ビオチンと写真分解リンカーに接続されている RNA を用いた高分子複合体のシングル ステップ浄化

真核生物の RNA ポリメラーゼ II によって生成された mRNA 前駆体 (Mrna) は細胞質でのタンパク質合成のための完全に機能の mRNA テンプレートになる前に核の成熟イベントがいくつかを受けます。これらのイベントの 1 つは、3' 端処理です。Mrna の大半には、3' 端処理には胸の谷間に起こる結合が含まれます。この 2 段階の反応は比較的豊富な複合体によって触媒以上 15 の蛋白質¹から成る。動物レプリケーション依存性ヒストン Mrna は 3' 末端で U7 snRNP、U7 に snRNA の ~ 60 のヌクレオチドと複数タンパク質^2,3から成る複雑な低豊富で、重要な役割を果たした別の機構によって処理されます。.ヒストン mRNA と U7 snRNP のサブユニットの 1 つの特定のシーケンスで U7 に snRNA 塩基対が開裂反応を触媒する、成熟したヒストンを生成せず、多 mRNA 尾します。ヒストン mRNA の 3' 端処理も必要と茎ループ結合タンパク質 (SLBP)、保存された茎ループの位置を結合する胸の谷間サイトの上流と基板^2,3U7 snRNP の募集を強化します。目的で U7 snRNP の個々 のコンポーネントを識別する研究は、動物細胞で U7 snRNP の低濃度として分離または使用した結果浄化中に部分的な分解を受ける複合体の傾向のために挑戦されています。中性洗剤^4,5,6、高い塩の洗浄および/または複数のクロマト グラフの手順^7,8,9。

最近、U7 に依存した処理機械の組成を決定するヒストン mRNA が 3' または 5' でビオチンを含むの短い断片だった核エキスと培養および組み立ての複合体は、ストレプトアビジン コーティングで捕えられました。アガロース ビーズ^5,6,10。ビオチンとストレプトアビジンの非常に強力な相互作用のためストレプトアビジン ビーズに固定化した蛋白質は SDS の沸騰によって条件の変化の下で溶出され銀製の汚損及び質量分析法によって分析します。比較的粗サンプル、しばしば多数の背景蛋白質特異的行きの可能性のいくつかのコンポーネントをマスキング、ストレプトアビジン ビーズ混入が得られた一方、この単純なアプローチは、U7 snRNP のコンポーネントの数を識別加工機械と銀の検出を防止する染色ゲル^5,6,10。重要なは、このアプローチはまた追加のメソッドによって分離材料と同質性にさらに精製機能研究を排除しました。

ビオチン/ストレプトアビジン相互作用には、いずれかの相互作用を弱めるかで化学分解スペーサー アームを提供するために設計されているそれらのほとんどの事実上不可逆的な性質に対処するため時間の経過と共に変更の数を提案した、ビオチンを含む試薬^11,12。すべてのこれらの変更の欠点は、彼らが著しく整合性または浄化された蛋白質の活動を危険にさらす、溶出のステップ中にメソッドおよび/または多くの場合必要な非生理的条件の効率を減らすことだった。

ここでは、固有の問題を解決する別のアプローチについて述べる RNA を用いたビオチン/ストレプトアビジン戦略の 5 ' ビオチンが共有結合に接続された基板を経由で終了写真分解 1-(2-ニトロフェニル) はエチル基UV^13,14を長波長に敏感。我々 はショウジョウバエから制限 U7 依存処理機械の浄化のためのこのアプローチをテストし、哺乳類の核抽出¹⁵。ヒストン mRNA 含んでいるビオチンの短い潜伏と核エキスで写真分解のリンカー、組み立て加工団地のストレプトアビジン ビーズに固定化した、徹底的に洗って、やさしくネイティブ ソリューションをリリース~ 360 nm の紫外線ライトへの露出によってフォーム。UV 溶出方法は非常に効率的、迅速かつ簡単な U7 snRNP エキス¹⁵として 100 μ L から染色スライバーでそのコンポーネントを視覚化するための十分な量を収穫します。UV 溶出素材は背景蛋白質の無料直接質量分析、追加精製工程、酵素アッセイに最適です。同じメソッドは、比較的短い RNA 結合部位を必要とする他の RNA ・ タンパク質複合体の精製に採用されることがあります。ビオチンと写真分解リンカーも共有可能にシングル- と二本鎖 DNA の可能性のある様々 な DNA/タンパク質複合体の精製の UV 溶出法を拡張します。

