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方法論記事

脱軟骨由来のマトリックス足場の作製

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DOI:

10.3791/58656

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2019年1月7日

 ,  ,  , 
1Department of Orthopedics, University Medical Center Utrecht, The Netherlands, 2Department of Veterinary Medicine, Equine Surgery, University of Utrecht, The Netherlands

この記事について

サマリー

軟骨由来足場の脱は、軟骨組織を再生する手段として、ガイド軟骨修復の足場として使用できます。本稿は decellularization プロセスの詳細について説明します体外の設定でこれらの足場を使用するための提案を提供しています。

要約

膝骨軟骨骨欠損は、機能的サウンドの骨・軟骨の組織を再生する十分な組み込み修復能力を欠いています。この意味において、軟骨研究は、再生の足場の開発に集中しています。この資料では、馬のドナーから来る自然な軟骨の細胞外マトリックスに由来する完全に足場の開発について説明します。足場の潜在的なアプリケーションは、同種骨軟骨組織エンジニア リング、および研究組織を形成する生体外モデルを提供のための足場として、軟骨修復のための生産を含まれます。組織を decellularizing、ドナー細胞が削除されますが、天然の生理活性キューの多くは保持されると考えられています。総合的作り出された足場と比較してこのような自然な足場を使用しての主な利点は、高分子材料のさらなる高機能化がドライブ軟骨組織再生に必要ないことです。軟骨由来の足場は、体内と体外の両方の設定で骨・軟骨の組織再生に使用できます。

概要

衝撃的な出来事によって引き起こされる膝の関節軟骨欠損、不快感につながることが、とりわけ若くてアクティブな人口1,2,3の生活に大きな影響を持つことができます。さらに、若い年齢で軟骨の損傷はライフ4で変形性関節症のより急速な発症をもたらすかもしれない。現在、一般化された変形性膝関節に対する唯一のサルベージ療法は関節置換手術です。軟骨は、hypocellular、aneural と無血管組織、その再生能力は厳しく限られるです。したがって、再生医療のアプローチは、ネイティブの組織の再生能力を促し、援助に引っ張りだこに。この目的のため足場が設計され、体のネイティブ セル5携帯会社のいずれか、または分化と組織再生を誘発する誘導物質としてを使用します。

脱足場は、再生医療6内で広く研究されています。それは、皮膚7、腹部の構造8、および腱9の再生支援でたとえば、いくつかの成功を収めています。脱足場を使用の利点は、自然起源および両方を誘致し組織修復6,10に必要な適切な系統に分化を誘導する生理活性の手がかりを保持するための能力です。さらに、細胞外マトリックス (ECM) は自然な生体材料、decellularization は細胞や遺伝子のコンテンツを削除することによって潜在的な免疫応答を防ぐことができますので、生体適合性と生分解性に関する問題は克服されます。

軟骨由来のマトリックス (CDM) 足場 in vitro 実験間葉系間質細胞11シードされるとき潜在的な偉大な軟骨を示しました。さらに、これらの足場は、体内の設定12内の異所性の場所にフォーム骨軟骨内骨化をする可能性を示しています。CDM 足場の形成を導く両方の骨、軟骨、これらの足場が軟骨修復に加えて骨軟骨欠損修復の可能性を持します。

ヤンから適応プロトコルについて説明しますet al. (2010)13の生産馬から脱 CDM 足場のため軟骨を抑えます。これらの足場は II 型コラーゲンと細胞に欠けている裕福な decellularization 後任意のグリコサミノグリカン (Gag) が含まれていません。これらの足場を使用 (骨) 軟骨欠損修復の in vitro および in vivo 実験が行なえます。

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プロトコル

このプロトコルでは、変形性関節症以外の原因で死んだ馬から馬抑圧軟骨が得られました。組織制度上の倫理的な規則に沿った、所有者の許可が得られました。

注:このプロトコルでは、脱馬軟骨、再生医療戦略の体内注入、体外培養プラットフォームなどのアプリケーションに使用できるから足場の製作について説明します。酵素処理手順は、記述されている順に実行する必要があります。

