全取り付ける染色を用いた 3 D 白色脂肪組織構造の可視化

Summary

現在の研究の焦点は、脂肪組織のアーキテクチャと細胞成分の 3 D イメージングのための理想的な方法として全取り付ける染色と可視化手法を示すことです。

Abstract

脂肪組織は高い可塑性に重要な新陳代謝器官を環境刺激と栄養状態に応答するものです。そのため、脂肪組織の形態学を研究する様々 な技術を開発されています。しかし、従来の可視化方法は、全臓器の 3 D アーキテクチャを取り込みに失敗して 2D 断面の組織を勉強に限定されます。ホール マウントの紹介染色、最小限の処理手順とそのまま脂肪組織形態を維持する免疫組織化学法。したがって、組織の最も代表的な 3 D の可視化を実現する、歪みのない脂肪細胞と他の細胞成分の構造が保持されます。さらに、全取り付ける染色は細胞運命の意思決定を行う系統トレース メソッドと組み合わせることができます。ただし、この手法には、脂肪組織のより深い部分に関する正確な情報を提供することにいくつかの制限があります。この制限を克服するために全取り付ける染色することができますさらと組み合わせる組織を組織の不透明を外しライト シート蛍光顕微鏡を用いた全体脂肪組織解剖学の完全な可視化を可能にする技術をクリアします。したがって、高解像度、脂肪組織構造のより正確な表現は、これらの技術の組み合わせでキャプチャできます。

Introduction

脂肪組織は、エネルギー貯蔵のための不可欠な臓器で動的リモデリングとほぼ無制限の拡張¹によって特徴付けられます。エネルギー恒常性脂肪組織もその以上 50 アディポカイン²全身の代謝機能を調節するためのホルモン分泌に重要な役割を果たしています。脂肪組織は成熟脂肪細胞、線維芽細胞、血管内皮細胞、免疫細胞、脂肪細胞の前駆細胞の³を含む様々 な細胞タイプの多様なアーキテクチャ構成します。最近の研究は、肥満やその他の代謝異常大幅変更できます脂肪組織の機能とその微小環境が含まれていますが、脂肪細胞、炎症細胞浸潤の拡大に制限されていませんを示した (などマクロファージ)、および血管機能障害³。

組織学などセクショニング従来の形態学的手法を示す組織収縮と構造歪み^{3につながることができます長い化学処理手順など脂肪の生物学の勉強にいくつかの制限 4}。また、これらの 2 D 技術は得られたセクションは全体組織³の小さな地域に限られている異なったセルタイプによって出される細胞間の相互作用を観察するのに十分ではありません。蛍光イメージングの方法を従来のに比べて、全取り付ける染色手順は必要ありません追加侵襲、埋め込み、断面、脱水; などこのように、抗体の特異性の減少という問題を避けることができます。そのため、イメージング脂肪組織は、脂肪細胞の形態と全体的な脂肪組織構造⁵のより良い保全のためシンプルかつ効率的な方法です。したがって、全取り付ける染色迅速かつ安価な反応技術は脂肪組織 3 D アーキテクチャ^1,6,7、8を維持するために確立されました。

ただし、全取り付ける染色の使用による脂肪組織形態の保存、にもかかわらずこの手法はまだ組織の脂質の表面の下に内部構造を可視化することができます。いくつかの最近の研究の^9,10は、組織の脂肪組織内にある包括的な 3 D 可視化のためには全体マウント反応^1,6と組み合わせる技術をクリアを確立しています。特に、神経・血管の密なネットワークは、最近研究^9,10、11,12 3 D ボリューム イメージングと, 可視化されました。確かに、さまざまな生理学的な条件の下の脂肪組織の神経・血管の可塑性を勉強してその生物を勉強する不可欠です。溶媒消去器官 (iDISCO +) 組織の清算の反応が有効な三次元画像は、反応、メタノールの前処理から成る有機化学試薬ジクロロ メタン (DCM で組織の不透明のクリア プロセス) ジベンジル エーテル (DBE)^13,14。完全透明に脂肪組織することによって血管や神経繊維など組織内の解剖学のより正確な表現の^9,10が入手できます。IDISCO + 各種抗体、蛍光レポーター^11,14と互換性がある、それは複数の臓器とも embryoes¹⁴の成功を示しているという点で利点があります。しかし、その主な制限は長い培養時間、18 〜 20 日が実験全体を完了する必要があります。