ビオチンが共有結合を含む RNA 基板の化学合成に接続されているし、写真分解のリンカーで高価になり大幅に長い系列を非効率的な 〜 65 ヌクレオチドを超えないようにシーケンスのみ実用的ですが。この問題に対処するため、はるかに長い RNA バインディング ターゲットに適している方法を開発しました。このアプローチで任意の長さとヌクレオチドのシーケンスの RNA は生成された体外T7 または sp6 によってトランスクリプションによって、ビオチンおよび 5' 端 (トランスで写真分解のリンカーを含む短い相補的なオリゴヌクレオチドをアニールしました。構成)。結果二重個々 結合蛋白質または共有添付写真分解のビオチンを含む RNA の培地について同じプロトコルに従うストレプトアビジン ビーズの高分子複合体の浄化に使用後 (cis構成)。この変更には、UV 溶出の広範な範囲の RNA ・ タンパク質精製法の拡張のヌクレオチドの数百を含む体外生成成績と組み合わせて写真分解のビオチンを使用できます。

1. 基板の準備

注: ~ 65 ヌクレオチドより短い RNA 基板は、ビオチン (B) と共有結合 RNA 5' 側 (cis構成) に接続 (一緒に写真分解ビオチンまたは pcB と呼ばれる) 写真分解 (pc) リンカーを化学的に合成できます。大幅に長く結合部位を含む RNA 培地生成された体外T7 (または SP6) 転写する必要があるし、その後 5' 端 (トランスで基板部分を有する短い補完アダプター オリゴヌクレオチドに焼なまし構成) (図 1)。

1. 用未満 65 ~ ヌクレオチドから成る結合部位 (材料表) の商業メーカー化学興味の RNA を総合する pcB と共有 (図 1 a 図 2 a) RNA 5' 側に接続します。必要な濃度を達成するため、小さい因数-80 ° c で保存する滅菌水に溶解します。
2. 結合部位大幅 〜 65 ヌクレオチド、フォーム以上の体外部分二重生成されます関心と 5' 端 (図 3 a) で基板部分を有するアダプターの相補的なオリゴヌクレオチドの RNA。
   1. 関心 〜 20 塩基任意で 3' 端に拡張の結合部位を持つ RNA を生成する線形プラスミッド DNA または適切な PCR テンプレートのいずれかで T7 転写を実行します。
   2. T7 で生成された RNA の 3' 拡張機能を補完するもの、5' 端 (図 3 a) で pcB を含むアダプター オリゴヌクレオチドを化学的に合成するのに商業メーカー (資材表) を使用します。
      注: 2 つの 18 原子スペーサーと 2-3 非相補的なヌクレオチド連結複合体とストレプトアビジン ビーズの間潜在的な立体障害を軽減するオリゴヌクレオチドの 5' 端に配置できます。オリゴヌクレオチドが均一に 2' O メチル グループ、二重の強度を高めると、様々 な核酸に対する抵抗を提供するために変更されることをお勧めします。
   3. PcB アダプター オリゴヌクレオチドに T7 で生成された RNA をアニールします。
      1. RNA のミックス 20 pmol と 1.5 mL のアダプター基板オリゴヌクレオチド (1:5 モル比) の 100 pmol 管結合バッファーを構成する次の 100 μ L 含む: 75 mM KCl、15 mM HEPES pH 7.9, 15% グリセロール、10 mM エチレンジアミン四酢酸 (EDTA)。
         注: アニーリングの反作用で使用されるほとんどの (ないすべて) の mRNA 基板で二重を形成するのに十分なアダプター オリゴヌクレオチドの最小限の量を使用することが重要です。これ便利な事ができた³²P、アダプター オリゴヌクレオチドを使用しての増加額でラベル付けされた基板をアニールの 5' 端に RNA 基板のラベル化による様々 なバッファー条件との保存の監視、ストレプトアビジン ビーズ ビーズ結合バッファーをいくつかの洗浄後に放射性の信号。
      2. 5 分のための沸騰水でチューブを配置します。
      3. 部屋の温度に冷却するために水を許可します。

2. 複雑なアセンブリ

1. 最終濃度抽出物に存在する非特異的な金属依存性核酸をブロックする 10 mM 80 mM EDTA ph 8 マウス核エキス (または選択した別の抽出物) 1 mL を補足します。
   注: これは結合バッファーと同じ組成に抽出でバッファーを調整することになります (手順 1.2.3.1 参照)。EDTA はヒストン Mrna の体外処理には影響しませんが、タンパク質やマグネシウム依存的に組み立てる蛋白質の複合体の浄化で有害な場合があります。これらのケースでは EDTA の避けるべきであります。
2. Cis 諸国における pcB 基が付いた RNA 基板の 5-10 pmol を追加 (手順 1.1 参照) またはトランス(ステップ 1.2.3.3 参照) 10 mM EDTA を含む抽出液の 1 mL に。
   注: RNA の量は、一連の試用実験で慎重に評価する必要があります。多分逆効果、特定タンパク質の収量に影響がなくても RNA 結合蛋白質の無指定の背景を大幅増加制限の複合体の浄化のためあまりにも多くの RNA の基板を使用します。
3. 時々 サンプルを混合氷の上 5 分の抽出と RNA 基板を孵化させなさい。
   注: 両方、孵化の温度、時間を経験的に確立する必要があり、RNA ・ タンパク質複合体の特定の性質によって大きく異なることがあります。
4. 任意の潜在的な沈殿物を削除し、慎重にペレットを転送、上清を回避するを収集し 10,000 x g で 10 分間予冷遠心培養混合物をスピンします。

