方法論記事

ワンステップ低温大気プラズマ治療体外で神経幹細胞の分化

DOI：

10.3791/58663

⸱

2019年1月11日

 ,  , 
1State Key Laboratory of Advanced Electromagnetic Engineering and Technology, Huazhong University of Science and Technology, 2College of Life Science and Health, Wuhan University of Science and Technology, 3Department of Pathophysiology, Beijing Neurosurgical Institute/Beijing Tiantan Hospital, Capital Medical University

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

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このプロトコルは、神経幹細胞と分化強化のため蛍光検出に冷たい大気圧プラズマ処理の詳細な実験手順を提供しています。

要約

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除染、がん治療、創傷治癒、根管治療などの冷たい大気プラズマ (Cap) 物理プラズマ技術の開発が検討されているとはプラズマ医学という新しい研究分野を形成します。電気・化学・生物学的活性種の混合物であること、キャップが両方生体外で神経幹細胞の分化を強化する能力を示していると体内であり、神経疾患治療のための有望な方法になっています。将来的には。多くのエキサイティングなニュースは、キャップを使用してワンステップを実現することが安全に誘導、神経幹細胞 (NSCs) の分化組織輸送のため。ここで NSC C17.2 NSCs と初代ラット神経幹細胞分化を強化する自作ジェット キャップ デバイスを使用と同様、細胞の運命で反転を観察し、蛍光顕微鏡の詳細な実験的プロトコルを示す.蛍光抗体染色技術の助けを借りて、未処理のグループよりも加速の差分率を示したの両方の NSCs がわかったし、NSCs の ~ 75% は選択的に、主に中高年、コリン作動性と運動ニューロンに分化ニューロン。

概要

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NSCs の分化組織交通機関の特定の系列には、神経変性疾患や neurotraumatic 病1の最も有望な治療の一つと見なされます。たとえば、カテコラミン神経ドーパミン作動性ニューロンがパーキンソン病 (PD) 治療特に所望されます。ただし、交通機関の任意のセルを準備する従来の方法化学的毒性、瘢痕形成、または他の主として再生医療2NSCs のアプリケーションを阻害するなどの多くの欠点があります。したがって、NSC 分化の小説と安全な方法を見つけるために非常に必要です。

プラズマは事項、次の固体、液体、ガスの 4 つめの状態、それは全体の宇宙の問題の 95% 以上を構成します。プラズマは非連結の正/負と中性粒子を電気でニュートラル、ラボで高電圧放電による生成されます。最後の二十年で生物医学におけるプラズマのアプリケーションは冷たい大気圧プラズマ技術の開発として世界的に巨大な注目を集めています。この技術のおかげで安定した低温プラズマ アークの形成を伴わない雰囲気で周囲の空気で生成でき、活性窒素種 (RNS)、活性酸素種 (ROS)、紫外線 (UV) などのさまざまな反応種で構成されています放射線、電子、イオン、電気フィールド3。キャップは、微生物の不活化、がん治療、創傷治癒、皮膚疾患、細胞増殖、細胞分化4,5,6、7の治療のユニークな利点を持っています。前作でデモンストレーションを行った冷たい大気圧プラズマ ジェットは NSCs マウス神経幹細胞 C17.2 (C17.2-NSCs) で初代ラット神経幹細胞分化を高めることができるの監督のための強力なツールになる大きな可能性を出展NSCs8の分化。キャップによる NSC 分化のメカニズムはまだ明らかでないがないキャップによって生成されたプロセスで重要な要因ことが証明されています。大気圧ヘリウム ・酸素プラズマ ジェットを用いた体外NSCs、セル準備と前処理、倒立顕微鏡による形態観察が治療の詳細な実験的プロトコルの提供を目指してこの作品で、免疫蛍光染色の蛍光顕微鏡観察。

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プロトコル

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1. 細胞文化および Predifferentiation