他の重要なアプリケーションを全取り付ける染色リネージュ トレース システムとの組み合わせで細胞の運命の視覚化であります。トレースする血統は、すべて娘細胞に渡されることができます、時間¹⁵以上保存されているセル内の特定の遺伝子/マーカーのラベルです。そのため、¹⁵セルの子孫の運命を決定するために使用することができます強力なツールです。さらに, 組換えシステム、1990 年代からリビングでトレースする血統の強力な手法となっています生物¹⁵。DNA シュプリンガー酵素 Cre を表すマウス行目は, 停止, シーケンスに隣接している記者を表現する別のマウス線と交差されたとき、レポーター蛋白質は表明した¹⁵です。

全取り付ける染色、蛍光多色記者の使用は¹⁶脂肪細胞の細胞内の活動に干渉を最小限にできるため、脂肪組織のイメージングに適しています。ただし、伝統的な記者は通常細胞質コンテンツ¹⁷が限られている白色脂肪細胞の系統を追跡は困難、細胞質を染色します。この問題を克服するために、膜結合型蛍光 tdTomato/膜 eGFP (mT/mG) 記者マーカーの使用は理想的なツールです。膜をターゲットとした tdTomato は、Cre 負セル¹⁸で表されます。Cre 切除時に膜ターゲット eGFP の発現への切り替えが発生する脂肪細胞の前駆細胞の^17,18 (補足図 1) の系譜をたどり、この記者を適してします。

本稿の目的は、全取り付ける染色の詳細なプロトコルを提供し、開発や脂肪組織の生理学を勉強する他の技術との混合方法を表示することです。このプロトコルで記述されているアプリケーションの 2 つの例は、1) 多色レポーター マウスの脂肪細胞と白色脂肪組織 (WAT) で神経の分枝の詳細に視覚化するクリア 2) 組織の様々 な起源を識別する行とその使用です。

Protocol

すべての実験動物のプロトコルは、Phenogenomics (TCP) は、動物のケアに関するカナダの評議会の基準に適合のためのセンターの動物ケア委員会によって承認されました。マウスが 12 時間の明暗サイクルで維持され、水や食料を無料で提供します。7 月古い c57bl/6 j マウスは全取り付ける染色実験で使用されました。

注: セクション 1 に 2 は、セクション 3 セクション 1 の直後に省略をされているとの順です。セクション 4 は、脂肪細胞サイズと血管密度の分析セクション 2 の完了後に実行できます。

1. 材料の作製と組織分離

1. 新鮮な 1% パラホルムアルデヒド (PFA) リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) ティッシュの固定 × 1 で希釈を準備します。1x PBS で希釈した 0.3% 非イオン性界面活性剤の準備 (PBS といいます-0.3T) 手順を洗浄後の組織のため。
   注: 各組織の準備約 1.5 mL の 1 %pfa 完全な浸漬を確保するため。固定ボリュームを増加または組織のサイズによって減少した可能性があります。
   注意: この手順は、PFA は腐食性、有毒、有害です。摩耗個人保護用具 (例えば、ニトリル手袋、白衣、履物、安全ゴーグル) および発煙のフード ハンドル。
2. (例えば、頚部転位または二酸化炭素窒息) 承認された手順に従って動物を安楽死させます。遅滞なく、必要な脂肪組織 (例えば、鼠径の白色脂肪組織または perigonadal 白色脂肪組織) の倉庫¹⁸を解剖します。
3. 解剖はさみ部分約 0.5-1 cm サイズに 100 × 15 mm²シャーレに組織をカットし、1% 遠心管に浸って PFA。氷の上を保ちます。

