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方法論記事

ロボット システムを使用して処理し、組織学的解析のため大腸マウス サンプルを埋め込む

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DOI:

10.3791/58654

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2019年1月7日

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1Pathology Unit, Fondazione IRCCS Cà Granda, Ospedale Maggiore Policlinico, 2Department of Experimental Oncology, European Institute of Oncology, 3Gastroenterology and Endoscopy Unit, Fondazione IRCCS Cà Granda, Ospedale Maggiore Policlinico, 4Department of Pathophysiology and Transplantation, Università degli Studi di Milano

* These authors contributed equally

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サマリー

マウスのティッシュの処理の標準化の欠如は、人体標本と比較するとマウスの病理組織学的解析の画質を低下させます。ここでは、炎症や uninflamed での処理とひと試料を埋め込むのため日常的にロボット システムの可能性を示すため大腸組織をマウスの病理組織学的検査を行うためのプロトコルを提案する.

要約

人間の病気の理解は、動物モデルの研究のおかげで大幅に拡張されています。それにもかかわらず、実験モデルの病理組織学的評価は厳格ひと試料に適用する必要があります。確かに、信頼性と正確な結論を導き出す、ティッシュ セクションの準備の質によって影響批判的に。ここでは、マウスのサンプルのパラフィン包埋する初期の準備から、手順の中にいくつかの自動化された手順を実装するマウス組織の病理組織学的解析のためのプロトコルについて述べる。自動化された手順から厳格なプロトコルの標準化、方法論的変数の削減は、マウスの病態解析の全体的な信頼性の向上に貢献します。具体的には、このプロトコル処理の自動化の使用率について説明します、ロボット システムを埋め込む日常的に使用ティッシュの処理、パラフィン包埋ひと試料の腸管炎症のマウス試験片を処理します。マウス組織の病理組織学的検査の信頼性が標準化と自動化技術の導入時に著しく増加することが分かった。

概要

最後の十年では、人間の病気1,2につながる病原性のメカニズムを解剖するいくつか実験的なモデルが開発されています。疾患の重症度を評価するために研究者は治療の効果の評価、細胞学的・組織学的アーキテクチャのバリエーションや炎症3の量を研究する必要があります。それらの実験モデルに実行するには、多くの場合マウスと人間のサンプル4,5を比較詳細な病理組織学的解析が必要です。

また、ひと試料は一般的処理および病理コア施設で得点、を通して経験豊富な人間の病理病理組織学的基準・方法の標準化します。逆に、マウス組織は通常固定、埋め込まれ、病理組織学的プロトコルの限られた経験を持つ研究者によって分析しました。病理組織学的検査の信頼性と品質高品質ティッシュ セクションの準備から始まります。いくつかの要因は、固定、マクロを含む、最終的な分析の品質区分、処理、パラフィンの埋め込みと埋め込みサンプル6、7の増減に批判的に貢献します。

サンプルの操作を含むすべてのこれらの通路は、マニュアル サンプルの埋め込みなど、手作業によるエラーより少ない程度に、手動ミクロトーム切片および汚損にさらされます。現時点では、組織学的評価のためのマウスのティッシュの準備のプロセス全体は、マニュアルや研究室から研究室を異なるプロトコルに依存します。本研究の目的は、マウスの病理組織学的検査の変動とエラーを減らすために標準化された自動化されたプロトコルを実装することです。

我々 の知識を述べるここで完全に自動化された組織処理およびマウスの組織の組織学的評価のための埋め込みの最初のプロトコルこれらは日常的に病理単位で人体標本の分析に使用されます。メソッドの実行可能性の実用的な例として腸炎のマウスモデルが分析されて、すなわち, , 慢性大腸炎モデルによる飲料水8 デキストラン ナトリウム硫酸塩 (DSS) の反復投与、9。DSS 投与動物は、体重減少、軟便または下痢、そして線維症と同様、大腸の短縮など腸の炎症の兆候を示すので人間の炎症性腸疾患 (IBD)10のような密接にこの実験的設定8,9,11。人間の IBD 患者の観察、DSS 治療は複雑な病気のコースを生成します。この文脈では、精巧な組織学的評価は、組織アーキテクチャの深遠な変更を理解する必要があります。したがって、サンプル準備の質を高めるための説明のプロトコルの実装が組織学的の解釈に依存する研究者を受けることが、マウス実験的設定の免疫組織化学的解析。実験モデルマウスの組織構造変化を伴う疾患の細胞組織潜入やさまざまな組織、臓器 (腸、脳、肝臓、皮膚) の炎症の存在使用の品質が向上した、病理組織学的検査のための試料調製。