1. ドナー (死体) 関節から関節軟骨の収穫

  1. 先の収穫の手順では、ソリューションを洗浄、滅菌リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)、100 U/mL ペニシリン、100 μ g/mL ストレプトマイシンや 1% (v/v) アムホテリシン b. によって補足から成る軟骨の 1 L を準備します。
  2. ドナーは、病原体を運ぶことができるので、全体の収穫手順中に手袋、白衣を着用します。
  3. 軟骨分離用そのまま (死体) ジョイントを取得します。
    注:この時点で、関節の周りの皮膚は無傷です。馬から馬抑圧軟骨がこのプロトコルで使用されていたが、他の種からの他の関節も使用できます。
  4. メスと手術用ピンセットを使用して関心の関節周辺にある皮膚を削除します。さらに、基になる関節を損傷することがなく必要に応じて、余分な脂肪と筋肉の組織を削除します。必要に応じて、準備された死体を生物学的安全キャビネットに転送します。
  5. すなわち、切開を実行するため、関節の分離はまず関節が伸展・屈曲関節を実行することによって明確に表現の場所を定義します。
  6. メスと関節部を開く外科ピンセット腱、筋肉、脂肪の複数の層を慎重に取り外します。
  7. 関節腔に到達する切開を行います。
    注:関節腔は、正しい切開を実行するときに、空洞から滴らせることが滑液でいっぱいです。
  8. 関節を一緒に保つ腱を介して切断して完全に関節を開くに進みます。
  9. 巨視的損害の軟骨を検査します。
    注:関節軟骨がツヤとなめらかな外観を持たない場合、または明らかにふくれ、裂け目、または欠陥が存在する場合は、軟骨を破棄します。
  10. 軟骨下骨から軟骨を削除するのに滅菌メスを使用します。軟骨下骨も軟骨 (図 1) の深いゾーンを削除するまでカットします。軟骨の乾燥を防ぐために定期的に洗浄ソリューション軟骨軟骨を点滴します。
    注:この時、軟骨スライスのサイズは問題ではないです。
  11. 50 mL チューブ洗浄ソリューション (図 2 a) 事前に準備された軟骨を含む軟骨スライスを収集します。
  12. スナップは、関心のすべての領域から軟骨を収集、5 分間液体窒素で軟骨スライスを確定します。
  13. 軟骨スライスを 50 mL チューブに移すし、すぐに凍結乾燥機で 24 h の軟骨スライスを凍結乾燥します。凍結乾燥機で設定約 0.090 mbar 氷コンデンサーは-51 ° C (図 2 b)。
  14. さらに使用するまで室温で乾燥した場所に軟骨スライスを格納します。
    注:足場の形成までは、ソリューションと軟骨はありません準備し滅菌方法で扱われます。

2 軟骨粒子を脱を作成します。

  1. 液体窒素で凍結乾燥軟骨スライスを沈めます。
  2. 手動または加工機によって直接サンプルを挽きます。軟骨スライスを手で研削、乳鉢と乳棒を使用して、彼らが微粉 (図 2 2 D) まで約 45 分のスライスを挽きます。自動的に研削加工、フライス盤を事前に設定速度で最大 1 分、スナップ冷凍軟骨スライスを粉砕するまで数秒間使用してください。
    注:あらかじめ液体窒素を追加することによって、モルタルや研削加工機のコンパートメントを冷たい。フライス盤を使用している場合すべての粒子は、地面と研削の区画の下部に滞在する粒子がないことを確認します。
  3. 0.71 mm の網目でふるいを使用してより大きな部分を取り除くために軟骨粒子をふるい。
  4. 室温で乾燥した場所で粒子を格納します。

3. トリプシン酵素 Decellularization 0.25%-EDTA

  1. 成る 0.25% トリプシン EDTA 100 U/mL ペニシリン、100 μ g/mL ストレプトマイシンおよび 1% (v/v) アムホテリシン b. ストア 4 ° C でソリューションを補完消化ソリューションを準備します。
    注:Trypin は、軟骨に存在する蛋白質が低下するプロテアーゼです。この酵素のステップは密な軟骨の構造を開きます。
  2. チューブあたり約 7.5 mL のボリュームまで軟骨微粉粒子で 50 mL の管を埋めます。
  3. 消化ソリューションごとの 4 h を更新中、合計で 24 h の 37 ° C で準備された消化ソリューション軟骨粒子を孵化させなさい。
    1. まず、軟骨の粒子を含んでいる各 50 mL のチューブに消化液 30 mL を追加します。
    2. その後、すべてのパーティクルが酵素のソリューションにさらされているボルテックスやピペットを使用して粒子を再懸濁します。
    3. ローラ上の 37 ° C で 4 時間サンプルをインキュベートします。
    4. 消化ソリューションを更新するには、軟骨の粒子の沈降を引き起こす 3113 x g で 20 分間チューブを遠心します。上清を捨てます。
      注:上清はトリプシン培養期間がすべて明らかになります。
    5. ステップ 3.3.1–3.3.4 を繰り返して、粒子は、4 h の 6 サイクルの分解酵素液で培養されています。
  4. 最終サイクル後遠心分離後、上清を除去し、ソリューションを二回洗濯軟骨の 30 mL で粒子を洗浄します。各洗浄の間 3113 x g で 20 分の粒子を遠心します。