2. マウント全体は白色脂肪組織の染色

1. 郭清が完了したら後は、1% で組織サンプルを移動 1 時間室温 (RT) し、組織を早く洗浄用 12-24 も細胞培養プレートに転送する氷から PFA。
2. PBS で組織を洗う-0.3T 速度毎分 20-25 傾斜 22 ° 傾けるシェーカーで RT の各 5 分の 3 回。
   メモ: は、シェーカーの使用を含むすべての後続の手順にこの傾斜とスピードを使用します。
   注: 多色レポーター マウス線 mT/mG などと追加を使用して抗体の汚損は必要ありません、手順 2.2 の後ティッシュが顕微鏡の準備ができて。
3. 追加 0.5-1 mL ブロック バッファー (PBS で希釈した 5% 動物の血清-0.3T)。シェーカーにプレートを置いて、右で 1 時間インキュベート
4. ブロッキング液を吸引し、PBS で希釈した一次抗体を追加-1% 動物血清 0.3T。
5. 一晩で 4 ° C でシェーカーのプレートの場所。
6. 次の日、PBS で組織を洗う-0.3T 5 の 3 回分それぞれの RT。
7. PBS で希釈した適切な二次抗体を使用して-0.3T。0.5 – 1 を追加各ウェルに mL 二次抗体ソリューション。プレートをアルミホイルで包んで、それをシェーカーで 1 時間インキュベート室温
   注: は、退色を防ぐために暗闇の中で二次抗体を希釈します。
8. 二次抗体の孵化後、PBS で洗浄-中性脂質汚れが必要ない場合は、ルートの各 5 分の 2 回 0.3T 画像サンプル。脂質小滴の可視化がある場合 5 分間 2 回、(非イオン性界面活性剤) なし 1x PBS で洗浄汚れ中性脂質を使用して必要な。
9. 洗浄のステップ後右の 30 分の 1 × PBS の 1:1500 の希釈倍率で希釈した中性脂質汚れと孵化組織は、顕微鏡検査のために準備が整いました。将来のイメージングのため組織を 4 ° C でこのソリューションに格納できます。
   注: 画像の画質何度低下します。したがって、イメージングのための最高の時間は 1 または 2 日以内です。
10. 鉗子を使用すると、24 × 60 mm ² ガラス基板のフラット組織を置くし、逆の共焦点レーザー顕微鏡システムの上に置きます。
11. DAPI と核の染色が必要な場合は、完全に組織が水没し、乾燥からそれを防ぐために DAPI を含むメディアをマウント 1-2 滴を追加します。
12. 全取り付ける複数の焦点面で組織をステンド グラスのイメージを得るためには、適切な倍率で 4-6 μ m ステップ サイズと深さで 100-150 μ m の Z スタックを実行します。

