肺のマイクロ Rna 発情周期にわたってプロファイリングのオゾン暴露マウスの

マイクロ Rna (Mirna) は短い (19 に 25 のヌクレオチド)、自然発生する、非コーディングの RNA 分子。Mirna のシーケンスは、miRNAs 生理機能¹を調整することの重要性を示唆している種類を渡って節約進化。マイクロ Rna 発現プロファイルは、miRNAs の免疫反応、細胞の分化、発達プロセス、およびアポトーシス²を含め、プロセスの様々 な規制に重要な識別するために有用であると実証されています。最近では、miRNAs は病診断と治療の潜在的な使用のために認識されています。研究者は遺伝子制御のメカニズムを勉強して、miRNA 発現を測定照らすことができます規制プロセスのシステム レベル モデル miRNA 情報は mRNA プロファイリングと他のゲノム スケール データ³を結合したときに特に。その一方で、miRNAs は試料の種類の範囲における Mrna よりも安定にも示されている、蛋白質⁴に比べ高い感度で測定可能なも。これは肺疾患を含む、多様な分子診断アプリケーションのバイオ マーカーとしての miRNAs の開発に大きな関心につながっています。

肺の miRNAs は発達プロセスと恒常性の維持に重要な役割を再生します。また、その異常発現は開発と様々 な肺疾患⁵の進行に関連付けられています。大きいの重症度と予後を示すホルモンと発情周期が環境課題への対応における肺生得免疫と miRNA 発現を調節することが女性の大気汚染による炎症性肺疾患を示しています。⁶。 このプロトコルでは適応免疫の留守中に発生する雌ネズミの肺の炎症の形態を誘導するために大気汚染の主要な成分であるオゾン露出を使用します。オゾンを使用することにより、我々 は気道過敏性の亢進、気道上皮細胞の損傷および好中球の増加や近位気道⁷中の炎症メディエーターに関連付けられて開発に誘引すること。現在、特性評価、オゾン暴露マウスの発情周期にわたって Mirna の解析によく記述されていたプロトコルはないです。

以下は、発情周期の段階および miRNA 発現オゾンにさらされた雌マウスの肺組織を識別する簡単な方法をについて説明します。また計算生物学に重点を置いて、miRNA 検出とターゲット識別に効果的なバイオインフォマティクスのアプローチに取り組みます。我々 は、 limma、遺伝子発現実験⁸からのデータを分析するための統合ソリューションを提供する R/Bioconductor ソフトウェアを用いたマイクロ アレイ データを分析します。Limmaから PCR 配列データの解析アレイ/サンプルの数が少ないを使用して、式を比較するとき t 検定の手続き上力の面で利点があります。MiRNA の式の結果の生物学的文脈を理解するには、私たちは、機能解析ソフトウェアを使用されます。転写の変更を調節するメカニズムを理解するために、可能性が高い結果を予測する、ソフトウェアは miRNA 発現データセットと文献⁹から知識を兼ね備えています。これは、miRNAs のセットを重複で統計の濃縮を探してソフトウェアと比較した場合の利点です。

ここで説明するすべての方法は、制度的動物ケアおよび使用委員会 (IACUC) ペンシルベニア州立大学のによって承認されています。

1。 発情周期の段階の評価

1. C57BL/6 マウス (8-9 週齢) を使用して Machholz ら¹⁰で説明した片手マウス拘束テクニック女性を正しく抑制します。
2. 超純水の 10 μ L の滅菌プラスチック ピペットを入力します。
3. プラスチック ピペットの先端を膣に投入します。
4. 優しくのフラッシュ液体 4 ~ 5 回、サンプルを採取します。
5. ガラス スライド膣分泌液を含む最終的なフラッシュを配置します。
6. 光顕微鏡 20 × 対物で無染色の膣にフラッシュを観察します。
   注:偽妊娠や他の原因のための定期的なサイクルを表示しない動物は、実験から除外する必要があります。周期を確認する少なくとも 3 つの連続したサイクルの膣分泌物毎日を実行することをお勧めします。