  1. 神経幹細胞文化と predifferentiation
    1. ポリ D リジン コーティング coverslips を準備します。12 ウェル プレートに滅菌 coverslip (直径 20 mm) を置きます。次の手順に従って、coverslips に良い細胞接着の水 (材料表) のポリ-D-リジン、0.1 %w/v、カバーガラスをコートします。
      注: 各セルラインおよびアプリケーションの最適な条件を判断する必要があります。
      1. 無菌水にポリ-D-リジン、0.1 %w/v、カバーガラスの表面をコートします。Coverslip 表面の均一なコーティングをようにそっと岩。
      2. 37 ° C で一晩 (〜 12 h) を培養後ポリ-D-リジン ソリューションを削除し、3 表面をすすぎ 1 mL の滅菌水で x。
      3. それらを播く前に細胞の少なくとも 30 分を乾燥します。
  2. マウス神経幹細胞 C17.2 (C17.2-NSC) 文化と predifferentiation
    1. ダルベッコ変法イーグル培 (DMEM) 10% 牛胎児血清 (FBS)、5% 馬血清 (HS)、2 ~ 3 d の CO2を 37 ° C、5% で 1% ペニシリン/ストレプトマイシンとの 25 cm2フラスコに C17.2 NSCs を孵化させなさい。
    2. セルが 85% の合流点に達したら、メディアを取り出して、1 ml の PBS のセルを洗浄して、フラスコに新鮮なトリプシン (0.25%) の 1 つの mL を追加します。放置 1 分;次に、フラスコ、ピペットを上下に数回単一細胞懸濁液を確保するために培養液 1 mL を追加します。
    3. 診断を使用して懸濁液で細胞密度をカウントします。2 x 10 の4セル/mL の最終的な細胞濃度を与える細胞を懸濁液の必要量を計算します。
    4. 〜 10 の4細胞/ウェル x 2 の密度を持つ 12 ウェル プレートにコーティング coverslips に C17.2 NSCs をシードします。顕微鏡下で細胞密度を確認します。
      注: より良い結果を最適な細胞密度は蛍光抗体法により実験の前に決定する必要があります。
    5. 添付ファイルを許可する 12 時間のセルのインキュベーターで 37 ° C でセルを孵化させなさい。
    6. 取付後洗浄セル 2 1 ml の PBS の x とプラズマ治療前に、48 時間 1 %n2 サプリメント DMEM/f12 キーから成る分化培地で細胞を育成します。
  3. 初代ラット神経幹細胞文化と predifferentiation
    1. ラット NSC 5 x 10 の5セルの密度でノンコート T25 フラスコで培地に初代ラット NSC サスペンションの文化.
      注: 初代ラット NSCs が謝らのプロトコルに従って分離されました。9。
    2. 倒立顕微鏡下神経幹細胞の形成を確認します。神経幹細胞の形態を表わす球形、透明な多細胞複合体であることを確認します。
    3. 直径 3 mm 以上に達すると、神経幹細胞、neurosphere 懸濁液を 15 mL 滅菌遠心管させ、神経幹細胞は重力によって解決に転送します。
    4. 培地量が最小限で、神経幹細胞を残して慎重に上清を除去します。
    5. リンス 1 神経幹細胞、神経幹細胞が重力によって解決する PBS の 5 ml x。PBS の最小ボリュームを残して上清を除去します。
    6. 1 ミリリットルあたり 12 〜 15 を神経幹細胞に細胞の密度を調整する分化培地の最適ボリュームを追加します。初代ラット NSCs の分化培地 DMEM/f12 キー、2%、B27、1% から成っている政府短期証券。
    7. シード 12 ウェル プレートで各コーティングされた coverslip に neurosphere を懸濁液の 1 mL。
      メモ: は、神経幹細胞を均等に分散できるように優しくプレートを振ります。この手順より良い結果を蛍光抗体法により重要です。
    8. インキュベーターにプレートを置き、プラズマ治療前に、24 h の predifferentiate ことができます。

2. プラズマ ジェットの準備

  1. 2 mm の内径と外径 4 mm. の半開石英管をチューブ 2 mm の直径で高圧線に挿入を選択します。
  2. 5 mL 注射器に高圧線の石英管を挿入し、注射器の真ん中にそれをマウントするホルダーを使用します。1 cm で石英管の密封端とシリンジの先端間の距離を設定します。
  3. 注射器の開放端に 1 m シリコーン ゴム管 (内径 12 mm) を接続し、シーケンスの流量計・ ガスのバルブに接続します。