4. ヌクレアーゼ治療酵素 Decellularization

  1. 10 ミリメートル pH 7.5 脱イオン水でトリス塩酸溶液を準備します。
  2. 50 U/mL デオキシリボヌクレアーゼと 1 U/mL リボヌクレアーゼ A をヌクレアーゼ ソリューションを得るために、トリス塩酸バッファーに追加します。
    注:この手順を実行して、具体的には幽門とリボヌクレアーゼが低下します。
  3. 軟骨粒子 (ステップ 3.4) からソリューションを洗って軟骨を削除、3,113 x gで 20 分間遠心、上清を削除します。
  4. 軟骨粒子にヌクレアーゼ溶液 30 mL を加え、すべてのパーティクルがヌクレアーゼ ソリューションにさらされていることを確かめて、ソリューションを通じて粒子をかき混ぜます。
  5. 37 ° C で 4 h 用ローラーにサンプルをインキュベートします。
  6. 3,113 x gで 20 分間軟骨粒子を遠心分離によってヌクレアーゼ ソリューションを削除し、上澄みを廃棄します。
  7. 軟骨粒子に 10 mm デオキシリボヌクレアーゼ リボヌクレアーゼ A もトリス塩酸溶液 30 mL を追加してサンプルを洗います。粒子を再懸濁します、室温で 20 h 用ローラーにサンプルを残します。

5. 洗剤 Decellularization

  1. Octoxynol-1 PBS で 1% (v/v) を溶解することにより洗剤の溶液を作る。
  2. 3,113 x gで 20 分間遠心分離し、上清を廃棄軟骨粒子からトリス-HCl ソリューションを削除します。
  3. 軟骨粒子に準備 1% 洗剤溶液 30 mL を追加します。ソリューションの泡を避けるために優しく軟骨粒子再懸濁します。
    注:このステップは細胞膜に分解します。
  4. ローラーに室温で 24 時間ローラーにサンプルをインキュベートします。
  5. 3,113 x gで 20 分間遠心分離によって洗剤の溶液を削除し、上澄みを廃棄します。
  6. 、Decellularization ソリューションの残党のすべてを削除するには、ソリューションを洗って軟骨の 30 mL で 8 h の 6 サイクルで軟骨の粒子を洗浄します。室温でローラーの洗浄を実行します。
    1. 次の洗濯に変更するには、3,113 x gで 20 分間懸濁液を遠心分離機、上澄みを廃棄し、新鮮な軟骨の洗浄ソリューションを追加します。
  7. チューブの最後の洗浄を残して、-80 ° C で脱軟骨粒子を格納

6. Decellularized の粒子から足場を作成します。

  1. 粒子は-80 ° C で保存されている場合、は、足場を作成する前に暖かい水に軟骨粒子を含む閉鎖チューブを解凍します。
  2. 円筒型、直径 8 mm、高さ 2 cm のプラスチック製バイアルなどに小さなひしゃくで軟骨粒子を転送します。
  3. プラスチック金型に軟骨粒子を配置、足場、虫歯を避けるためにすべての気泡を押すし、端まで金型をご記入。
    注:それは足場の亀裂につながる足場形成後金型から足場を取ることが難しくなります。
  4. -20 ° C で 10 分間の軟骨の粒子を使用した鋳型を凍結します。
  5. 凍結乾燥機で 24 時間、金型内軟骨足場を凍結乾燥します。
  6. 凍結乾燥後カビ (図 3) 足場を取るし、30 cm の距離で 365 光紫外線 (UV) とそれらをクロスリンク nm 一晩。
  7. 生体外での細胞培養や体内注入の足場を使用するために例えば、エチレンオキ サイド (EtO) ガスで足場を滅菌します。
    注:EtO 滅菌は、外部の第三者によって行われます。

7 組織染色と Decellularized の足場の特性

注:完全な decellularization を確保し、軟骨の残りの自然な文字を視覚化する、ヘマトキシリンとエオシン (H & E) ように染色を含む任意の実験では、足場を使用する前にいくつかの組織染色を実行します。decellularization、サフラニン-O 染色残留ギャグ存在、コラーゲン タイプ I のコラーゲン含有量とコラーゲン タイプ II 免疫コラーゲン コンテンツを区別するために区別します。

