補体成分C1qは、細胞外マトリックスと相互作用しうる組織微小環境において高度に発現する炎症性分子である。ここでは、ヒアルロン酸に結合したC1qが細胞接着にどのように影響するかを試験する方法について述述する。
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方法論記事
細胞接着促進における補体タンパク質C1qとヒアルロン酸間の相互作用の評価
* These authors contributed equally
この記事について
サマリー
要約
腫瘍微小環境が新生物の成長および転移に積極的な役割を果たしていることをますます実証されている。異なる経路を通じて、腫瘍細胞は刺激因子、ケモカインおよびサイトカインを分泌することにより、間質細胞、免疫細胞および内皮細胞を効率的に募集することができる。次に、これらの細胞は、高い増殖および転移能力を維持するために、成長促進シグナル、代謝産物および細胞外マトリックス成分を放出することにより、微小環境のシグナル伝達特性を変化させることができる。この文脈において、我々は、ヒト悪性腫瘍の範囲によって局所的に高く発現する補体成分C1qが、細胞外マトリックスヒアルロン酸と相互作用した場合、ヒト腫瘍から単離された原発細胞の挙動に強く影響を及ぼすことを同定する。標本。ここでは、ヒアルロン酸(HA)に結合したC1qが腫瘍細胞接着にどのように影響するかを調べ、細胞外マトリックスの主要成分(この場合はHA)の生物学的特性が腫瘍に対する生理活性シグナルによって形成できるという事実を基礎とする方法を説明する。進行。
概要
腫瘍微小環境(TME)は、細胞の生存、増殖および侵入に寛容なニッチを提供することができるので、癌の発達および進行に影響を与える。TMEにおける新しい主要なプレーヤーの同定は、標的治療のための新しい分子ツールの発見に役立つ可能性がある。TMEは、内皮細胞、線維芽細胞および免疫系の細胞などの非悪性細胞の複雑かつ動的なネットワークを含み、コラーゲン、ラミニン、フィブロネクチンを含む周囲の細胞外マトリックス(ECM)成分に埋め込まれ、プロテオグリカンとヒアルロナン。腫瘍細胞と非腫瘍細胞の両方が、サイトカイン、ケモカイン、成長因子および炎症およびマトリックスリモデリング酵素と共にECM成分を合成し、分泌し、TMEの物理的、化学的およびシグナル伝達特性を全体的に変化させます。これらの成分の中で、ヒアルロン酸(HA)は腫瘍生物学において重要な役割を果たすために出現した。その単純な化学組成にもかかわらず、HAは、そのHA結合分子(ヒャラデリン)と共に、血管新生、免疫系応答性およびECMリモデリングを大きさおよび濃度依存的な方法1で調節することができる。
補体(C)システムは、最近注目を集めているローカルTMEの一部でもあります。C系は、非自己細胞、不要な宿主要素および病原体に対する防御の第一行に関与する可溶性および膜結合タンパク質のセットを包含する。機能的には、Cは、直接細胞死または炎症反応2の取り付けを促進するために、先天的および適応系の2エ....
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プロトコル
患者からの組織サンプルは、イタリアのトリエステ大学病院の機関委員会による倫理的配慮の承認を受けた後、インフォームドコンセントの後に収集されました。
1. 腫瘍細胞の単離と培養(1日目)
- MPM固体標本からヒト中皮腫細胞を単離する。約2-3mm2の断片をカッターで細かくミンチし、ハンクスのバランス塩溶液(HBSS)で構成された消化溶液の5mLでインキュベートし、0.5mM Ca2+/Mg 2+、0.5%トリプシンおよび50 μg/mLを補充DNase I,4°Cで一晩。
- 腫瘍細胞の単離と培養(2日目)
- 一晩インキュベーションした後、消化した組織を37°Cのインキュベーターに30分間入れ、穏やかな揺れを起こす。
- 遠心分離(250 x g)時の消化液を3mg/mLコラゲナーゼタイプ1をHBSSで中5mLに溶解し、さらに37°Cで30分間インキュベートします。
- 10%の熱不活性化胎児ウシ血清(FBS)を加えることによって酵素反応をブロックする。5 mLピペで細胞を非常に慎重に再中断し、細胞のほとんどが組織から放出されることを確認します。次に、100 μmの細孔フィルターを通してセル懸濁液を濾過する。
- 12.5 cm2フラスコで細胞を播種し、ヒト内皮細胞無血清培....
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結果
HAは、繰り返し(β,1-4)-D-グルクロン酸−(β,1-3)-N-アセチル-D-グルコサミン二糖単位(図1B)7を繰り返すことで構成される負の帯電高分子量多糖類である。96ウェルプレート上のHAの結合の発生およびその固定化の効率は、ビオチン化HA(バイオHA)を利用して試験した。10μg/mLから1mg/mLまでのバイオHAの異なる濃度を、100mM炭酸塩/重炭酸塩バッファーpH9.6で再懸濁し、4°Cで一晩インキュベートした。
広範な洗い流しの後、96ウェルプレートに結合したバイオHAをアルカリホスファターゼに結合したストレプトアビジンを用いて検出し、ストレプトアビジンの存在はpNPP(1mg/mL)を基質として定量した。読み取りは、ELISAリーダーを用いて405nmの波長で行った。Bio-HAは、用量応答方式で96ウェルプレートに結合す.......