3 ジェット機の取得

  1. 図 1に示すように、回路を接続します。プラズマ ・ ジェット装置に電源装置の出力線を接続し、次に、出力線を検出する電圧の高電圧プローブの先端を接続します。出力電圧の情報を記録するオシロ スコープに高電圧プローブのもう一方の端を接続します。回路全体をチェックし、電源、オシロ スコープ、および高電圧プローブは、すべて接地かどうかを確認します。
  2. ガスを確認します。ガス管がプラズマ ジェット デバイスに接続されていることを確認します。ヘリウム (体積、99.999%) や酸素 (体積、99.999%) のガスの元栓を開くし、ガスの流れを 1 L:0.01 L/min (彼: O2) に設定します。
    注意: は、初めて電源をオンする前に数分間のガスの流れをさせてください。
  3. 設定パルス振幅、周波数、パルス幅、8 kV、8 kHz と 1600 ns それぞれ。回路をもう一度確認し、プラズマ ジェットを作成する出力ボタンを入れます。
    注意: いつでも高圧線を触れないでください。

4. 神経幹細胞のプラズマ

  1. 注射器のノズルと 15 mm セルよく穴の間の距離を設定します。
    注: 距離 12 ウェルのプレートが配置されているプラットフォームの一番下から測定されます。
  2. インキュベーター外 12 ウェル プレート、predifferentiated 細胞の中を新鮮な分化培地の 800 μ L に変更します。
  3. セルを 3 つのグループに分割: コントロール群、60 s 彼 O2 (1%) ガス流れ治療グループ、および 60 s プラズマ治療群。
    注: 処理条件の下で明白な液体の損失はありません。
  4. プラズマ ジェットの下 12 ウェル プレートを置き、シリンジ ノズルは各穴の中心に固定されていることを確認、手順 4.3 に記載されている別のグループに関連する治療を与えます。
    注: 未処理のコントロールは、均一処理条件を確保するのに実験中に分化培地で室温で保管されました。彼と O2 (1%) ガス流れ治療群を施しただけ彼と O2 (1%) ガス流れ、プラズマを生成しません。すべての治療は、3 通実行必要があります。

5. 神経幹細胞分化

  1. 治療後、独自の文化を削除し、各ウェルに新しい分化培地 1 mL を追加します。
  2. セル 6 の 37 ° C、5% CO2でインキュベーターで孵化させなさい d. 変更媒体、その他の毎日。
  3. 倒立位相差顕微鏡下での毎日のさまざまなグループの分化状態を確認します。ランダムに少なくとも 12 のフィールドを選択し、形態学的変化を記録する写真を撮る。