  1. 足場をメスで約 3 mm の薄いスライスにカットします。
    注:足場は、大きいまたは小さいサイズでカットされて、退避サイクルの期間は適応する必要があります。
  2. 4% (w/v) アルギン酸のドロップで足場を埋め込み、3.7% 非緩衝ホルマリン 20 mM CaCl2が含まれているのと同様のボリュームを追加することによって架橋を誘発します。
    注:アルギン酸を埋め込むパラフィン埋め込む前に洗浄のステップと比較してより厳格足場スライスになります。足場シードされているセル - ケースまたは体内注入、アルギン酸を埋め込む必要はありません、足場の構成は細胞によって ECM 定款により十分な抵抗力があるだろうと。
  3. 傾斜エタノール シリーズに置いて、70%、96% の 1 時間サイクルで始まる、96%、100%、100% エタノール、キシレンの 2 つの 1 時間サイクルが続くし、60 ° C で凝固したパラフィンの 2 つの 1 時間サイクルで終わるサンプルを脱水します。
  4. 脱水後、金型でのパラフィン埋め込むサンプルとサンプルを冷却します。
  5. 5 μ m 厚のスライスでミクロトームでサンプルをカットします。
  6. 染色する前に返された傾斜エタノール シリーズにそれらを置くことによってサンプルを水分補給します。キシレン 100%、95%、70% のエタノール洗浄あたり 3 分の 2 の洗浄後、5 分のための 2 つの洗浄を開始します。最後に、3 回 2 分のための水のサンプルを洗います。
    注:アルギン酸を埋め込むパラフィン サンプルを処理する使用する場合、パラフィン切片の水分補給前に 10 mM クエン酸でアルギン酸を洗浄することを確認します。
  7. ヘマトキシリンとエオシン、サンプルを染色サフラニン-O、コラーゲン ・ コラーゲン II 以前記載されている11。

8. 分析 Decellularized の足場の特性評価

  1. 11を前述のように足場のパパイン ダイジェストを取得します。
  2. 完全な decellularization を確保するため足場の二重鎖 DNA の内容を測定する蛍光ベース キットの DNA の定量化と分析を実行します。製造元によって提供されるプロトコルに従ってください。足場の乾燥重量あたりの DNA 量を表現します。
  3. 11を前述のように、足場内ギャグの残りの部分を定量化する青い dimethylmethylene 分析を実行します。DNA 当りギャグの量を表現します。

9. Decellularized の足場の播種

  1. 3 mm ステップイン 6.7 から滅菌足場厚さのスライスをカットします。
  2. 6 ウェル プレートの別の井戸で足場を転送します。
  3. 足場の上に培地の分注 1 mL の細胞培養液の足場を水分補給し、30 分間浸してみましょう軟骨細胞や間葉系幹細胞 (MSC) 拡張媒体を使用します。
    注: は、シードが細胞の培養に関しては足場の水分補給のため同じ媒体を使用します。軟骨細胞膨張媒体は、10% 熱不活化ウシ胎児血清 (FBS)、100 U/mL ペニシリン、100 μ g/mL ストレプトマイシン 10 ng/mL の線維芽細胞成長因子-2 (FGF-2) とダルベッコされたメディア (DMEM) で構成されます。MSC 拡張媒体から成っている最小必須培地アルファ (MEM) 10% 熱-不活化 FBS、0.2 mM L-アスコルビン酸 2-リン酸、100 U/mL ペニシリン、100 μ g/mL ストレプトマイシンおよび 10 ng/mL FGF 2。
  4. 培地は、直径 8 mm、高さ 3 mm で各足場の必要量は、100 μ L で 3 x 10 の6セルを準備します。
    注:種類の異なる種からの細胞はシードに使用されることができます。軟骨細胞や間葉系間質細胞を使用している場合は、上記11としてセルを分離します。軟骨細胞を使用する場合、展開されていないされて過去の P1 通路軟骨細胞の脱分化型の数を最小限に抑えるためを確認します。間葉系間質細胞を使用して、上記14としての多系統分化の能力をテストする必要があります。
  5. ピペット 50 μ L の漬けの足場の上に細胞懸濁液を準備し、37 ° C で 1 時間足場を孵化させなさい
  6. 慎重に足場のこちら側に細胞懸濁液のピペットで移しなさい残りの 50 μ L を逆さまに足場を有効にし、37 ° C で 1 時間インキュベート
  7. 培養後、井戸に培地 3 mL を追加し、37 ° C でセル シード足場を文化細胞の剥離を避けるために注意深く培養プレートを処理します。
  8. 実験に必要な期間、足場を文化し、週 2-3 回媒体を変更します。ピペットで移しなさいゆっくりと遠く離れて、できるだけ足場から。
  9. セル シード足場の養殖後、半分に足場を切って、組織学及び生化学的解析のために処理します。

