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

無細胞発現反応様々 なアプリケーションのための生化学、バイオ テクノロジー、合成生物学で注目されています。無細胞タンパク質発現は、純粋な蛋白質のサンプルは、多くの研究のための基礎は、構造生物学の準備のため尽力しました。例えば、無細胞システム正常に使用された蛋白質複合体1または膜蛋白質2の式のセル ベースの式を使用して生成することは困難であります。特に、無細胞遺伝子発現反応は 1961年3ニーレンバーグとマッセイによる画期的な実験から始まる遺伝コードの構造の解明にも使われました。

最近では、バイオ テクノロジー、合成生物学4,5,6セル自由な方法で新たな関心がずっとあります。非生物学的化合物と無細胞システムを拡張できより簡単に7多様な生物学的起源のコンポーネントを組み合わせることができます。それは基本的な代謝機能を持つオープン携帯無料バイオリアクターを準備し、ときに単純な炭素とエネルギーの代謝産物を合成させて考えられるにもかかわらず無細胞システムがある明らかにそうでない「成長し、分裂」不利、入力8。合成生物学の新たな分野で無細胞システムは、合成生物学的機能の実装をより予測可能な「シャーシ」をすることを約束します。

現在、無細胞遺伝子発現反応いずれかを使用して実行されます (細菌、酵母、昆虫などさまざまなソース) から細胞を抽出または転写/翻訳システム (例えば、異なるアプリケーション用に最適化されました。原核生物と真核生物遺伝子発現、膜タンパク質等の生産)。(TXTL とも呼ばれる) の細菌の細胞抽出液の準備のための一般的なプロトコルは、V. Noireaux と同僚の9によって最近提供されました。生物物理プロパティは徹底的に特徴づけられる10をされているし、TXTL システムはすでに使用されて正常に一連の複雑な生化学的なタスクを実行する:などの機能的なバクテリオファージを介してアセンブリバクテリオファージのゲノム11、細菌のタンパク質フィラメント12の合成または無細胞遺伝子回路13,14の実装の無細胞式。

無細胞合成生物学で人気のある別のシステムは、浄化されたコンポーネント15,16から再構成した純粋のシステムです。TXTL システムと比較して、それは核酸やタンパク質分解機械を含まれません。線形 DNA の分解中、rna または蛋白質、問題の少ない純粋なシステム崩壊経路が動的な関数の実装のために実際に重要です。(RecBCD) による TXTL システムの線形遺伝子テンプレート exonuclease 劣化の影響を減らすために Gam の終わりを保護するタンパク質は追加しなければなりません。TXTL、純粋なシステムが購入できます。

生化学的な反作用の区画化の効果と人工細胞のような構造や吹き込む17,18,19 の更なる創造の研究が細胞生物学の問題に話題が密接に関連 ,20。人工細胞研究は通常リン脂質や他の両親媒性物質から作られた小胞のコンパートメント内の生化学的反応システムのカプセル化を行います。このようなシステムは、区画の基本的な側面や細胞性と自己複製の構造の出現を探索するため、クローズド システムの典型的な問題に直面彼ら: 機能代謝と適切な不在で膜輸送機構、それが時間の長時間実行されている区分の反応を維持することは困難 - 燃料分子使用し、廃棄物を蓄積します。

このようなセルを模倣したコンパートメント内の区画に興味深い代替はフォトリソグラフィー メソッドを使用して遺伝物質の空間的組織です。「チップ上の遺伝子」の固定化は 10 年以上前のワイツマン研究所のバー Ziv グループによって開拓された21。解決する持っていた主要な問題の中でチップの表面蛋白質の潜在的な変性と DNA の非特異吸着をあった。バー Zivら「デイジー」は、二酸化ケイ素の表面にレジスト分子固定化保証長いポリエチレング リコール (PEG) スペーサー用反応性ターミナル シランで構成されていたと呼ばれる専用のフォトリソグラフィ レジストの開発生体適合性、および光分解性の headgroup、紫外線 (UV) 照射時に反応性アミンに変えられました。チップ表面 (数キロ塩基対 (kbp) の長さ) の遺伝子長 DNA 分子を固定するデイジーを使えることが示されています。ビューの高分子物理学の観点からは、システムは、固体基板上にグラフトした高分子ブラシを表されます。Dna 高分子電解質性質では、これらのブラシの構造は浸透圧などのイオン効果22,23に強く影響します。