6. 蛍光抗体染色

  1. 洗浄
    1. セル インキュベーターからサンプルを取るし、吸引により培地を削除します。リンスの細胞 1 1 ml の PBS の x。
      注: 後、分化細胞は簡単に戸建します。セル洗浄を避けるために文化井戸の側から PBS を追加する必要があります。
  2. 固定
    1. 室温で 20 分間 4% パラホルムアルデヒドの 500 μ L でセルを修正します。固定後、軽くリンスの細胞 3 x 1 mL の PBS、5 分ごとに、残留の 4% パラホルムアルデヒドを削除するとします。
      注: セルの種類に応じてセル固定のため最適な時間ポイントを決定する必要があります。固定後、文化井戸の側から 1 mL の PBS を追加し、5 分のテーブルにサンプルを残します。細胞の損失を最低限確保するためラボ シェーカーを使用しないでください。
  3. 透過
    1. 0.2% のサンプルを permeabilize PBS で室温で 10 分間の TritonX 100。透過後、3 回、各 5 分の 1 mL の PBS で軽く細胞をすすいでください。
      注: セルの種類に応じてセル透過性最適な時間ポイントを決定する必要があります。透過後、5 分のテーブルにサンプルを残す文化井戸の側から 1 mL の PBS を追加します。細胞の損失を最小限にして研究室のシェーカーを使用しないでください。
  4. ブロック
    1. 各サンプルを PBS で 10% ヤギ血清 1 mL を追加し、任意の非特異的な相互作用をブロックする 1 h のテーブルの上、サンプルを残してください。
      注: セルがスライドからデタッチすることを防ぐためにラボ シェーカーを使用しないでください。リンスは、この手順で必要ではありません。
  5. 一次抗体の孵化
    1. 一次抗体希釈バッファーを使用して一次抗体を希釈します。
      注: 最適な結果を得るには、一次抗体の最終希釈倍率は事前によって決定する必要があります。抗ネスチン (未分化幹細胞) のための希釈比率 (のコリン作動性ニューロン)、反チャット対策-LHX3 (運動ニューロン) の (反 GABA (成熟したニューロン) の反 NF200、(オリゴデンドロ サイト) の反 O4 抗 β-チューブリン III (ニューロン)Gaba 作動性ニューロン) (セロトニン ニューロン) の抗セロトニンとドーパミン作動性ニューロン) 用アンチ TH、1/80、1: 200、1: 100、1: 100、1: 100, 1: 200、1: 100、1: 200、および 1: 100、それぞれ。
    2. 希釈した一次抗体の 300 μ L を別のサンプルに適用します。
    3. 4 ° C で一晩細胞サンプルをインキュベートします。
      注: 背景と非特異的染色を減らすための 4 ° C で一次抗体の孵化することをお勧めします。
    4. 一次抗体を外し、優しくリンスの細胞 3 1 ml の PBS の x。
  6. 二次抗体の孵化
    1. PBS で 3% ヤギ血清を使用して、Cy3 標識または Alexa Fluor 488 共役二次抗体を希釈します。
      注: 最適な結果を得るには、二次抗体の最終希釈倍率は事前によって決定する必要があります。
    2. 各一次抗体を検出する関連する二次抗体の 300 μ L を適用します。
      注: 以降のすべての手順は、蛍光消光を防ぐために暗闇の中で実行する必要があります。
    3. 室温で 2 時間暗闇の中でセルのサンプルをインキュベートします。
    4. 二次抗体を削除し、室温で 10 分の 1 mL の PBS で軽く細胞をすすいでください。
  7. 染色性が核
    1. 500 μ L の細胞サンプルを没頭するヘキスト 33258 作業ソリューションを適用します。
    2. ラベルを核に室温で 8 分間暗闇の中でセルのサンプルをインキュベートします。
    3. 3 セルを優しくすすぎ 1 mL の PBS、10 分ずつ、x は、光から保護します。
      注: セルの最小の損失の最適な洗浄条件する必要があります経験的に決定。
  8. 取付
    1. Microslide のセンターにメディアをマウントの一滴を配置します。
    2. ピンセットを使用して (サンプル) と coverslips を取り出すし、慎重にメディアをマウントの上にサンプルを配置します。空気の泡を避けるため。
    3. 吸水紙でメディアを任意余分なマウントを削除します。
  9. 蛍光顕微鏡観察
    1. ヘキスト 33258、Alexa Fluor 488、Cy3 用のフィルターを装備する蛍光顕微鏡下で試料を観察します。各サンプルはランダムに少なくとも 8 12 フィールドおよびレコードの画像カメラを選択に。

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結果

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毎日キャップ治療後倒立顕微鏡下で細胞の形態を認めた。図 2は、両方の細胞において細胞分化の普通の倒立位相差顕微鏡画像を示します。プラズマ処理によるグループ展示加速分化率とコントロールとガス流のグループに高分化比。

C17.2 NSCs と初代ラット NSCs 6 d 培養治療はそれぞれ図 3と 図 4に示すように後の蛍光の結果。ネスチン (+、グリーン) 減少、β-チューブリン III (+、赤) が有意に増加し、, O4 (+ 緑) でわずかに増加した両方の細胞の制御グループと比較して線。60 のキャップ トリートメント s は効果的に制御グループとガス流れ治療群と比較して...

