方法論記事

細胞接着促進における補体タンパク質C1qとヒアルロン酸間の相互作用の評価

DOI：

10.3791/58688

⸱

2019年6月15日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Life Sciences, University of Trieste, 2Institute for Maternal and Child Health, IRCCS (Istituto di Ricovero e Cura a Carattere Scientifico) Burlo Garofolo, 3Department of Medical, Surgical and Health Science, University of Trieste

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

補体成分C1qは、細胞外マトリックスと相互作用しうる組織微小環境において高度に発現する炎症性分子である。ここでは、ヒアルロン酸に結合したC1qが細胞接着にどのように影響するかを試験する方法について述述する。

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

腫瘍微小環境が新生物の成長および転移に積極的な役割を果たしていることをますます実証されている。異なる経路を通じて、腫瘍細胞は刺激因子、ケモカインおよびサイトカインを分泌することにより、間質細胞、免疫細胞および内皮細胞を効率的に募集することができる。次に、これらの細胞は、高い増殖および転移能力を維持するために、成長促進シグナル、代謝産物および細胞外マトリックス成分を放出することにより、微小環境のシグナル伝達特性を変化させることができる。この文脈において、我々は、ヒト悪性腫瘍の範囲によって局所的に高く発現する補体成分C1qが、細胞外マトリックスヒアルロン酸と相互作用した場合、ヒト腫瘍から単離された原発細胞の挙動に強く影響を及ぼすことを同定する。標本。ここでは、ヒアルロン酸(HA)に結合したC1qが腫瘍細胞接着にどのように影響するかを調べ、細胞外マトリックスの主要成分(この場合はHA)の生物学的特性が腫瘍に対する生理活性シグナルによって形成できるという事実を基礎とする方法を説明する。進行。

概要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

腫瘍微小環境(TME)は、細胞の生存、増殖および侵入に寛容なニッチを提供することができるので、癌の発達および進行に影響を与える。TMEにおける新しい主要なプレーヤーの同定は、標的治療のための新しい分子ツールの発見に役立つ可能性がある。TMEは、内皮細胞、線維芽細胞および免疫系の細胞などの非悪性細胞の複雑かつ動的なネットワークを含み、コラーゲン、ラミニン、フィブロネクチンを含む周囲の細胞外マトリックス(ECM)成分に埋め込まれ、プロテオグリカンとヒアルロナン。腫瘍細胞と非腫瘍細胞の両方が、サイトカイン、ケモカイン、成長因子および炎症およびマトリックスリモデリング酵素と共にECM成分を合成し、分泌し、TMEの物理的、化学的およびシグナル伝達特性を全体的に変化させます。これらの成分の中で、ヒアルロン酸(HA)は腫瘍生物学において重要な役割を果たすために出現した。その単純な化学組成にもかかわらず、HAは、そのHA結合分子(ヒャラデリン)と共に、血管新生、免疫系応答性およびECMリモデリングを大きさおよび濃度依存的な方法1で調節することができる。

補体(C)システムは、最近注目を集めているローカルTMEの一部でもあります。C系は、非自己細胞、不要な宿主要素および病原体に対する防御の第一行に関与する可溶性および膜結合タンパク質のセットを包含する。機能的には、Cは、直接細胞死または炎症反応2の取り付けを促進するために、先天的および適応系の2エフェクターアームをリンクする。C活性化は、癌細胞を破壊したり、その増殖を阻害することによって腫瘍増殖を抑制することができるが、慢性炎症を持続することにより腫瘍促進活性を有することがますます明らかになってなくなって、免疫抑制milieuは、血管新生を誘導し、癌関連シグナル伝達経路3を活性化する。この文脈において、C1qは、C系の古典的経路の第1認識分子が、C活性化4とは無関係に腫瘍微小環境において重要な機能を発揮するために出現した。C1qは、血管新生および転移に加えて癌細胞の接着、移行および増殖を支持することができるヒト悪性腫瘍の範囲によって局所的に発現することが示されている5。興味深いことに、C1qはHAなどのECMの主要な構成要素と相互作用する。