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プロトコル

動物の手続き健康 (認証 127/15、27/13) イタリア省によって承認され、腫瘍 IACUC (制度的ケアおよび使用委員会) の欧州研究所の動物のケアのガイドライン

1. 慢性大腸炎反復的な DSS 投与による誘導

  1. 別年齢とセックス (H2O 対 DSS 処理, 実験群あたり少なくとも 5 マウス同腹子) 2 つのグループのマウスに一致。
  2. 2.5% を管理 DSS (40 kDa) 治療グループに 7 日とコントロール グループに水を飲料水に。
    注:このモデルでは、慢性的な貫壁性腸炎9を誘導します。
  3. 7 日後 DSS 治療を中止し、14 日間の両群れに水を与えます。このプロセスを 3 回繰り返します。
    注: DSS の反復的な管理は、密接に人間の IBD、すなわち、線維症9に似た大腸粘膜の変化を誘導します。
  4. CO2吸入によって、すなわち制度 IACUC によって承認の手順に従ってマウスを犠牲に。
  5. メスのマウスの腹腔と腹膜を開きます。
    注:不妊が推奨されますが、必須ではありませんが。
  6. 鉗子、ピンセット、小腸からコロンで区切ります。ピンセットや鉗子で大腸を切除します。
    注:大腸の長さの測定 (図 1 a) は、DSS 投与マウスで大腸炎が発生したかを判断する方法です。
  7. リン酸バッファー生理食塩水 (PBS) x 冷 1 の 10 mL をシャーレにコロンをすすいで軽く押して糞便材料を削除します。

2. マウス組織固定

  1. 10 mL の 10% に各マウスの結腸標本を浸す常温 (室温) 中性緩衝ホルマリン (NBF)。
    注:不妊が推奨されますが、必須ではありませんが。
  2. 室温 18-24 h のための組織を修正します。

3. 大腸の区分およびティッシュの準備

  1. 小さなピンセットで NBF コンテナーから固定組織を削除し、シャーレに入れてください。小さなピンセットでセクショニング作業プレートにコロンを置きます。
  2. 生殖不能のメスとフラグメント (0.3 cm 長さに 0.2 cm) にコロンをカットします。このフラグメントの長さは、カセットの厚さを超えないに最適です。
  3. 小さなピンセット (図 2 a) で 1 つのコロンのセグメントを拾います。突き出た小さなピンセット (図 2 b) でカセットを埋め込み志向のパラフィンのヒント プラスチックの 1 つに 1 つのコロンのセグメントを挿入します。
  4. カセットごと追加 3 コロン セグメント操作 (3.2-3.3) を繰り返します。隣接する突出のヒントは、組織の重複を最小限に抑えるために、セグメントを挿入するを避けるため
  5. (図 2) の 4 つの端を慎重に押してカセットをしっかりと閉じます。組織の損傷を防ぐためにティッシュを絞るしないでください。
  6. プラスチック サポート フレーム グリッドに挿入します。サンプルを識別するサポート フレームにラベルを付けます。生物学的サンプルごとに繰り返します。

4. ティッシュの処理

  1. (図 3 a, 3 b) の電源ボタンを押すことで自動プロセッサを入れます。
  2. ウォーム アップに、パラフィン ワックスを溶融して 1 h。計測器は、専用のアイコン (図 3) の存在を観察することによって、パラフィンが完全に溶融を確認するまでを待ちます。
  3. 自動化されたプロセッサ (図 3 D) によって提供される金属のバスケットに方向づけられたカセットの各 (組織標本を含む) 手動でを挿入します。バスケットの占有率を最適化するために他に 1 つの近くにそれらを並べることによってカセットを垂直方向に配置します。
  4. 金属のバスケット (図 3E) を閉じます。
  5. レトルト (図 3 f) のカバーを開きます。レトルトはマシンにバスケットが挿入される場所です。バスケットをプロセッサ (図 3) の専用ハウジングに挿入します。レトルト (図 3 H) の蓋を閉じます。
  6. 器コンピューターのタッチ スクリーンを使用すると、作業プロトコル (図 3 i) を定義できます。ソリューション、タイミングおよび表 1に提供スキームに従って実装する温度のシーケンスを選択します。
  7. (図 3J) 専用のコンピューター アイコンをクリックして、バスケットを含むレトルトで実行するプロトコルを割り当てます。[スタート] ボタン(図 3 L) をクリックしてプロトコルを起動します。
  8. 楽器専用のアイコンの存在を観察することによって、マシンからアラーム音を聞くことによって、プロトコルの最後を確認するまでを待ちます。
  9. レトルトのカバーを開きます。プロセッサ (図 3 M) からバスケットを削除します。