最も重要なは、基板固定化遺伝子がまだ機能している、転写と翻訳の RNA および蛋白質にすることができます示されています。遺伝子ブラシはソリューション24、RNA ポリメラーゼのためアクセス、転写・翻訳の複雑な高分子混合物表面の変性していません。基板上の遺伝的要素の固定化の利点の 1 つは、彼らが小さな前駆体分子とする廃棄物は、削除された25から絶えず供給されるオープン マイクロ流体リアクター システムで動作する,26。

我々 は最近開発 (生体電子ビームのフォトレジスト) Bephore27, 市販コンポーネントに専ら基づいていた、シーケンス DNA 鎖の侵略の反応を活用と呼ばれるこのメソッドのバリエーションチップに基づく人工細胞の作成を簡単に実装できる多段階露光プロシージャの実現。手順の概要を図 1に示します。それは、生体適合性 PEG 層が固定化する光分解性グループを含んでいる DNA のヘアピンの分子に基づいています。ヘアピンの電子スピンダイナミクス興味 (「変位」DIS シーケンスを含む) の分子がストランドの足掛かりを介した侵入接続経由でをすることができますどの DNA を一本鎖足掛かりシーケンスを公開します。

デイジーが非常に密できれいなのも実現できます Bephore は潜在的に簡単に実装が、「遺伝子のブラシ」は、特定のアプリケーションの利点があります。原則として、ただし、デイジーと Bephore リソグラフィ簡単に組み合わせ。関連リソグラフィー法による DNA を構築するための DNA ストランド変位は金ブラシ黄らで以前に開発したが、無細胞遺伝子式28,29のコンテキストで未使用だった。

次のプロトコルの DNA の生産の詳細な説明は、Bephore 法を用いた無細胞発現のブラシを提供しています。遺伝子チップを試作し、チップの遺伝子の空間的構造の固定化のための多段階露光の使用方法を示す方法について述べる。反応室の作製とマイクロ流体チップで遺伝子発現反応のパフォーマンスのためのアプリケーションについても述べる。

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プロトコル

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

メモ: 手順については別のセクションでタイム スケジュール補足情報 (セクション 1) で与えられます。

1. チップ作製

注: 基板、ケイ素二酸化物またはスライド ガラス (24 mm × 24 mm、1.5 号; 22 mm × 50 mm、4 号) の 50 nm 厚のシリコン基板 (直径 100 mm、厚さ 0.525 mm) 使用として。アプリケーションによっては、他のサイズと厚みにより適しているかもしれない。

  1. 基板を介してRCA 清掃手順 (水、アンモニア NH3(aq) 30%、過酸化水素 H2O2 30%、比率 5:1:1)
    1. ビーカー ガラスの水とアンモニア溶液を混合、攪拌しながらホット プレート上の 70 の ° C の混合物を加熱します。
    2. 過酸化水素と基板を追加します。高いスループット、ポリテトラフルオロ エチレン (PTFE) ホルダーに複数の基板 (特に小さなガラス スライド) を配置します。
    3. 30 分後基板を取り出し、洗浄ボトルから水で洗い流して、窒素銃で乾燥します。すぐに基板の peg 修飾操作を続行します。
      注意: は皮膚や眼の保護具を着用し、発煙のフード。混合物からのガス放出を可能にするために廃棄容器をしっかりと閉じないでください。
  2. 基板の peg 修飾操作
    注: 凍結とビオチン-ペグ-シラン株式の融解を繰り返した空気中の水分の凝縮によるシランの反応性が減少します。したがって、適切な量のビオチン-ペグ-シラン 5 mL チューブを準備 (例えば10-20 mg)、使用するまでそれらを凍結する前に乾燥アルゴンでそれらを埋めます。
    1. ボルテックス (5 mg/mL) 乾燥トルエン ビオチン-ペグ-シランを溶解します。
    2. ヒューム フードのガラス シャーレ (直径 120 cm、高さ 2 cm) で基板を配置します。
    3. ピペットの全体の表面をカバー、基板上にソリューション (単一のガラス カバー スリップの ≈200 μ L、シリコンウェハの大規模ないくつかの mL)、基板の端を流れるソリューションを避けてください。
    4. ペトリ皿を閉じます。基板の乾燥を和らげ、湿らせたペーパー タオルで追加カバーを追加します。
    5. イソプロピル アルコールの約 40 ml を加えて 30 分後、基板を取り出して、イソプロピル アルコールに再びそれを洗い流して、窒素銃を持つ乾燥 (スライド ガラス、ペグ側に注意してください)。暗闇の中で使用されるまで、基板を格納します。
      注意: は皮膚や眼の保護具を着用し、発煙のフード。