3. 組織の清算・反応を使用して iDISCO +

注: このプロトコルは、以前公開された手順^9,10,19に基づいています。

1. 固定・ メタノール前処理
   1. 4 %pfa が一晩 2 mL の遠心管に 4 ° C で 1 × PBS で希釈した組織を孵化させなさい。
      注: は、イメージングまですべての次の治療のため 2 mL チューブに組織を残します。
   2. 次の日、洗って 1x PBS で組織 3 回、室温シェーカーで各 1 時間
      注: この手順は、RT または 4 ° C で一晩サンプルを残して一時停止ポイントをすることができます。
   3. 1 時間後、20%、40%、60%、80% メタノールで RT で組織を脱水します。1 時間常温 100% メタノールの脱水し、新鮮な 100% メタノールに組織を転送、4 C 1 時間インキュベートします。
      注: は、メタノール蒸留水で希釈します。メタノール、インキュベーション中に組織サンプルが没頭している限り、シェーカーでサンプルを配置する必要はありません。
      注意: この手順は、メタノールは有毒、有害です。火気に引火性の高いです。個人保護具 (例えば、ニトリル手袋、白衣、安全ゴーグル) を着用し、発煙のフードで処理します。可燃性安全キャビネット、点火からメタノールを格納します。
   4. 4 ° C で 5% 過酸化水素 (H₂O₂; 30% H₂O₂ 5 量 100% メタノールで希釈した 1 巻) と組織を一晩漂白剤します。
      注意: 30% 過酸化水素は皮膚と眼との接触時に非常に危険です。個人保護具 (例えば、ニトリル手袋、白衣、安全ゴーグル) を着用し、発煙のフードで処理します。
   5. 1 時間で 80%、60%、40%、20% メタノールおよび 1x PBS、RT で組織をその後、水分補給します。
   6. 0.2% 室温シェーカーで 1 時間 2 回、1x PBS で希釈した非イオン性界面活性剤で洗う
2. 反応
   注: 各手順ですぐに反応が始まると、清算が完了するまで、組織の酸化を防ぐために使用するソリューションとチューブの先頭に組織を含む 2 mL 管いっぱい。
   1. 2 日間の 1x PBS、0.2% 非イオン界面活性剤、20% ジメチルスルホキシド (DMSO)、培養の卓上軌道シェーカーで 37 ° C で 0.3 M のグリシンのソリューションにそれらをインキュベートし組織を permeabilize します。
      注: 37 ° C 透過ステップの最大潜伏時間は 2 日です。
   2. 2 日間、PBS、0.2% 非イオン界面活性剤、10 %dmso、5% ロバ血清、培養の卓上軌道シェーカーで 37 ° C で 1 %fc ブロック × 1 のソリューションで組織をブロックします。
      注: ブロックのステップの最大潜伏時間は 2 日です。
   3. 0.2% ポリソルベート 20、1 × PBS のソリューションへの関心の一次抗体の組織をインキュベート 10 μ g/mL のヘパリンや DMSO を 5%、4 日間培養卓上軌道シェーカーで 37 ° C で 5% ロバ血清。
   4. 1 × PBS、0.2% ポリソルベート 20 と RT 5 回 1 h ごとにシェーカーに 10 μ g/mL のヘパリンで洗ってください。
      注: この手順は、右のサンプルを一晩置いておく一時停止ポイントをすることができます。
   5. 0.2% ポリソルベート 20、1 × PBS 溶液で二次抗体と組織を孵化させなさい、10 μ g/mL のヘパリンと 4 日間の卓上軌道シェーカーで 37 ° C で 5% ロバ血清。
      注: 3.2.5 の手順ですべてのサンプルの二次抗体の退色を防ぐためにアルミホイルでラップする必要があります。
   6. 2 h の 5 回、1 × PBS、0.2% ポリソルベート 20 と RT のシェーカーに 10 μ g/mL のヘパリンのソリューションで組織を洗ってください。
      注: この手順は、一晩室温サンプルを残して一時停止ポイントをすることができます。
3. 組織の白色脂肪組織のボリューム イメージングをクリア
   1. 20%、40%、60%、80% メタノール、その後、室温 1 時間ごとに培養で 2 mL チューブに含まれる組織を脱水します。その後、室温 2 度 100% メタノールでサンプルを脱水します。
      注: この手順は、一晩室温 100% メタノールにあなたのサンプルを残して一時停止ポイントをすることができます。
   2. シェーカーで RT で 3 h のメタノールの 1 ボリュームに DCM の 2 つの容積の混合物と組織を孵化させなさい。
      注: DCM は揮発性です。チューブが蒸発しないように密閉していることを確認します。
      注意: この手順は危険です。DCM は吸入によって有毒であります。長期暴露化学火傷を引き起こす可能性が可能性があります。個人保護具 (例えば、ニトリル手袋、白衣、履物、安全ゴーグル) を着用します。ヒューム フードを使用します。
   3. 室温シェーカーで 15 分の 2 回、100 %dcm で組織を孵化させなさい
   4. 100% 孵化 DBE RT イメージングまで、見本品の保管のために。画像の前にソリューションをミックスする数回チューブを反転します。
      注: 完全にクリア失敗した組織になることができます、酸化を防ぐために DBE で管を記入します。DBE 潜伏中にチューブを振るか。
      注意: この手順は危険です。DBE は有毒であります。目や肌への刺激があります。個人保護具 (例えば、ニトリル手袋、白衣、安全ゴーグル) を着用し、発煙のフードで処理します。
   5. 有機溶剤 DBE の屈折に一致する光学顕微鏡と全体の組織サンプルをイメージします。必要な倍率で全体組織のステップ サイズ Z スタッキングを実行します。

4. 全体マウントからデータ解析例染色 ImageJ を用いた組織画像

注: は、ダウンロードとインストールの手順については https://imageJ.nih.gov/ij/download.html を参照してください。

1. 血管密度 (補助図 2) の定量化
   1. ImageJ に血管免疫染色チャネルのみの画像を保存をインポートします。
      注: 定量化のため画像は染色の手順と画像取得条件の面で一貫したはずです。同じ試薬を使用する必要があります。露光時間、強度と倍率もありますイメージング プロセス²⁰に相当。
   2. 血管密度定量化のための白黒画像の色に変換します。「イメージ」タブでは、その、 "色のしきい値"オプションでは、 「自動調整」コマンドを選択します。「しきい値カラー」ボックスを表示、"暗い背景"²⁰し"B & W"の下で「しきい値の色」を選択します。
   3. 背景に対して血管信号の領域の割合を測定するには、 「分析粒子」コマンドでは、 「分析」タブを選択します。「分析粒子」の表示、[ 「明確な結果」と「集計の方法」オプションを選択します。「OK」をクリックします。
   4. コピーして、[概要] タブの下の領域の割合の値を分析用にスプレッドシートに貼り付けます。エリアのパーセンテージは血管密度のことを示します。各イメージの 4.3.1–4.3.4 の手順を繰り返します。
2. 脂肪細胞サイズ²¹ (補助図 3) の定量化
   1. ImageJ に脂肪細胞の保存した画像をインポートします。
   2. イメージのスケールを設定すると、直線の選択ツールを使用してイメージ上の既知の距離をスケールにラインをトレースしてピクセル単位でスケールの長さを測定します。「分析」タブの下には、 「スケールを設定」コマンドを選択します。前にトレースしたラインの距離はピクセル単位で自動的に計算されます。
   3. 「スケールを設定」表示ボックスが表示されます。既知の距離と長さの単位を入力します。尺度のすべてのインポートしたイメージの設定を適用し、 「OK」をクリックして「グローバル」を選択します。
   4. 選択するには、領域の「分析」タブの下の測定法としては「測定の設定」コマンドを選択します。測定のさまざまなオプションの一覧が表示されます。「エリア」オプションを選択し、 「OK」をクリックします。
   5. フリーハンド選択ツールを使用すると、関心の各脂肪細胞の境界をトレースします。「分析」タブの下「測定 (Ctrl + M)」コマンドを選択して、脂肪細胞の領域が表示されます。イメージの他の脂肪のためには、この手順を繰り返します。
      注: 測定精度を確保するには、定量化のため複数の画像を使用します。
   6. さらにデータ分析用にスプレッドシートに領域測定をコピペ。