5. 組織の埋め込み

  1. 電源ボタン (図 4 a) を押すことで自動埋め込みソフトを入れます。
  2. ウォーム アップに、パラフィン ワックスを溶融して 1 h。楽器は、パラフィンが楽器の内部温度計によって示されるパラフィン浴の温度を観察することによって完全に溶融を確認するまでを待ちます。
  3. Embedder ラックにプロセッサ バスケットからすべての処理されたカセットを手動で転送します。各ラックは、最大 32 のカセットを含めることができます。(図 4 b 4 C)。
  4. 主な端末カバー (図 4、 4 D、4 e) を開きます。
  5. ロボットに信号器コンピューターのタッチ スクリーンを使用システム ラックがされている挿入 (図 4 階)。
  6. 入口住宅ふた (図 4) を開きます。入口ハウジング ラックに挿入します。各端末は、同時に最大 4 ラックを含めることができます (図 4 H、 4 i)。入口住宅ふた (図 4 j) を閉じます。
  7. 表 2 (図 4 K) によると埋め込み手順を開始するのに器コンピューターのタッチ スクリーンを使用します。
    注: 32 カセットの各ラックは、埋め込まれる 45 分かかります。
  8. 楽器専用のアイコン (図 4 L) の存在を観察することによって、プロトコルの最後を確認するまで待機します。
  9. アウトレット ラック (図 4 M) を削除します。主な端末カバーを閉じます。
  10. ラックから (方向グリッドを含む) 埋め込みのブロックを削除します。ストレージの段ボール箱で埋め込まれたブロックを転送します。

6 マイクロメートルの断面

  1. ミクロトームの冷却板を入れます。-8 間温度設定、-10 ° C
  2. 蒸留水 2 L を含む、ミクロトームの恒温水槽を入れます。42-45 ° c の水浴の温度を設定します。
  3. パラフィンの場所には、冷却プレート上のブロックが埋め込まれています。クールなブロックを許可するように少なくとも 5 分を待ちます。
  4. 冷却板から 1 ブロックを取り出してミクロトーム ブロック ホルダーにします。
  5. 10 μ m の厚みで 6 回を切断することによって膜厚を 10 μ m トリム ブロックをカット ミクロトームを設定します。
  6. 10 μ m から 3 μ m カット 1 つ 3 μ m については、ヘマトキシリンとエオシン (H & E) 染色するミクロトームの太さの設定を変更します。
  7. 小さなブラシで 3 μ m のセクションを収集します。慎重に組織のしわを減らすために水の表面上に敷設、風呂の水で 3 μ m のセクションを置きます。風呂のサーモスタットに制御された水から単一のガラス スライドに組織切片を収集します。
    1. 必要な場合は、追加のセクションをカットします。
  8. サンプル id を書き込むことによってガラス スライドにラベルを付けます。
  9. 少なくとも 10 分の 37 ° C のオーブンでスライドを置きます。
  10. ラック収納ボックス、即時解析のためにスライド ガラスを置きます。

7. ヘマトキシリンとエオシン (H & E) 染色

  1. 電源ボタンを押すことで自動着色剤に切り替えます。楽器のモニターに読み込んでバーの変化を観察することによってロボットのアームの初期化を許可します。
  2. 垂直方向に最大 30 スライドの挿入、テナー ラックにガラス スライドを挿入します。
  3. 適切な無線周波数識別 (RFID) のプラスチック ・ タグとラックのラベルを付けます。RFID タグは、テナーのコンピューターに読み込まれる正しいの汚損のプロトコルを識別するシステムです。
  4. ラックをテナーに挿入します。自動的に読み込んで、RFID タグの認識によると汚損のプロトコルを起動するコンピューターを許可します。
    注:H & E 染色プロトコルに記載されてテーブル 3.

8. 免疫組織化学的染色

  1. 免疫組織化学的および Mallory ヒアリン前述7染色法を実行します。

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結果

飲料水の DSS の反復投与による実験的慢性大腸炎は、密接に人間の IBD8,9に似た腸内の炎症のマウス モデルです。図 1大腸の短縮の (図 1 a)、DSS 誘発炎症の有無、大腸CXCL10 を含むプロ炎症性の遺伝子発現を獲得する広く使用されるパラメーターを含む DSS 治療の効果を説明します。、 tnfとmcp 1 (図 1 b)。炎症性細胞の浸潤は、DSS 治療、cytofluorimetry (図 1) を用いて、腸管粘膜の免疫応答の募集を表示によって大幅に強化されました。