2. 遺伝子の固定化のための準備

注: プライマー シーケンス、DNA の変更と模範的な PCR のプロトコルは補足情報 (セクション 2-4) で与えられます。

  1. ポリメラーゼの連鎖反応 (PCR)、興味の遺伝子を増幅するのに変更されたプライマーを使用します。蛍光顕微鏡で可視化のための蛍光体を運ぶ 1 つのプライマーおよび他のプライマーはトリエチレング リコール スペーサーで DIS シーケンスから単一座礁させた PCR 全体 DIS シーケンスを維持するために区切られました。
  2. 回転カラム精製キットを使用して DNA を浄化し、吸光度計を使用してその濃度を測定します。濃度は 100 よりも低くならない nM。
  3. 集中して 5 M NaCl 水溶液を用いた 1 M 塩化ナトリウムの濃度を調整します。高塩分濃度 DNA ブラシ アセンブリ プロセス22が容易になります。

3. 写真平版

注意: 光分解性 DNA (PC) は黄色光環境でのみ処理する必要があります。クリーン ルーム用黄色箔は、従来の白色光のランプの光をフィルター処理に使用できます。

  1. 基板の準備
    1. Bephore ミックス (1 μ M 1.5 μ M PC DNA、ストレプトアビジン 7.5 μ M 1 × PBS (リン酸緩衝生理食塩水) で DNA PH) を準備とパッシベーション (10 μ M 1 × PBS で DIS DNA、1 mg/mL BSA (ウシ血清アルブミン) をラベルなし) をミックスします。両方は、冷蔵庫の中に暗闇の中で数週間保存できます。
    2. ガラス カッターを使用するか、メスにエッジの上に押すことによって結晶線に沿ってシリコンウエハを壊すことによって小さい部分 (数 cm2) に基板をカットします。単純な線形マークとしてガラス カッターを使用して基板の端の方の中心から短いスクラッチを作成します。打撃の小さな粒子は窒素銃を持つチップをオフします。
    3. 2 成分シリコーン接着剤、例えばピペット チップとそれを攪拌の 2 滴を混合し、チップ、スクラッチの先端の周りの領域を空白のまま (図 2 a) の表面に接着剤を適用します。接着剤は、洗浄手順を容易にし、孵化に必要な DNA の量を減らす疎水性の障壁を提供します。後の手順で接着剤は容易に剥離することができます。
    4. 10 μ L を孵化させなさい (またはチップをカバーする必要) の室温 (RT) チップ上で Bephore ミックス。、インキュベーション中に場所、例えばピペット チップ ボックス ボックスにチップは部分的に蒸発を減らすために水で満たされました。
    5. 1 h、チップを洗浄後いくつかの時間 (50 μ L で 5 x) を削除する 1 × PBS でピペッティングによる Bephore ミックスが非連結。
    6. チップを乾燥させることがなくできるだけ多くのバッファーを脱ぐし、室温オンチップ パッシベーション ミックスの 10 μ L を孵化させなさい
    7. 2 時間後、チップ「非連結パッシベーション エージェントを削除する 1 × PBS でピペッティングによる (50 μ L で 10 倍) 何回か」を洗ってください。
  2. 投影露光リソグラフィ