2. オゾン暴露

1. アドリブ ワイヤー メッシュ蓋と水で 2 つの 1.2 L のガラス容器で最大 4 マウスを配置します。
2. オゾン室と他のフィルターの空気暴露チャンバー内に 1 つのガラス容器を置きます。
3. 定期的にオゾン濃度が 2 ppm とモニターにオゾン濃度を調整します。
   注:オゾン装置提供規制気流 (> 30 空気変更/h) と制御温度 (25 ° C) と湿度 (50%)。監視され、¹¹を前述のように紫外線オゾン アナライザーと質量流量コント ローラーによって制御、放電オゾナイザによるオゾンが生成されます。
4. 大気暴露のオゾン/フィルターの 3 時間後ガラス容器を削除します。寝具、食糧および水のアドリブでケージに動物を返します。

3. 肺コレクション

1. 4 時間後、麻酔動物、ケタミン ・ キシラジン カクテル (90 mg/kg ケタミン ・ キシラジン 10 mg/kg) の腹腔内注入。
   注:麻酔の適切なレベルを確認するには、チェック マウス ペダルの反射 (しっかりつま先ピンチ) は、必要に応じて麻酔薬を調整します。
2. マウス皮膚の 70% エタノールを湿らせます。
3. 上大静脈を公開する動作のシザーと外科ピンセットを使用して 2 cm 正中切開を行います。
4. 下大静脈と大動脈の断裂によってマウスを犠牲に。必要な場合は、急激に血液を収集する腎静脈上大静脈に 21 G ゲージ針を挿入します。また、心臓穿刺次の標準プロトコルを介して血液を収集します。
5. 外科はさみを使用して、腹腔内を開いてカットし、肌/上筋、肋骨に向かって上に移動を削除します。
6. 横隔膜をパンクに手術用ハサミを使用します。
   注:肺は横隔膜から崩壊します。
7. 手術用ハサミを使用して心臓と肺を公開する胸郭を切り取る。
8. 鉗子を使用して、1.5 mL 遠心チューブの RNase フリーを取るし、管を埋めるため液体窒素で水没します。
   注:ゴーグル ・防護手袋を使用して液体窒素を処理します。
9. 肺を削除、スナップ凍結組織、液体窒素で満たされた、RNase フリー遠心 1.5 mL チューブにそれらを置くし、液体が蒸発するまで数秒待ってから。
10. チューブのふたを閉じ、使用するまで-80 ° C で組織を保存します。

4. RNA の準備

1. ステンレス鋼の組織の粉砕機を使用して全体の肺を粉砕します。
   注:組織の粉砕機は、液体窒素中で使用前に配置する必要があります。RNAse ソリューションで各使用後きれいに粉砕。
2. 微粉の肺を分割し、2 つの 1.5 mL チューブ (半分肺) に配置します。
3. 500 μ L のサンプル チューブあたりためチオシアン酸イ オンを加え、混ぜます。 それぞれ 18 G、21 G、23 G 針を使用して各サンプルをホモジナイズしてください。
   注:サンプルは 10⁸小さな RNA スパイクでコントロール (種) から抽出する前に、部数 x 5.6 でスパイクします。
4. 各サンプルと 15 の渦にエタノール 500 μ L を追加 s。
5. コレクション チューブ、12,000 × gで 1 分間遠心する [スピン] 列に混合物の負荷を流れを破棄します。
6. DNase の私治療 (内の列)。
   1. 12,000 × gで 1 分で 400 μ L の RNA 洗浄バッファーと遠心分離機を追加します。
   2. RNase フリーのチューブでは、追加 5 μ L の DNase 私と 75 μ L の DNA 消化 × 1 バッファーし、ミックスします。列の行列に直接には、ミックスを追加します。
   3. 15 分間室温でインキュベートします。
7. 列と 1 分流れを破棄、12,000 × gで遠心分離する RNA prewash ソリューションの 400 μ L を追加し、この手順を繰り返します。
8. 列に 700 μ L の RNA 洗浄バッファーを追加し、12,000 × gで 1 分間遠心を流れを破棄します。
9. 残りのバッファーを削除する 2 分間 12,000 × gで遠心分離機します。RNase フリーのチューブに列を転送します。
10. RNA を溶出するには、列マトリックスおよび 1.5 分、12,000 × gで遠心分離に直接水の DNase、RNase フリーの 35 μ L を追加します。
11. 総 RNA 濃度を測定 (260 nm) と純度分光光度計を使用しています。1.5 μ L サンプル分注で RNA 定量を実行する指示に従います。楽器が DNase、RNase フリー水溶出用ブランクです。
    注:~2.0 の 260/280 の比率は、RNA の「純粋な」として一般に認められます。典型的な RNA 濃度通常 750 と 2,500 ng/μ L の間の範囲します。
12. -80 ° C でストア