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ディスカッション

マウス組織の病理組織学的解析のための準備の間に別の自動化された手順を利用します。このプロトコルは、最終的な病理組織学的評価の全体的な品質を高め、全体のプロセスの標準化し、再現性を高めるための技術的なヒントを提供することを目指しています。自動化された器械と準備をし、組織、人間標本の調査のため病理コア施設で日常的に使用の埋め込み法を実施しています。

このメソッドの潜在的な適用を示すためには、DSS 誘発大腸炎モデルと呼ばれる腸の炎症の慢性のマウス実験の設定をしました。この設定には、慢性の腸管炎症時に発生した組織アーキテクチャの深遠な変更を調査するための精巧な組織学的評価を必要とする、IBD 患者にみられる複雑な疾患の経過が似ています。完全に、これらのプロセスの組織学的評価が大幅増加し、サンプル準備品質ご利用。注意してこのプロトコルに適用できる他のマウスの組織 (すなわち、脾臓、リンパ節、肝臓、脳)、唯一の違いという指向のカセットは、内腔のない組織には必要ありません。

最も重要な観察だった手作業によるエラーの減少 (すなわち...

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開示事項

著者が明らかに何もありません。

謝辞

我々 は動物飼育で IEO 動物施設支援のため、テクニカル サポートのためのミラノ IRCCS ポリクリニコ病院の病理を感謝します。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
無水エタノールカルロ・エルバ414605試薬
アブソリュート ETOHハネウェル02860-1L試薬
硫酸アルミニウム カリウムSIGMAA6435試薬
アニリンブルーSIGMA415049試薬
カルボル フクシングマC4165試薬
CD11b (クローン M1/70)とんぼバイオサイエンス35-0112-U100抗体
CD20 IHC (クローンSA275A11)バイオレジェンド150403
抗体 CD3 (17A2)とんぼバイオサイエンス35-0032-U100抗体
CD4 (GK1.5)BDサイエンス552051抗体
CD45.2 (クローン 104)レジェンド109837
抗体 CD8 (53-6.7)BDBiosciences553031抗体
クエン酸緩衝液 pH 6 10xSIGMAC9999試薬
DabVector LaboratoriesSK-4100試薬
DPBS 1xMicrogemL0615-500試薬
DSSTdB コンサルタントDB001試薬
EDTASIGMAE9884試薬
EnVision Flexペルオキシダーゼブロッキング試薬DAKOcompreso in GV80011-2
EnVision Flex SubstrateDAKOcompreso in GV80011-2
EnVision Flex/HRPDAKOcompreso in GV80011-2
EnVision Flex+ Rat LinkerDAKOcompreso in GV80011-2
EosinVWR1.09844試薬
F4/80 (クローン BM8)BioLegend123108抗体
ホルマリンPanReac2,529,311,215試薬
氷酢酸SIGMA71251試薬
ヤギ-抗ラット-HRPアジレントDAKO P0448抗体
ヘマトキシリンDIAPATHC0303試薬
ライカ ロータリー ミクロトーム (RM2255)ライカRM2255機器
Ly6g (クローン 1A8)BD Biosciences551459抗体
マーキュリーII オキシドSIGMA 203793試薬
Omnis Clearify クリアリングエージェントDAKOCACLEGAL試薬
Omnis EnVision Flex TRSDAKOGV80011-2試薬
Orange GSIGMAO3756試薬
パラフィンSakura7052
PelorisLEICA装置
PercollSIGMAP4937
RPMI 1640 L-グルタミンなしMicrogemL0501-500試薬
STS020ライカ装置
Tissue-Teck Paraform Sectionable CassetteSAKURA7022装置
Tissue-Tekの自動パラフィン包埋装置さくら装置
キシレンJ.T.Baker8080.1000試薬
シ バイオバイオ試薬 試薬

参考文献

  1. Gibson-Corley, K. N., et al. Successful Integration of the Histology Core Laboratory in Translational Research. Journal of histotechnology. 35, 17-21 (2012).
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再版と許可

訂正


Formal Correction: Erratum: Using Robotic Systems to Process and Embed Colonic Murine Samples for Histological Analyses
Posted by JoVE Editors on 2/03/2019. Citeable Link.

An erratum was issued for: Using Robotic Systems to Process and Embed Colonic Murine Samples for Histological Analyses.  An author affiliation was updated.

The affiliation for Claudia Burrello and Federica Facciotti was updated from:

Department of Experimental Oncology, European Institute of Oncology

to:

Department of Experimental Oncology, IEO, European Institute of Oncology IRCCS

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ロボットによる組織処理マウスサンプルの包埋組織学的解析プロトコル自動パラフィン包埋マウス結腸組織腸管炎症モデルH&E染色による検証免疫組織化学染色組織カセットの準備自動処理装置の操作
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