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ディスカッション
ヒアルロン酸と相互作用する補体成分C1qが、ヒト腫瘍組織から単離された原発細胞の挙動を調節する方法を調べるための簡単な方法を説明する。HAおよびC1qは両方とも生理学的および病理学的条件下で組織微小環境に豊富に存在し、いくつかの細胞生物学的プロセスに関与する。例えば、C1qは胎盤の微小環境に存在することが示されており、胎盤8の間に母性決定権の外陰性栄養芽細胞侵行を支持する。C1qはまた、組織再生および修復10に必要な血管遺伝学的プロセスを促進する創傷治癒皮膚に沈着する。最後に、C1qは、いくつかの異なる腫瘍組織4で同定されている。高分子量HAは血管新生および増殖のための自然な障壁であり、最近の証拠はC1qが補体活性化における古典的な役割に加えて、ECM分子として作用し、細胞移動を好むことを示した。
本研究の新規性は、C1qとHAの結合がHAとの腫瘍細胞の相互作用を強く修飾するという知見に含まれる。このメソッドをセットアップするには、いくつか.......
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開示事項
著者らは、この研究は、潜在的な利益相反と解釈される可能性のある商業的または財政的な関係がない場合に行われたと宣言している。
謝辞
私たちは、HA、レオナルド・アマディオ、ガブリエラ・ジト(IRCCS「ブロ・ガロフォロ」、トリエステ、イタリア)とアンドレア・ロマーノ(解剖学と病理学の手術臨床ユニット、カティナラ病院、トリエステ、イタリアの婦人科の部門)を提供するためのイワン・ドナティに感謝します)を使用して、組織サンプルコレクションを行います。また、ニコロ・モロシーニがビデオの準備とアレックス・コッポラの声に助けをしてくれたことに感謝します。この研究は、母子保健研究所、IRCCS「ブロ・ガロフォロ」、トリエステ、イタリア(RC20/16)、フォンダジオーネ・カッサ・ディ・リスパルミオ・トリエステからR.Bullaへの助成金によって支援されました。
....アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 100&シンスプ;&マイクロ;mポア | フィルターBDファルコン | 352360 | |
| アムホテリシンB溶液(菌類) | Sigma-Aldrich | 1397-89-3 | |
| 基礎FGF | 免疫科学 | GRF-15595 | |
| 塩化カルシウム | Sigma-Aldrich | C-4901 | |
| コラゲナーゼI型 | Worthington Biochemical Corporation, DBA | MX1D12644 | |
| D-Glucose | Sigma-Aldrich | 50-99-7 | |
| DNase I | ロシュ | 10 104 159 001 | |
| EDTA | シグマ・アルドリッチ | 60-00-4 | |
| EGF | Immunological Sciences | GRF-10544 | |
| FAST DiI | Molecular probes, Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | D7756 | |
| ウシ胎児血清 | Gibco, サーモフィッシャーサイエンティフィ | 10270-106 | |
| フィブロネクチン | ロシュ | 細胞 | |
| フラスコ | コーニング | 430639 | 滅菌済み、通気式 |
| ゲンタマイシン溶液 | Sigma-Aldrich | G1397-10ML | |
| ハンク平衡塩溶液(HBBS) | シグマ・アルドリッチ | H6648 | EDTA、グルコース、ペニシリン-ストレプタマイシン、ゲンタマイシン、真菌ゾーンを補給 |
| 高分子量ヒアルロン酸 | イワン・ドナティ | ||
| ヒト内皮血清フリー培地 | ギブコ、 サーモフィッシャーサイエンティフィック | 11111-044 | EGF(5 ng/mL)、塩基性FGF(10μm;ng/mL)、および 1%ペニシリン–ストレプトマイシン(Sigma-Aldrich) |
| 塩化マグネシウム | ロエルバ | 13446-18-9 | |
| ミディアム199ハンク'塩 | シグマ・アルドリッチ | M7653 | |
| ペニシリン・ストレプトマイシン | Sigma-Aldrich | P0781 | |
| タイムラプス顕微鏡 | ニコン | イメージングシステム BioStation IM-Q | |
| Titertek Multiskan ELISA Reader | Flow Labs | ||
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T4674 |
参考文献
- Zamboni, F., Vieira, S., Reis, R. L., Oliveira, J. M., Collins, M. N. The potential of hyaluronic acid in immunoprotection and immunomodulation: Chemistry, processing and function. Progress in Materials Science. 97, 97-122 (2018).
- Lorusso, G., Ruegg, C.
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再版と許可
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