Method Article

ロボット システムを使用して処理し、組織学的解析のため大腸マウス サンプルを埋め込む

DOI:

10.3791/58654

⸱

January 7th, 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Pathology Unit, Fondazione IRCCS Cà Granda, Ospedale Maggiore Policlinico, 2Department of Experimental Oncology, European Institute of Oncology, 3Gastroenterology and Endoscopy Unit, Fondazione IRCCS Cà Granda, Ospedale Maggiore Policlinico, 4Department of Pathophysiology and Transplantation, Università degli Studi di Milano

In This Article

Erratum Notice

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Erratum

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Formal Correction: Erratum: Using Robotic Systems to Process and Embed Colonic Murine Samples for Histological Analyses
Posted by JoVE Editors on 2/03/2019. Citeable Link.

An erratum was issued for: Using Robotic Systems to Process and Embed Colonic Murine Samples for Histological Analyses.  An author affiliation was updated.

The affiliation for Claudia Burrello and Federica Facciotti was updated from:

Department of Experimental Oncology, European Institute of Oncology

to:

Department of Experimental Oncology, IEO, European Institute of Oncology IRCCS

Summary

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マウスのティッシュの処理の標準化の欠如は、人体標本と比較するとマウスの病理組織学的解析の画質を低下させます。ここでは、炎症や uninflamed での処理とひと試料を埋め込むのため日常的にロボット システムの可能性を示すため大腸組織をマウスの病理組織学的検査を行うためのプロトコルを提案する.

Abstract

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人間の病気の理解は、動物モデルの研究のおかげで大幅に拡張されています。それにもかかわらず、実験モデルの病理組織学的評価は厳格ひと試料に適用する必要があります。確かに、信頼性と正確な結論を導き出す、ティッシュ セクションの準備の質によって影響批判的に。ここでは、マウスのサンプルのパラフィン包埋する初期の準備から、手順の中にいくつかの自動化された手順を実装するマウス組織の病理組織学的解析のためのプロトコルについて述べる。自動化された手順から厳格なプロトコルの標準化、方法論的変数の削減は、マウスの病態解析の全体的な信頼性の向上に貢献します。具体的には、このプロトコル処理の自動化の使用率について説明します、ロボット システムを埋め込む日常的に使用ティッシュの処理、パラフィン包埋ひと試料の腸管炎症のマウス試験片を処理します。マウス組織の病理組織学的検査の信頼性が標準化と自動化技術の導入時に著しく増加することが分かった。

Introduction

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最後の十年では、人間の病気1,2につながる病原性のメカニズムを解剖するいくつか実験的なモデルが開発されています。疾患の重症度を評価するために研究者は治療の効果の評価、細胞学的・組織学的アーキテクチャのバリエーションや炎症3の量を研究する必要があります。それらの実験モデルに実行するには、多くの場合マウスと人間のサンプル4,5を比較詳細な病理組織学的解析が必要です。

また、ひと試料は一般的処理および病理コア施設で得点、を通して経験豊富な人間の病理病理組織学的基準・方法の標準化します。逆に、マウス組織は通常固定、埋め込まれ、病理組織学的プロトコルの限られた経験を持つ研究者によって分析しました。病理組織学的検査の信頼性と品質高品質ティッシュ セクションの準備から始まります。いくつかの要因は、固定、マクロを含む、最終的な分析の品質区分、処理、パラフィンの埋め込みと埋め込みサンプル6、7の増減に批判的に貢献します。

サンプルの操作を含むす....

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Protocol

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動物の手続き健康 (認証 127/15、27/13) イタリア省によって承認され、腫瘍 IACUC (制度的ケアおよび使用委員会) の欧州研究所の動物のケアのガイドライン

1. 慢性大腸炎反復的な DSS 投与による誘導

  1. 別年齢とセックス (H2O 対 DSS 処理, 実験群あたり少なくとも 5 マウス同腹子) 2 つのグループのマウスに一致。
  2. 2.5% を管理 DSS (40 kDa) 治療グループに 7 日とコントロール グループに水を飲料水に。
    注:このモデルでは、慢性的な貫壁性腸炎9を誘導します。
  3. 7 日後 DSS 治療を中止し、14 日間の両群れに水を与えます。このプロセスを 3 回繰り返します。
    注: DSS の反復的な管理は、密接に人間の IBD、すなわち、線維症9に似た大腸粘膜の変化を誘導します。
  4. CO2吸入によって、すなわち制度 IACUC によって承認の手順に従ってマウスを犠牲に。
  5. メスのマウスの腹腔と腹膜を開きます。
    注:不妊が推奨されますが、必須ではありませんが。
  6. 鉗子、ピンセット、小腸からコロ....