原発性癌細胞を腫瘍塊から分離する技術を開発した。さらに、腫瘍微小環境、特にC1qと高分子量ヒアルロン酸との相互作用を刺激するマトリックスを作成しました。HAに結合したC1qは、腫瘍細胞の接着を誘導することができた。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

プロトコル

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

患者からの組織サンプルは、イタリアのトリエステ大学病院の機関委員会による倫理的配慮の承認を受けた後、インフォームドコンセントの後に収集されました。

1. 腫瘍細胞の単離と培養(1日目)

  1. MPM固体標本からヒト中皮腫細胞を単離する。約2-3mm2の断片をカッターで細かくミンチし、ハンクスのバランス塩溶液(HBSS)で構成された消化溶液の5mLでインキュベートし、0.5mM Ca2+/Mg 2+、0.5%トリプシンおよび50 μg/mLを補充DNase I,4°Cで一晩。
  2. 腫瘍細胞の単離と培養(2日目)
    1. 一晩インキュベーションした後、消化した組織を37°Cのインキュベーターに30分間入れ、穏やかな揺れを起こす。
    2. 遠心分離(250 x g)時の消化液を3mg/mLコラゲナーゼタイプ1をHBSSで中5mLに溶解し、さらに37°Cで30分間インキュベートします。
    3. 10%の熱不活性化胎児ウシ血清(FBS)を加えることによって酵素反応をブロックする。5 mLピペで細胞を非常に慎重に再中断し、細胞のほとんどが組織から放出されることを確認します。次に、100 μmの細孔フィルターを通してセル懸濁液を濾過する。
    4. 12.5 cm2フラスコで細胞を播種し、ヒト内皮細胞無血清培地(HESF)で37°Cで培養し、10%FBSでEGF(10 ng/mL)、塩基性FGF(20ng/mL)、および1%ペニシリン-ストレプトマイシンを加えた。
      注:2-3日ごとに新鮮な媒体に交換してください。

2. HAコーティング(1日目)

  1. 1 mg/mL6の濃度で二重蒸留水で高分子量HA(1.5 kDa)を再中断する。
  2. 穏やかなピペッティングで炭酸塩/重炭酸塩バッファー(0.1M、pH 9.6)で50 μg/mLにHAストック溶液を希釈します。
  3. 96ウェルプレートを100μLの希釈HAストック溶液で一晩4°Cでコーティングします。
    注:ヒアルロン酸は、トリエステ大学生命科学部のイワン・ドナティ教授からの親切な贈り物でした。

3. C1qコーティング(2日目)

  1. 一晩インキュベーションの後、真空は処理されたウェルを吸引し、井戸あたり100 μLのダルベッコのPBS(dPBS)で96ウェルプレートを洗浄します。
  2. DPBS + 0.5% BSA および 0.7 mM Ca2+Mg /2+ でこれらのタンパク質を 25 μg/mL の濃度でインキュベートすることにより、C1q (25 μg/mL または用量応答実験用の異なる濃度) または BSA (負の対照として) をプラスチック固定化-HA に結合できるようにします。.その後、4°Cで一晩インキュベートします。
  3. 真空は井戸を吸引し、dPBSの100 μL/ウェルで96ウェルプレートを洗浄します。

4. FAST DiIによる細胞ラベリング

  1. 蛍光色素FAST DiIの10 μg/mLを含むdPBSの500 μLの500 μLの腫瘍細胞を再中断する。ラベリング用の5%v/vCO2インキュベーターで37°Cで15分間インキュベートし、5分間隔後に手動で混合する。
    1. 過剰なFAST DiIを除去するには、dPBSの10 mLを追加し、ピペットを上下に優しく、遠心分離機を250 x gで7分間7分間、0.1%BSAを含むヒト内皮血清フリー培地の1mLで細胞ペレットを再ステーペンする(HESF + 0.1%BSA)。

5. HA/C1qマトリックスの細胞接着(1日目)

  1. 真空は、異なるマトリックスでコーティングされたウェルを吸引する(ウェルはステップ3.2で被覆された)。
  2. 標識された細胞懸濁液の100 μLを被覆ウェルに分配し、プレートを37°Cで35分間インキュベートし、5%v/v CO2インキュベーターに入れます。
  3. 上清を吸引して非付着細胞を除去する。0.5% BSA、0.7 mM Ca2+および 0.7 mM Mg2+を含む dPBS で一度洗浄します。
  4. 10 mM Tris-HCl、pH 7.4 + 0.1% v/v SDSの200 μL/ウェルを加えて付着細胞をlyseし、蛍光リーダー(544nm、発光590nm)を使用して96ウェルプレートを直ちに読み取り、ラベルの数を増やすリサイジングを通して生成された較正曲線を使用して細胞。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