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ディスカッション

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C17.2 NSCs は一種10,11のスナイダーと他の人によって開発された新生児マウス小脳顆粒層細胞の不死化神経幹細胞ラインの。C17.2 NSCs は神経細胞やアストロ サイト、オリゴデンドロ サイトに分化することができ、神経科学12で広く使用されています。以前の研究では、キャップは C17.2 NSCs のニューロンへの分化を高めることができます。原理の実証研究も使用して実施された初代ラット NSCs と初代ラット NSCs プラズマ照射の効果が強い神経細胞分化と C17.2-NSCs と定性的に一致します。キャップ、物理化学的技術は、アルツハイマー病、PD、脊髄損傷などの神経疾患治療の有望なツールを表すかもしれない。

キャップ治療 C17.2 NSC とラット初代 NSC 分化培養短い治療時間とほとんどの細胞損傷を高めるワンステップ方法を提供しています。また、結果は 〜 75% 監督クリニック...

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開示事項

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著者が明らかに何もありません。

謝辞

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この作品は、華中学者プログラム、華中大学の科学・技術 (第 2018KFYYXJJ071)、中国の国家自然科学基金 (31501099, 51707012 番) の独立した技術革新基金によって支えられました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
カバースリップNEST801008
Poly-D-lysineBeyotimeP0128
DMEM中HyCloneSH30022.01B4 °C;C
DMEM/F12 培地HyCloneSH30023.01B4°C;C
N2サプリメントGibco17502048-20°Cで保存されます。Cと光から保護する
B27サプリメントGibco17504044-20°Cで保管されています。Cおよび軽い
シ胎児の血清HyCloneSH30084.03-20 >C、
ドナー馬血清HyCloneSH30074.03-20°Cで凍結および解凍を繰り返すのを避けてください。C、
ペニシリン/ストレプトマイシンHyCloneSV30010。C
トリプシンHyCloneは4 °C で保存25300054。C
PBS溶液HyCloneSH30256.01B4°Cで保存されています。C
4% パラホルムアルデヒドBeyotimeP0098-20 °C で保存されています。C
TritonX-100SigmaT8787
Normal Goat Serum Blocking SolutionVector LaboratoriesS-1000-204 °C;C
アンチネスティンBeyotimeAF2215-20 °C で保管されています。C、凍結と解凍の繰り返しを避ける
抗β;-Tubulin IIISigma AldrichT220020 °で保管;C、凍結と融解の繰り返しを避けて
抗O4R&D SystemsMAB1326-20 ° で保存されます。C、
抗NF200グマ。C、
抗ChATシグマ。C、
反LHX20グマ。C、
抗GABAシグマ。C、
抗セロトニンAbcam、ケンブリッジ、マサチューセッツてください。C、
反THアブカム、ケンブリッジ、マサチューセッツてください。C、
染色一次抗体希釈バッファーBeyotimeP0103。C
Cy3 標識ヤギ抗ウサギ IgGBeyotimeA0516-20 °C で保存されています。Cと光から保護する
Alexa Fluor 488--BeyotimeA0428Cおよび光
から保護するアンチマウスIgG 
12ウェルプレートコーニング3512
25 cm2フラスココーニング430639
ヘキスト33258BeyotimeC1018-20°Cで保管されています。Cと光から保護します
取り付け媒体BeyotimeP012820°で保管されています。Cと光から保護する
光学顕微鏡南京江南小説光学会社XD-202
蛍光顕微鏡ニコン80i
高 – 電圧 パワーアンプ指向性エネルギーPVX-4110
DC電源スペルマンSL1200
ファンクションジェネレータAligent 33521A
オシロスコープTektronix DPO3034
高電圧プローブTektronixP6015A
から保護しなさい ウを 4°Cで保存された凍結と解凍の繰り返しを避けてくださいは は は -、-20°Cで保管されているシの凍結と解凍の繰り返しを避けてください-20°Cで保管されているの凍結と解凍の繰り返しを避けてください-3°Cで保管されているシの凍結と解凍の繰り返しを避けてください-20°Cで保管されているの凍結と解凍の繰り返しを避けてください-20°Cで保管されている州で保管されている抗セロトニンアブカムの繰り返しの凍結と解凍を避け-20°Cで保管されている州で保管されている反THアブカムの繰り返しの凍結と解凍を避け4°Cで保存された免疫の凍結と融解の繰り返しを避けてください は -20°Cで保存されたヤギとラベル付け。は -

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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