5. miRNA プロファイリング

1. レトロ-議事録使用 200 ng のトータル RNA の Rna。
   1. (反応あたり合計量は 20 μ L) 氷の上逆のトランスクリプション反作用の組合せを準備します。各反応バッファー、ヌクレオチド ミックス 10 x の 2 μ L、逆転写酵素の 2 μ L、RNase フリー水 2 μ L x 5 の 4 μ L を追加します。すべてのコンポーネントと 600 μ L RNAse フリー プラスチック チューブ (反応あたりミックスの 10 μ L) の因数をミックスします。
      注:逆のトランスクリプションのマスターの組合せには、テンプレート RNA を除く最初繊維の cDNA の統合に必要なすべてのコンポーネントが含まれています。
      注:マスター ミックスを準備するときは、余分なボリューム (10%) を計算します。
   2. テンプレート RNA を追加 (200 10 μ L で ng) 逆のトランスクリプションのマスターの組合せを含む各管に。ミックス 15 遠心 1,000 x gで s したちのドライ ブロックを配置するまで氷の上保存します。
   3. 37 ° C で 60 分間インキュベートします。
   4. 95 ° C で 5 分間インキュベートし、氷の上、管を配置します。
   5. 各 20 μ L 逆転写反応に RNase フリーの水の 200 μ L を追加することによって Dna を希釈します。
2. マウス炎症反応や自己免疫の miRNA PCR アレイを用いたリアルタイム PCR を行います。
   1. 反応混合物 (総量 1100 μ L) を準備: 各反作用のため 550 μ L 2 x PCR マスター ミックスの普遍的なプライマー ミックス x 10 の 110 μ L、RNase フリー水 340 μ および cDNA テンプレート (ステップ 5.1.5 から希釈反応) の 340 μ L を追加。
   2. プリインストールされた miRNA マルチ チャンネル pipettor を用いた PCR アレイの各ウェルに反応混合物の 10 μ L を追加します。
   3. MiRNA PCR 配列板光学接着フィルムをシールします。
   4. 1,000 x g気泡を除去するために室温で 1 分のプレートを遠心します。
   5. プログラム リアルタイム サーマルサイクラー、PCR の初期活性化ステップ 95 ° C で 15 分間、15 の 3 ステップ サイクリング含む変性 94 ° c、30 の焼鈍 s 55 ° C、および 30 の拡張子 s 40 70 ° C で s サイクル数。
      注:リアルタイムのサーマルサイクラーを設定する指示を条件に従って製造元のサイクリングします。リアルタイム サーマルサイクラー ソフトウェアに組み込まれた解離曲線のステップを実行します。
   6. データ解析を実行します。