結果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

HAは、繰り返し(β,1-4)-D-グルクロン酸−(β,1-3)-N-アセチル-D-グルコサミン二糖単位(図1B)7を繰り返すことで構成される負の帯電高分子量多糖類である。96ウェルプレート上のHAの結合の発生およびその固定化の効率は、ビオチン化HA(バイオHA)を利用して試験した。10μg/mLから1mg/mLまでのバイオHAの異なる濃度を、100mM炭酸塩/重炭酸塩バッファーpH9.6で再懸濁し、4°Cで一晩インキュベートした。

広範な洗い流しの後、96ウェルプレートに結合したバイオHAをアルカリホスファターゼに結合したストレプトアビジンを用いて検出し、ストレプトアビジンの存在はpNPP(1mg/mL)を基質として定量した。読み取りは、ELISAリーダーを用いて405nmの波長で行った。Bio-HAは、用量応答方式で96ウェルプレートに結合す...

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

ディスカッション

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ヒアルロン酸と相互作用する補体成分C1qが、ヒト腫瘍組織から単離された原発細胞の挙動を調節する方法を調べるための簡単な方法を説明する。HAおよびC1qは両方とも生理学的および病理学的条件下で組織微小環境に豊富に存在し、いくつかの細胞生物学的プロセスに関与する。例えば、C1qは胎盤の微小環境に存在することが示されており、胎盤8の間に母性決定権の外陰性栄養芽細胞侵行を支持する。C1qはまた、組織再生および修復10に必要な血管遺伝学的プロセスを促進する創傷治癒皮膚に沈着する。最後に、C1qは、いくつかの異なる腫瘍組織4で同定されている。高分子量HAは血管新生および増殖のための自然な障壁であり、最近の証拠はC1qが補体活性化における古典的な役割に加えて、ECM分子として作用し、細胞移動を好むことを示した。

本研究の新規性は、C1qとHAの結合がHAとの腫瘍細胞の相互作用を強く修飾するという知見に含まれる。このメソッドをセットアップするには、いくつか...

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

開示事項

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者らは、この研究は、潜在的な利益相反と解釈される可能性のある商業的または財政的な関係がない場合に行われたと宣言している。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

私たちは、HA、レオナルド・アマディオ、ガブリエラ・ジト(IRCCS「ブロ・ガロフォロ」、トリエステ、イタリア)とアンドレア・ロマーノ(解剖学と病理学の手術臨床ユニット、カティナラ病院、トリエステ、イタリアの婦人科の部門)を提供するためのイワン・ドナティに感謝します)を使用して、組織サンプルコレクションを行います。また、ニコロ・モロシーニがビデオの準備とアレックス・コッポラの声に助けをしてくれたことに感謝します。この研究は、母子保健研究所、IRCCS「ブロ・ガロフォロ」、トリエステ、イタリア(RC20/16)、フォンダジオーネ・カッサ・ディ・リスパルミオ・トリエステからR.Bullaへの助成金によって支援されました。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
100&シンスプ;&マイクロ;mポアフィルターBDファルコン352360
アムホテリシンB溶液(菌類)Sigma-Aldrich 1397-89-3
基礎FGF免疫科学GRF-15595
塩化カルシウムSigma-Aldrich C-4901
コラゲナーゼI型Worthington Biochemical Corporation, DBAMX1D12644
D-GlucoseSigma-Aldrich 50-99-7
DNase I ロシュ10 104 159 001
EDTAシグマ・アルドリッチ 60-00-4
EGFImmunological SciencesGRF-10544
FAST DiIMolecular probes, Invitrogen, Thermo Fisher ScientificD7756
ウシ胎児血清Gibco, サーモフィッシャーサイエンティフィ10270-106
フィブロネクチンロシュ細胞
フラスココーニング430639滅菌済み、通気式
ゲンタマイシン溶液Sigma-Aldrich G1397-10ML
ハンク平衡塩溶液(HBBS) シグマ・アルドリッチ H6648EDTA、グルコース、ペニシリン-ストレプタマイシン、ゲンタマイシン、真菌ゾーンを補給
高分子量ヒアルロン酸イワン・ドナティ
ヒト内皮血清フリー培地 ギブコ、 サーモフィッシャーサイエンティフィック11111-044EGF(5 ng/mL)、塩基性FGF(10μm;ng/mL)、および 1%ペニシリン–ストレプトマイシン(Sigma-Aldrich)
塩化マグネシウムロエルバ13446-18-9
ミディアム199ハンク'塩シグマ・アルドリッチ M7653
ペニシリン・ストレプトマイシンSigma-Aldrich P0781
タイムラプス顕微鏡 ニコン イメージングシステム BioStation IM-Q
Titertek Multiskan ELISA ReaderFlow Labs
TrypsinSigma-Aldrich T4674
ック 培養用11051407001教授による親切な贈り物カル