    注: リソグラフィー、水浸対物レンズ × 60 で正立顕微鏡使用できます。照明時間は、目的、光源、マスクに依存、表面密度の基板 (シリコン チップまたはガラス スライド) と目的の DNA。オーバー ラップする領域を持つ 2 段階リソグラフィ用 1 分下から 60 x 目的と典型的な露出時間が長射程 (15 シリコン チップ、45 のスライド ガラスの s) 完全な露出のための 2-3 分。それは紫外線をブロックするので、基板の上に (石英) を除くカバー スリップを使用しないでください。
    1. 印刷フォトマスクをカット (模範的なリソグラフィ マスクと補足セクション 5 の補足ファイルを参照してください) 適当なマスク ホルダーに合うように適切なサイズ、視野絞り (図 2 b) の位置に挿入可能します。正確なマルチ ステップ リソグラフィ用マスク ホルダーのアライメント マークを合わせます。
    2. 顕微鏡スライドの基板を置き、顕微鏡ステージに移動します。Bephore スライド ガラスのパターニング、黒フォイル (例えば予備印刷フォトマスクから) 顕微鏡スライドとリソグラフィの暗い背景を提供するために Bephore のスライドを挿入します。
    3. 照明のパス、基板表面上にフォーカスに赤いフィルターを挿入、例えば傷の先端地域公開される基板の領域に移動します。
    4. マスク ホルダーを挿入、照明をブロック、UV フィルター (図 2) に変更します。低照度でシャッターを開き、すぐにマスクを基板に焦点にカメラを使用します。
    5. カメラに光パスをブロックし、必要な露光時間の高照度で基板を照らします。
    6. 顕微鏡からサンプルを取り、できるだけそれを乾燥させることがなく基板から同様に多くのバッファーを注意深く取り外します。
    7. Dis-シーケンスの DNA の 10-20 μ L を追加します。乾燥からそれを維持するウェット ボックスの基板を配置します。2 h (マイクロモル濃度でオリゴヌクレオチド) または室温いくつか時間/一晩 (約 100 nM 濃度 kbp 長い DNA) 基板上の DNA を孵化させなさい
    8. チップからの DNA を削除および 1x PBS で数回洗ってください。(特に、長いフラグメント) DNA の無駄を減らすために基板から採取 DNA を格納し、それを再利用します。
  3. 多段階露光
    注: の単一の領域に 2 つまたは複数のエクスポー ジャーの正確なアライメントは、偏角を避けるためにステージ上にサンプルを保持します。チップが枯渇しないことを確認します。基板上の異なる地域でいくつかの DNA のブラシの位置決め、ドライブに電動ステージを使用して、指定の領域にまたは適切なアライメント マークで基板を使用します。
    1. (セクション 3.2) 最初の暴露後、基板上投-シーケンスを持つ DNA を孵化させなさい。最初の暴露から生じるすべての結合部位が占められることが重要です。したがって、室温約 3 h のオリゴヌクレオチド (10 μ M) をインキュベートします。
    2. 投標識遺伝子を固定化、基板上数時間置いてまたは RT、宿泊し、サンプルを洗って、次の露出で RT。 続行で別 2 h のパッシベーション ミックスを追加します。
    3. 追加の暴露のためには、上記の手順を繰り返します (3.2.3 - 3.3.2)。