Results

脂肪組織の脆弱性によるメソッド処理の複数のステップを含むおよび区分および脂肪組織形態³ (図 1 a) の外観を損なう可能性があります。ただし、全取り付ける染色結果 (図 1 b) の正確な解釈を確保する脂肪細胞の形態を保持できます。

脂肪組織の過剰固定は定着剤誘起蛍光につながります。図 2 aに示すとおり、チロシンヒドロキシラーゼ (TH) および PECAM 1 信号のため緑と赤のチャンネルはそれぞれ、PFA で 3 日間の固定過剰のため発生したその蛍光を示す組織の同一領域に重なります。対照的に、図 2 bは全体マウント PECAM 1 信号を基準にしてさまざまな分野で TH の汚損のため信号が発生すると、適切な固定が実行されるときを染色、この信号が蛍光ではないことを示す代表的な画像を示していて...

Discussion

組織学や cryosection など従来の技術は、細胞内構造観察のための利点を提供して、全取り付ける染色細胞の 3次元可視化を可能にする脂肪組織研究の別の視点を提供します最低限の処理組織のアーキテクチャです。

全取り付ける染色を正常に実行するために次の提案を考慮します。拠点別の脂肪組織は様々 な免疫染色結果をもたらすことができます。したがって、脂肪組織ターミナルが使用の種類をまず決定する必要があります。例えば、褐色脂肪組織 (BAT) はより小さく、多房性脂肪²¹による白色脂肪組織 (WAT) を基準にして密度の高い。バットのこの高密度組織を透過する抗体の困難になります。さらに、脂肪組織のサイズも不可欠です適切な抗体の汚損のため大型・厚すぎる組織でも十分な抗体の浸透、ので。したがって、動物の解剖時に脂肪組織を取得するとき perigonadal の脂肪質のティッシュの遠位部分使用してください、薄領域であり十分な抗体の浸透および一貫性のあるデータを許可することができますので。また、密度の高い組織のこれは十分な抗体の浸透の問題を回避でき...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
LipidTox	Life Technologies	H34477
PECAM-1 一次抗体	Millipore	MAB1398Z(CH)
TH (チロシンヒドロキシラーゼ) 一次抗体	Millipore	AB152, AB1542
DAPI stain	BD Pharmingen	564907
Nikon A1R 共焦点顕微鏡	Nikon		共焦点顕微鏡
超顕微鏡 I	LaVision BioTec		ライトシート画像 蛍光顕微鏡
Alexa Fluor 二次抗体	Jackson ImmunoResearch		波長 488、594、647 使用
精製ラット 抗マウス CD16/CD32	BioSciences	553141
ジクロロメタン	Sigma-Aldrich	270997
ジベンジルエーテル	Sigma-Aldrich	33630
メタノール	フィッシャーケミカル	A452-1
30%過酸化水素	バイオベーシックカナダ株式会社	HC4060
ジメチルスルホキシド(DMSO)	Sigma-Aldrich	D2650
シン	Sigma-Aldrich	J7126
パリン	Sigma-Aldrich	H3393
レクチンキットI、フルオレセインラベル付き	VECTOR LABORATORIES	FLK-2100
F4/80	Bio-Rad	MCA497GA
VECTASHIELD ハードセット封入剤 DAPI	VECTOR LABORATORIES	H-1500
パラホルムアルデヒド (PFA)
リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)
Triton-X
Tween
動物血清(ヤギ、ロバ)