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Zamboni, F., Vieira, S., Reis, R. L., Oliveira, J. M., Collins, M. N. The potential of hyaluronic acid in immunoprotection and immunomodulation: Chemistry, processing and function. Progress in Materials Science. 97, 97-122 (2018).
  2. Lorusso, G., Ruegg, C. The tumor microenvironment and its contribution to tumor evolution toward metastasis. Histochemistry and Cell Biology. 130 (6), 1091-1103 (2008).
  3. Ricklin, D., Hajishengallis, G., Yang, K., Lambris, J. D. Complement: a key system for immune surveillance and homeostasis. Nature Immunology. 11 (9), 785-797 (2010).
  4. Bulla, R., et al. C1q acts in the tumour microenvironment as a cancer-promoting factor independently of complement activation. Nature Communications. 7, 10346(2016).
  5. Winslow, S., Leandersson, K., Edsjo, A., Larsson, C. Prognostic stromal gene signatures in breast cancer. Breast Cancer Research. 17, 23(2015).
  6. Collins, M. N., Birkinshaw, C. Hyaluronic acid solutions: A processing method for efficient chemical modification. Journal of Applied Polymer Science. 130 (1), 145-152 (2013).
  7. Itano, N. Simple primary structure, complex turnover regulation and multiple roles of hyaluronan. Journal of Biochemistry. 144 (2), 131-137 (2008).
  8. Agostinis, C., et al. An alternative role of C1q in cell migration and tissue remodeling: contribution to trophoblast invasion and placental development. Journal of Immunology. 185 (7), 4420-4429 (2010).
  9. Agostinis, C., et al. Complement Protein C1q Binds to Hyaluronic Acid in the Malignant Pleural Mesothelioma Microenvironment and Promotes Tumor Growth. Frontiers in Immunology. 8, 1559(2017).
  10. Bossi, F., et al. C1q as a unique player in angiogenesis with therapeutic implication in wound healing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (11), 4209-4214 (2014).
  11. Hosszu, K. K., et al. Cell surface expression and function of the macromolecular c1 complex on the surface of human monocytes. Frontiers in Immunology. 3, 38(2012).
  12. Laurent, T. C., Fraser, J. R. Hyaluronan. Journal of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 6 (7), 2397-2404 (1992).
  13. Gaboriaud, C., et al. The crystal structure of the globular head of complement protein C1q provides a basis for its versatile recognition properties. Journal of Biological Chemistry. 278 (47), 46974-46982 (2003).
  14. Lam, J., Truong, N. F., Segura, T. Design of cell-matrix interactions in hyaluronic acid hydrogel scaffolds. Acta Biomaterialia. 10 (4), 1571-1580 (2014).

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

再版と許可

このJoVE記事のテキストまたは図の再利用許可をリクエスト

許可をリクエスト

タグ

Complement Protein C1qHyaluronic AcidCell AdhesionExtracellular MatrixTumor MicroenvironmentEnzyme Linked Immunosorbent AssayFluorescent Cell LabelingStandard Curve GenerationCoating ProcedureCell Adhesion Assay

関連記事