4. PDMS デバイス

メモ: は、好ましくは、クリーン ルームであります。マクドナルドら説明されるように PDMS デバイスの作製従います標準プロトコル30

  1. フォトリソグラフィによるマスター金型の作製
    1. 高出力で 5 分間アセトン超音波処理によるシリコンウェハ (76.2 mm の直径、525 μ m 厚) をきれいにし、イソプロピル アルコールと脱イオン水ですすいでください。その後 15 分 150 ° C のホット プレートにウェハを配置します。
    2. 必要に応じて、ウェハーにレジストの密着性を向上させるために 2 〜 3 mL 接着プロモーターを追加し、2 分の 120 ° C にウェハ 30 s. 熱のため 3000 rpm でスピンします。
    3. 2-3 mL フォトレジストについて追加 (材料の表を参照してください)。15 にウェハをスピン s 500 rpm で、3,000 rpm 30、s。これは、フォトレジストの 20 μ m 厚になります。室温で 10 分間リラックス フォトレジスト層ができます。
    4. 曝露前焼く 2 分の 50 ° c、5 分の 85 ° c のホット プレートにウェハを配置します。
    5. コンパートメントの青写真とフォトマスク ウェハを配置します。好ましくは、マスク ・ アライナを使用します。フォトマスクは 64,000 dpi の解像度を持っている必要があります (リソグラフィ マスクと補足セクション 5 の補足ファイルを参照してください)。
    6. フォトマスクを通して紫外光 (- 行 5-10 mW/cm2) と 1 分のウエハーを公開します。
    7. 露光後ベーク 2 分の 50 ° c、5 分の 85 ° C でウェハを配置します。冷却し、室温で 1 時間おきましたらウェーハをしましょう。
    8. ビーカーを軽く攪拌しながら 3 分の開発者と皿にウェハを置きます。イソプロピル アルコールによるウエハを洗浄し、窒素銃で乾燥します。45 分の 130 ° C のホット プレートにウェハを配置します。
  2. PDMS のデバイスの準備
    1. ミックス PDMS ベースと硬化剤比率 10:1 とウェハ上形成は 5 mm くらいの層まで密閉容器内のウェハ上に注ぐ PDMS。唯一の 1 mm 厚の PDMS 装置を得るためには、代わりにコートを 2 分間 100 rpm PDMS によるウエハをスピンします。
    2. 乾燥器でコンテナーを置き、約 30 分間の真空 (約 85 kPa) を適用します。オーブンで 1-2 時間約 70 ° C に PDMS を熱し。
    3. ウェハから PDMS デバイスを分離します。各コンパートメントの 1 つのセットが含まれるように、PDMS をスラブに切断します。に備えて、PDMS マイクロ流路のセットアップに接続される、入口と給水路の両端の出口として穴 (1 mm 径) をパンチします。
    4. 脱イオン水、イソプロピル アルコールと PDMS 清潔で窒素銃で乾燥します。PDMS ダストフリーを格納します。

5. 区分遺伝子発現

メモ: 次の手順は温度制御のためのケージ インキュベーターとに倒立顕微鏡に仕切られた遺伝子発現の観察のためサンプル ホルダー (図 3) のアセンブリを示します。ホルダーは容易に入手できる材料や道具 (3.5 ~ 5 mm 厚ポリ塩化ビニル (PVC) プラスチック、ネジ、ナット、ドリル) を使用して構築された、顕微鏡の種類に合わせてカスタマイズすることができます。5.1 および 5.2 で説明されている手順を実行して、ホルダーの両方の部分が同時に準備ができてください。