6. データの分析

1. 解析ソフトウェアに各サンプルのリアルタイム PCR ソフトウェアからの Ct 値を抽出します。
   注:34 の Ct 値は、カットオフとして考慮されます。サンプルには、スパイクの制御 (例:, cel-ミール-39) が含まれている場合、は、各サンプルのコントロールのスパイクに Ct 値を正規化します。しきい値の値は、手動で設定する必要があります。基準値は自動的に設定されます。
2. 六つの miRNA ハウスキーピング コントロールの平均 Ct の Ct 値を正規化: SNORD61、SNORD68、SNORD72、SNORD95、SNORD96A、RNU6 2、次の式を使用します。
   ΔCt = (Ct_Target − Ct_housekeeping)
3. 倍の計算を変更、相対式方程式¹²を使用して、コントロールとして特定のサンプルを使用して、ΔΔCt 値を計算します。
   miRNA の相対的な表現:
   2^-∆∆Ct、ここで-∆∆Ct =-[∆Ct テスト - ∆Ct コントロール]
   注:200 のフォールドの変更は、カットオフとして考慮されます。
4. 輸出倍 Bioconductor⁸のlimmaパッケージを使用して R の統計分析を実行する式の値を変更します。
5. Benjamini ホフベルク方法¹³を使用して複数の比較を修正します。
   注: R スクリプトのコピーがで利用できる: http://psilveyra.github.io/silveyralab/。データセットと解析データ番号 GSE111667 の下で遺伝子発現のオムニバスでも https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE111667。

7. データ解析: 解析ソフトウェア

1. データセットを配置します。それぞれ式ログ比と p 値の Mirna が含まれます。特定のデータセットのフォーマットのテーブル 1を参照してください。
2. オープン機能解析ソフトウェア (バージョン 01-10)。
3. 次の形式を使用してデータセットをアップロード: ファイル形式:「柔軟なフォーマット」が含まれている列見出し:「はい」識別子種類を選択:「miRBase (成熟)」、実験用アレイ プラットフォーム: 配列プラットフォームを選択。
   注:ファイル形式が .txt を受け入れ (タブ区切りテキスト ファイル)、.xls (excel ファイル)、および .diff (cuffdiff ファイル)。
4. 「推測の意見」を選択し、、実験グループ ラベルが正しいことを確認します。
5. マップとマップされていない Mirna の合計金額を修正する「データセットの概要」に進みます。
6. 上部の「新規」ボタンをクリックしてプログラムの左。「新しいマイクロ Rna ターゲット フィルター」を選択し、、マイクロ Rna データセットをアップロードします。
   1. ソースに設定: TarBase、創意工夫、専門家の調査結果 miRecords。
   2. 信頼を設定: 実験的観察および高 (予想)。
   3. 生物学的種、疾患、組織、経路などのターゲットについての様々 なを含めるの「列の追加」を選択します。
   4. 実験式は変わったターゲットに焦点を当てる、するを選択"追加/mRNA データセットを交換する」。「ペアリング」の式を使用して、同じまたは別の発現レベルとマイクロ Rna を探します。
      注:フィルター分析はマイクロ Rna の名前と記号、mRNA ターゲット、ターゲット リレーションシップおよび予測関係 (図 2) の信頼区間を示すソースを提供します。
7. 経路キャンバスにフィルター処理されたデータセットを送信しより多くの生物学的関係を調べる「マイ経路を追加する」をクリックします。
8. パス デザイナーを使用すると、マイクロ Rna 効果の出版品質モデルを作成します。
9. 別のオプションは、コア解析を作成します。
   1. コア分析型「発現解析」を選択します。
   2. 計測タイプの「Expr ログ比」を選択します。
   3. 分析フィルターの概要: 分子および関係のみを考慮する、: (種 = マウス) と (自信 = 実験で観測) と (データ ソース =「創意工夫の専門家調査結果」、「創意工夫 ExpertAssist 調査結果」、"miRecords"、"TarBase"、または"TargetScan 人間」)。
   4. P 値のカットオフを選択 = 0.05。
   5. 分析を実行します。
      注:レポートに含まれます: 正規の経路、上流レギュレータ解析、疾患や機能、レギュレータの効果、ネットワーク、分子。

塗抹標本にみられる異なった細胞のタイプは、マウスの発情期 (図 1) を識別するために使用されます。これらは細胞の形態によって識別されます。Proestrus の間に細胞はほとんど専ら丸い形、整形式の有核細胞 (図 1 a) のクラスターです。マウスが発情期にある細胞、角化扁平上皮細胞、高密度クラスター (図 1 b) に存在。Metestrus、中に角化上皮細胞と好中球が見られる (図 1)。白血球 (小さな細胞) は、発情、一般的に多く普及している (図 1)。