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Results

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飲料水の DSS の反復投与による実験的慢性大腸炎は、密接に人間の IBD8,9に似た腸内の炎症のマウス モデルです。図 1大腸の短縮の (図 1 a)、DSS 誘発炎症の有無、大腸CXCL10 を含むプロ炎症性の遺伝子発現を獲得する広く使用されるパラメーターを含む DSS 治療の効果を説明します。、 tnfとmcp 1 (図 1 b)。炎症性細胞の浸潤は、DSS 治療、cytofluorimetry (図 1) を用いて、腸管粘膜の免疫応答の募集を表示によって大幅に強化されました。

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Discussion

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マウス組織の病理組織学的解析のための準備の間に別の自動化された手順を利用します。このプロトコルは、最終的な病理組織学的評価の全体的な品質を高め、全体のプロセスの標準化し、再現性を高めるための技術的なヒントを提供することを目指しています。自動化された器械と準備をし、組織、人間標本の調査のため病理コア施設で日常的に使用の埋め込み法を実施しています。

このメソッドの潜在的な適用を示すためには、DSS 誘発大腸炎モデルと呼ばれる腸の炎症の慢性のマウス実験の設定をしました。この設定には、慢性の腸管炎症時に発生した組織アーキテクチャの深遠な変更を調査するための精巧な組織学的評価を必要とする、IBD 患者にみられる複雑な疾患の経過が似ています。完全に、これらのプロセスの組織学的評価が大幅増加し、サンプル準備品質ご利用。注意してこのプロトコルに適用できる他のマウスの組織 (すなわち、脾臓、リンパ節、肝臓、脳)、唯一の違いという指向のカセットは、内腔のない組織には必要ありません。

最も重要な観察だった手作業によるエラーの減少 (すなわち.......

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Disclosures

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著者が明らかに何もありません。

Acknowledgements

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我々 は動物飼育で IEO 動物施設支援のため、テクニカル サポートのためのミラノ IRCCS ポリクリニコ病院の病理を感謝します。

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
無水エタノールカルロ・エルバ414605試薬
アブソリュート ETOHハネウェル02860-1L試薬
硫酸アルミニウム カリウムSIGMAA6435試薬
アニリンブルーSIGMA415049試薬
カルボル フクシングマC4165試薬
CD11b (クローン M1/70)とんぼバイオサイエンス35-0112-U100抗体
CD20 IHC (クローンSA275A11)バイオレジェンド150403
抗体 CD3 (17A2)とんぼバイオサイエンス35-0032-U100抗体
CD4 (GK1.5)BDサイエンス552051抗体
CD45.2 (クローン 104)レジェンド109837
抗体 CD8 (53-6.7)BDBiosciences553031抗体
クエン酸緩衝液 pH 6 10xSIGMAC9999試薬
DabVector LaboratoriesSK-4100試薬
DPBS 1xMicrogemL0615-500試薬
DSSTdB コンサルタントDB001試薬
EDTASIGMAE9884試薬
EnVision Flexペルオキシダーゼブロッキング試薬DAKOcompreso in GV80011-2
EnVision Flex SubstrateDAKOcompreso in GV80011-2
EnVision Flex/HRPDAKOcompreso in GV80011-2
EnVision Flex+ Rat LinkerDAKOcompreso in GV80011-2
EosinVWR1.09844試薬
F4/80 (クローン BM8)BioLegend123108抗体
ホルマリンPanReac2,529,311,215試薬
氷酢酸SIGMA71251試薬
ヤギ-抗ラット-HRPアジレントDAKO P0448抗体
ヘマトキシリンDIAPATHC0303試薬
ライカ ロータリー ミクロトーム (RM2255)ライカRM2255機器
Ly6g (クローン 1A8)BD Biosciences551459抗体
マーキュリーII オキシドSIGMA 203793試薬
Omnis Clearify クリアリングエージェントDAKOCACLEGAL試薬
Omnis EnVision Flex TRSDAKOGV80011-2試薬
Orange GSIGMAO3756試薬
パラフィンSakura7052
PelorisLEICA装置
PercollSIGMAP4937
RPMI 1640 L-グルタミンなしMicrogemL0501-500試薬
STS020ライカ装置
Tissue-Teck Paraform Sectionable CassetteSAKURA7022装置
Tissue-Tekの自動パラフィン包埋装置さくら装置
キシレンJ.T.Baker8080.1000試薬
シ バイオバイオ試薬 試薬

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gibson-Corley, K. N., et al. Successful Integration of the Histology Core Laboratory in Translational Research. Journal of histotechnology. 35, 17-21 (2012).
  2. Olivier, A. K., et al. Gen....

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Robotic Tissue ProcessingMurine Sample EmbeddingHistological Analysis ProtocolAutomated Paraffin EmbeddingColonic Murine TissueIntestinal Inflammation ModelH E Staining ValidationImmunohistochemical StainingTissue Cassette PreparationAutomated Processor Operation

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