  1. 下部ホルダー ・ アセンブリ
    1. アライメント マーク (例えば傷) と Bephore チップを準備し、両面粘着テープ (図 3 b) を使用してチップ ホルダーに接着します。チップは、それをカバーする PDMS デバイスよりも大きくなければなりません。
    2. チップ上の 1 つまたは複数の遺伝子を固定化 (セクション 2 および 3 を参照)。
    3. 下部ホルダーの中央の穴の周りいくつかの真空用グリースを追加し、チップ ホルダーに差し込みます。
      注: チップ ホルダー今に付着する下部ホルダー、グリースによる x y 平面のチップの再配置の可能性を維持しながら。
  2. トップ ホルダー ・ アセンブリ
    1. 4.2.1 の手順でスピン コーティング手順を使用して区画を持つ薄い PDMS チップを準備します。廃棄物、前駆体分子の交換のため拡散を許可する 1 つの側面にチャネルを開いたまま、できるだけ小さくの PDMS をカットします。
    2. きれいなガラス製カバー スリップ (24 mm × 24 mm、1.5 号) と 42 の酸素プラズマによる PDMS チップ (コンパートメントなし側) の裏面 s (200 W、ファラデーケージの中でサンプルと 0.8 mbar で作動する)。
    3. 上向きのコンパートメントにスライド ガラスの中央に PDMS チップを置きます。70 ° C で 1 時間の PDMS でガラスを焼く
    4. トップ ホルダーの大きな穴の周りいくつかの真空用グリースを追加します。
    5. 実験を始める前にきれいなスライド ガラス、PDMS チップと 42 の酸素プラズマを用いた親水性、PDMS をレンダリングする s。
    6. トップ ホルダー (図 3) に PDMS のスライド ガラスを配置し、(図 3) グリースの上にガラスを軽く押します。
  3. ・ ホルダー ・ アセンブリ
    1. 無細胞発現系の 100 μ L を準備し、氷の上にそれを維持します。
    2. 慎重にチップからバッファーを削除、無細胞発現系の 10 μ L でそれを一度洗います。次に、チップに無細胞発現系の 60 μ L を追加し、(図 3Bで既に削除) チップのエッジから 2 成分シリコーン接着剤を削除します。
    3. PDMS に発現システムの 20 μ L を追加します。PDMS に液滴を配置した後すぐにコンパートメントがよく濡れている、実体顕微鏡で、気泡なしをチェックします。気泡がある場合無細胞発現系の残りの部分とそれらを洗浄しようとするとします。
    4. ホルダーのチャンバーと DNA ブラシに合わせ、実体顕微鏡の下で働くし、のでグリッパー アームの下部にホルダーを固定する 2 本のネジの個セット 2 つを組み立てると wingnuts が両手で簡単にアクセスできます (図 3 D-F).
    5. トップ ホルダーを下部ホルダーに挿入し、無細胞システム液滴ヒューズ (図 3 D) までそれを下げます。実体顕微鏡コンパートメントと位置合わせマークが x y 平面の同じような地域内かどうかチェック、ガラス スライド上のホルダーにトップ ホルダーと再位置をそれ以外の場合を引き出します。
    6. 底から、彼らは、ホルダーの下側に触れるまで wingnuts を台無しに。慎重にコンパートメントと、x y 平面を介してハンドル (図 3 e) チップ ホルダーの下部にチップを合わせながら、wingnuts を締めます。一度接触に締めて wingnuts だけ非常に軽く (図 3 f)。
      注: この手順は、いくつかの経験が必要ですし、実験の設定によって異なります。応用力は小さすぎてでも高校でコンパートメントのヒントの中心 (DNA ブラシまたは表現された蛋白質) から低い蛍光強度ながら顕微鏡で PDMS とガラスの間に液体から生じる干渉パターンが示すことができます。圧力 (附則については、セクション 6 を参照してください)。
    7. 蒸発反エンクロージャのスポンジを水でスプレー、ホルダーをボックスに挿入します。2 成分シリコーン接着剤で 5 mL シリンジを入力し、ボックス (図 3) を密封することを使用します。
    8. 温度制御の顕微鏡、ボックスに転送し、DNA ブラシ、蛍光顕微鏡での反応をイメージします。照明がなくても DNA ブラシの蛍光は、無細胞発現系をフェードインします。それにもかかわらず、ブラシは、同じブラシから繰り返し遺伝子発現によって示すことができる、その活動を保持します。
      注: シリコン チップではなく Bephore ガラス スライドを使用する場合 Bephore と PDMS チップの位置 (上/下) を交換できます、作業距離が短い目的の使用を可能にします。