我々 は、前述のプロトコルに従う 4 つのマウス肺から RNA を抽出しました。核酸濃度 (ng/μ L) 1197.9 と 1583.1 ± 215 (表 1) の平均で 2178.1 の間であった。A260/A280 比平均は 2.016 ± 0.002 の平均 2.020 に 2.010 から変動。その一方で、観測 A260/A230 比 2.139 と 2.179 ± 0.018 の平均で 2.223 発振。

表 2 R にlimmaで得られた発現結果を示しています。マウス上部の発現 miRNAs オゾンにさらされるまたは (コマンド toptable を使用して) proestrus14の空気をフィルターを計算しました。最初の列は、オゾンと公開されているフィルターの空気動物 miRNA 発現に log2 フォールドの変更を倍の値を与えます。列 t は、中程度の t 統計の比較で各 miRNA の計算を表します。列 p.value と adj.p.value 各比較の関連付けられている p 値複数テスト調整の前後にそれぞれ表します。多重比較のための調整は、虚偽の発見率15を制御する Benjamini、ホフベルクの手法で行われました。列 B を表しますログ オッズは miRNA が特異的にある8を表明しました。

濃縮経路分析を含んでいる miRNA のターゲット フィルターとコア解析を行った。14 miRNAswith 重要な式の対数比の一覧と p 値をアップロードした後、それらのすべては miRNA ターゲット フィルター (表 3) によってマップされています。結果はフィルターされ、「細胞性免疫応答"この場合は、特定経路を取得する並べ替え。コア解析は、正規の経路、疾患と機能、規制当局、およびネットワーク (表 4) についての情報を提供しました。機能解析ソフトウェアは、関心の miRNAs と他の分子 (図 3) との関係を示すネットワーク分析を生成しました。

図 1: 発情周期の段階の識別。(A) Proestrus (主に核上皮細胞);(B) 発情 (主に anucleated 角質細胞);(C) metestrus (セルのすべての 3 種類)。(D) 発情 2 (白血球の大半)。スケールバー = 100 μ m. 倍率 20 倍を =。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

図 2: 機能分析ソフトウェアの代表的な結果: miRNA ターゲット フィルター 。発情サイクルのさまざまな段階での miRNAs の包括的なプロファイル。MiRNA のフィルターを実行した後は、ソフトウェアは、遺伝子および病気およびフィルターと並べ替えこの場合は「細胞性免疫応答」の特定の経路を取得するにすることができます他の表現型に関与する化合物の詳細なリストを提供します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

図 3: 機能分析ソフトウェアの代表的な結果: ネットワーク。発情周期の異なった段階で女性でフィルタ リングされた空気やオゾン暴露の影響を受けるネットワークの比較。Proestrus (A) または (B) 非 proestrus 段階で対オゾン フィルターの空気にさらされる雌マウスの肺の miRNAs に関連付けられている生物学的ネットワークの図。この図は、フエンテスら6から変更されています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

表 1: RNA 濃度と吸光度比 260 と 280 の例 4 つのマウスから精製された肺組織検体から nm 。濃度を分光光度計で測定しました。

表 2:Limmaオゾンにさらされる女性の発現の Mirna の解析結果対. proestrus の段階で空気をフィルタ リングします。

表 3: 複数観測データセット機能解析ソフトウェアをアップロードのための例の書式。複数の差分式を実験の単一のスプレッドシートにグループ化し、アップロード、必要に応じてできるだけ多くの観測を追加ことができることができます。列: 1) miRNAs ID;2) 観察 1: Expr ログ比;3) 観測 1: P 値;4) 観察 2: Expr ログ比;5) 観測 2: P 値です。

表 4: 機能解析ソフトウェアproestrus ステージ対非 proestrus でオゾンにさらされた女性の概要。機能解析ソフトウェアには、トップ正規経路、上流レギュレータ、疾患・機能、上位、レギュレータ効果ネットワークの分析ができます。このテーブルは、フエンテスら6から変更されています。

著者は、彼らは競争の興味があることを宣言します。