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結果

CDM 足場の decellularization は、DNA の定量化を使用して DNA の残骸の量を測定すると同様、組織染色を使用してに必ず確認する必要があります。不十分な decellularization は、体内設定15,16,17の結果に影響を与える不要な免疫学的反応につながるかもしれない。この特定の decellularization メソッドの DNA は下回って 13.6 ± 2.3 ng/mg DNA/乾燥重量で開始した検出範囲 (n = 3)。このプロトコルを使用して完全 decellularization が豊富でコラーゲン タイプ II (図 4)、細胞 (図 4 a) やギャグ (図 4 b

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ディスカッション

関節軟骨の ECM は非常に密、さまざまな酵素治療法にかなり弾力性のあります。この記事で記述されている多段 decellularization プロトコルはそのような抵抗に対処し、脱行列が正常に生成されます。それを達成するには、プロセスは、数日間かけてまたがります。多くの decellularization プロセスが提案されているさまざまな種類の組織の18と軟骨の decellularization に適したプロトコルについて説明します。このプロトコルでは、ただし、すべてのセルを削除するために洗剤の手順を酵素処理に従う必要。DNA の量は、トリプシン処理を含む最初のいくつかの手順で著しく減少して適切な decellularization11と手順を残してはなりません。

このプロトコルは、馬軟骨組織の decellularization に基づいていることに注意してください。使用酵素液の活動は馬軟骨細胞の十分な除去のために十分に見つかりました。ただし、生物種間マトリックス組成の保全、にも...

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開示事項

著者は、彼らは競合する金銭的な利益があることを宣言します。

謝辞

著者は、足場の生産について w. ブートを認めたいと思います。K.E.M. ベンダーは大学医療センターからアレクサンドル ・ Suerman Stipendium によってサポートされます。R. Levato、j. マルダはオランダの関節炎財団によってサポートされて (付与契約 CO-14-1-001 と LLP-12、それぞれ)。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
死体ジョイントこれは、地元の肉屋または獣医センターから休息材料として入手できます。
滅菌リン酸緩衝生理食塩水(PBS)
ペニシリン-ストレプトマイシンGibco15140
アムホテリシンBサーモフィッシャーサイエンティフィ15290026
液体窒素
トリプシン-EDTA(0.25%)、フェノールレッドサーモフィッシャーサイエンティフィ25200072
トリス-HCl pH 7.5
ウシ膵臓由来のデオキシリボヌクレアーゼISigma-AldrichDN25
ウシ膵臓由来のリボヌクレアーゼASigma-AldrichR6513
Triton X-100 (octoxynol-1)Sigma-AldrichX100
パパインSigma-AldrichP3125
クエン酸三ナトリウム二水和物Sigma-AldrichS4641
アルギン酸Sigma-Aldrich180947
ホルマリン
CaCl2
エタノール
キシレン
パラフィン
エチレンオキシド滅菌Synergy Health、フェンロー、オランダ
からの多能性間質細胞/軟骨細胞、地元の肉屋または獣医センターから来る休息材料であるドナー関節から単離することができます。
MEM alphaThermo Fischer Scientific22561
L-アスコルビン酸 2-リン酸Sigma-AldrichA8960
DMEMThermo Fischer Scientific41965
熱不活化ウシ血清アルブミンSigma-Aldrich10735086001
線維芽細胞成長因子-2 (FGF-2)R &D Systems233-FB
DNA 定量キット (Quant-iT PicoGreen dsDNA 試薬)Thermo Fischer ScientificP7581
1,9-ジメチル-メチレンブルー塩化亜鉛 二塩Sigma-Aldrich341088
凍結乾燥機SALMENKIPPALPHA 1-2 LD plus
分析ミルIKAA 11 基本
乳鉢/乳棒Haldenwanger 55/0A
ローラープレートCATRM5
遠心分離機(50 mLチューブ用)Eppendorf5810R
カプセル(円筒形モールド)TAAB8 mm フラット
スーパーライト S UVLumatec2001AV
インキュベーター
ミクロトーム
ふるい(メッシュサイズ0.71mm)VWR34111229
ホルダー
スモールラドル
ックック馬のドナーMSCおよび軟骨細胞はメスメス

参考文献

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