6 マイクロ流体デバイスにおける持続的な発現

注: 実験のセットアップは図 4 aの部分から組み立てられます。温度制御ステージのアセンブリの詳細については、補足情報 (セクション 7) で与えられます。

  1. 無細胞発現系とチューブ
    1. サンプル チューブ (約 200 μ L) の無細胞発現系を準備します。蛍光染料が付いたポリスチレン ビーズは、供給チャネルを通して流量後モニターに追加できます。
    2. チューブを圧コント ローラーに接続します。約 12 時間冷たい保持大きな氷タンクにチューブを置きます。必要な場合は、氷を補充します。
      注: 場合でも、流量抵抗の変化など長期的に役立つかもしれない、気泡による実験無細胞発現系の一定流量を提供シリンジ ポンプ圧力コント ローラーに代わりに、します。
    3. PTFE に無細胞システムを含むチューブ接続管 (内径 0.8 mm)、温水の段階に達する。鈍端と 1-2 cm の部分に注射針 (0.9 mm の直径) を分割、1 つの作品を PTFE チューブに挿入します。コネクタ、PDMS にそれとして後で。ステージと管 (図 4) の間のチューブの長さを最小限にしようとします。
    4. PTFE チューブを冷却するには、氷の水の貯水池と蠕動性ポンプに接続されている大規模のゴム製管の周りを包みます。テープで一緒にスコッチ テープ (図 4)。
  2. トップ ホルダー ・ アセンブリ
    1. 酸素プラズマによる PDMS チップの平らな面をきれい (42 秒) と継ぎ手入口と PDMS (図 4 b) の出口の穴を持つ顕微鏡スライド上に置きます。ガラスの穴は、穿孔ヘッド ガラスで事前掘削することができます。マイクロ室、スライド ガラスに直面していないことを確認します。
    2. PDMS ホルダーの平らな面に両面接着テープを適用されます。粘着テープからのバック グラウンド蛍光を避けるためにホルダーの 2 つの穴の間の領域に黒箔 (例えばリソグラフィ マスクから) の作品を貼る。
    3. ホルダーに PDMS チップを搭載したスライド ガラスを固執します。
    4. 治療は、PDMS や添付のガラス、PDMS ホルダー スライドをプラズマ中の酸素プラズマ クリーナー (42 秒)。
    5. トップ ホルダーに大きな穴の周りの真空グリス、PDMS ホルダー (図 4 b) を挿入します。PDMS ホルダー今再 x と y 方向の位置決めのための可能性を維持しながらトップ ホルダーに付着します。
    6. PDMS チップの入口へ注射器針コネクタと PTFE チューブを接続します。トップ ホルダーを PDMS へのアクセスを容易にするには、これと次のステップのため上部のプラスチックの板を簡単に削除できます。
    7. アウトレット (図 4) 注射器針コネクタ付け (約 5 cm) をチューブ PTFE の 2 番目の部分を挿入します。
    8. それは自由にすべての方向で移動するので上のホルダーに PDMS ホルダーの位置。任意 wingnuts を締め付けなし図 4Eのように緩やかに加熱ステージ トップ ホルダーの場所。
    9. 顕微鏡で PDMS コンパートメントの位置に移動し、カメラのビューのフィールドの中央に。この点からステージを移動しないでください。
    10. ステージから、PDMS の上部にホルダーを取り外します。
  3. 加熱ステージと Bephore スライド グラス
    1. 加熱ステージの温度を 37 ° C に設定します。
    2. 顕微鏡の視野の中心におよその位置合わせマークと両面粘着テープを用いた倒立蛍光顕微鏡の温度制御の段階に遺伝子ブラシで Bephore (第 4) をスライド ガラスに接着します。アライメント マークの位置決めこのコンパートメントが同じ地域に約に下げたが保証されます。
    3. 遺伝子ブラシの対応する蛍光管内を撮影し、カメラ画像内の位置をマークします。
    4. 遺伝子ブラシからバッファーを削除、乾燥に行くを聞かせていません。遺伝子ブラシにセル - 自由な表現システムの 20 μ L を追加し、シリコーン接着フレームを削除するピンセットを使用します。
  4. マイクロ流体セットアップのアセンブリ
    1. 無細胞発現系 PTFE チューブを埋めている PDMS デバイスの下部に表示されるまで、サンプル管に圧力を追加します。さらに、上、PDMS マイクロ室に無細胞発現系の 10 μ L をピペットします。コンパートメントは気泡の自由を確認します。
    2. 慎重に下部をガラス スライド トップ ホルダー、遺伝子ブラシでマイクロ室を配置します。PDMS とアライメント マーク、同じ焦点面に到達する前に x y 位置および遺伝子ブラシ (図 4E) PDMS のデバイスの向きを正確に配置するのに PDMS ホルダーの背面にある小さなネジを使用します。
    3. 位置を保持し、顕微鏡ステージ (図 4E) にトップ ホルダーを接続しているネジに沿って wingnuts を締めてガラス スライド上に PDMS を押します。
    4. 無細胞発現系およびモニター供給チャネル (流れの 1 時間あたり 0.5 に 5 μ l 間のレートをお勧めします) を通じて蛍光ビーズの流れを含む管 (図 4 階) の圧力が増加します。必要に応じて、wingnuts を締めてガラスに PDMS の圧力を高めます。

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結果

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2 段階露光:図 5蛍光に分類された DIS ストランドのパターンを重複でスライド ガラス上二段リソグラフィー プロセスの結果を示しています。

遺伝子のブラシからの蛍光蛋白質の表現:図 6から DNA 固定化蛍光タンパク質 YPet の式を示します。蛍光タンパク質を部分的に漂白と蛍光信号の回復を観察することによって遺伝子発現率を検討した時にいくつかポイントに即時の回復は、蛋白質の表現からは行われませんを無視します。式の 2 時間で最初の漂白後、蛍光強度はすぐに回復したし、漂白する前にその値を上回った。4 〜 6 時間後、蛍光を新鮮な式ミックスの供給なしには、反応が約 3-4 時間後終了を示す前勢力を回復しなかった。

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ディスカッション

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Bephore リソグラフィは、DNA や RNA のパターンの固定化のため堅牢で汎用性の高いテクニックです。まだ、手順、- 変更 - 場合はエラーのソースをすることができるいくつかの手順が含まれています。 またはシステムのパフォーマンスが低下します。

Bephore チップの作製の重要なステップは、表面の生体適合性を提供する基板の peg 修飾操作です。ここでは、それはまたその後シリル化のために表面を活性化するので、RCA の手順でクリーニングのステップは重要です。実際 peg 修飾操作中に、基板が乾燥してする必要があります。さらに、シラン ペグ ビオチンは、適切に (1.2 節) の反応性を維持し、架橋を避けるために格納する必要があります。Peg 修飾操作の結果を評価するために基板を蛍光標識ストレプトアビジンと培養および、非ペグインターフェロン コントロールに比較が可能します。正常にペグインターフェロン基板はコントロールよりもはるかに多くのストレプトアビジンをバインドする必要があります。

また、リソグラフィー プロセスの後...

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開示事項

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著者は、彼らは競争の興味があることを宣言します。

謝辞

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我々 は感謝してフォルクスワーゲン財団 (グラント号 89 883)、欧州研究評議会 (契約番号 694410 - AEDNA) で、このプロジェクトのための財政支援を認めます。M. S. S.GRK 2062 を通じて DFG による支援を認めています。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
50nmの二酸化ケイ素を使用したシリコンウェーハ(Bephore基板)Siegertウェーハの厚さ(&マイクロ;メートル):525 ±25、直径(mm):100
シリコンウェーハ(PDMSマスターモールド用)Siegertウェーハの厚さ(&マイクロ;メートル):525 ±25、直径(mm):76.2(3インチ)
スライドガラス No. 4Menzel22 mm x 50 mm
No. 1.5Assistent24 mm x 24 mm
Biotin-PEG-SilaneLaysan BioMW 5,000
無水トルエンSigma Aldrich (Merck)244511
StreptavidinThermo-Fisher ScientificS888
DNAIntegrated DNA Technologies (IDT)
Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF BufferNew England BiolabsM0531SPCR kit
Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System PromegaA9281スピンカラム PCR クリーンアップキット
PURExpressNew England BiolabsE6800S無細胞発現システム
PDMS Dow CorningSlygard 184
FluoSpheresThermo-Fisher ScientificF8771
PTFEチューブ(ID:0.8mm、OD:1.6 mm)BolaS 1810-10
EpoCore 20レジストテクノロジー フォトレジスト
mr-Dev 600マイクロレジスト技術 フォトレジスト現像液
Ti-PrimeMicroChemicals接着促進剤
二液型シリコン接着剤PicodentTwinsil 
紫外線防止黄色箔Lithoprotect(MicroChemicals経由)Y520E212
Equipment
Masks for PhotolithographyZitzmann GmbH64.000 dpi, 180x240 mm
Upright microscopeOlympusBX51Photolithography and fluorescence imaging
60x 水浸対物レンズオリンパスLumPlanFlリンパスBX51、NA 0.9
20倍水浸対物レンズオリンパスLumPlanFlオリンパスBX51、NA 0.5カメラ
で使用 フォトメトリクスCoolsnap HQリンパスBX51
LigthtソースEXFOX-Cite 120QオリンパスBX51
倒立顕微鏡コンTi2-E蛍光で使用遺伝子発現のイメージング
4倍対物レンズ ニコンCFI P-Apo 4倍ラムダニコンTi2-Eカメラと使用
AndorNeo5.5ニコンTi2-Eに使用
光源ルーメンコールSOLA SM IIニコンTi2-E
ケージインキュベーターオコラボボールドラインニコンTi2-E
圧力コントローラーエルベフローOB1MK3
ナノフォトメーターDNA濃度測定をインプリメント
プラズマクリーナーディーナーフェムト200 W、ファラデーケージ内のサンプルで0.8 mbarで操作
スライド マイクロ GmbH GmbH オで使用 オニに使用 に使用

参考文献

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