3. ストレプトアビジン ビーズの RNA ・ タンパク質複合体の固定化。

1. 1.5 mL チューブに商業サプライヤー (材料表) からストレプトアビジン アガロース ビーズ懸濁液の ~ 100 μ L を転送し、結合バッファー (75 mM KCl、15 mM HEPES pH 7.9, 15% グリセロール、10 mM EDTA) と音量を上げます。
   注意: このバッファーはアニーリングの混合物と、複雑なアセンブリ (ステップ 2.1) 使用される抽出物と同じ構図になりません。
2. 25 x g で 2-3 分間回して管の下部にビーズを収集し、上清を吸引します。
3. 2-3 回洗濯/回転と同じ手順を繰り返す結合バッファーでビーズを平衡に。
   メモ: この手順の最後に、ビーズのペレットが必要の巻 〜 30 μ L。
4. 釣合いストレプトアビジン アガロース ビーズの組み立ての複合体 (ステップ 2.4) を含む上清をロードします。
5. RNA とビーズに連結された複合体を固定する 4 ° C で 1 時間を回転させます。
6. 25 x g で 2-3 分間回して管の下部にビーズを収集します。
   注: 角ロータのチューブの側面に付着するのに傾向がある場合、ビーズの実質的な損失を避けるために空振りローターを使用します。
7. 上清を吸引し、同じ遠心分離条件を使用して、結合バッファーの 1 つの mL で 2 回ビーズをすすいでください。
8. 1 mL の結合バッファーを追加し、4 ° C で 1 h サンプルを回転させる
   注: 基板上に形成された複合体を分離する傾向がある場合は、この手順を省略できます。
9. 25 x g で 2-3 分のビーズ スピンダウン バッファーの 1 つの mL を追加し、懸濁液を新しいチューブに転送。
10. さらに 1 時間または複合体が安定していない場合、短い回転、25 x g で 2-3 分の間回しなさい、結合バッファーの 200 μ L で 500 μ L のチューブにビードを転送します。

4. UV 溶出します。

1. 高強度 UV ランプの輝きに達する前に 5-10 分の 365 nm の紫外線を発光オンします。
   注: これは照射の開始時の UV 発光の最大エネルギーを達成するために不可欠です。
2. 堅く詰められた氷を敷いたペトリ皿 (100 mm × 15 mm) の下を埋めるし、皿のふたをスタックします。
3. 簡単に渦管固定化の複合体を含む水平方向や上に置きます氷カバー サンプルが電球の表面の 2-3 cm の距離内にあることを確認、予め温めておいたランプ。
   注: 距離があまりにも大きい場合使用追加シャーレまたは他の適したオブジェクト電球に近いサンプルをもたらす。
4. 合計 30 分、頻繁に反転とボルテックスの照射管紫外線に懸濁液の均一照射を確保し、過熱を防止します。
   注: 追加の冷却を提供するには、UV 溶出のステップ実行できます冷蔵室で。過剰な氷の融解の場合新鮮な氷を敷いたペトリ皿に切り替えます。
5. 25 x g で 2-3 分のビーズ スピンダウンし、上清を収集します。
6. 再同じ条件を使用して上清をスピンし、上清を収集します。
   注: は、残ったビーズを転送しないようにする底で上清の少量を残してください。

5 銀染色によりサンプル分析は質量分析に続きます。

1. 使用 SDS/ポリアクリルアミド電気泳 UV 溶出上清の一部と左側に次の UV 溶出ビーズ材料の同じ割合を分離します。
   注: 分析の UV 溶出する前にサンプルから撤退のビーズの因数もあります。
2. 市販銀染色キットを使用して分離されたタンパク質を含むゲルを染色します。
3. UV 溶出上清および UV 照射ビーズで左で現在の蛋白質の強度を比較することによって UV 溶出効率を評価します。
4. 興味の蛋白質バンドを消費税し、標準プロトコル^10,15を用いる質量分析法によって彼らのアイデンティティを決定します。

6. UV 溶出サンプル質量分析法による解析。

1. 直接浄化された材料の全体のプロテオームを公平な方法で決定する質量分析法による UV 溶出上澄みの割合を分析します。
   注: この行うことができます精製試料の溶液処理による生成ペプチド^10,15のアイデンティティを決定する標準的な質量分析のプロトコルに続いてトリプシン。

UV 溶出メソッドが共有 pcB 構造 (cis構成) に 5' 端に接続されている化学的に合成された RNA 基板を二枚テストされた: pcB SL (図 1) と pcB-dH3/5 m Rna (図 2)。5 ヌクレオチド単一の孤立した尾に続いて茎ループ構造を含み、そのシーケンスは、成熟したヒストンの 3' 末端と同じ 31-ヌクレオチドの pcB SL RNA mRNA (すなわち。、U7 snRNP によってヒストン mRNA の開裂の後)。このユニークなシーケンスは、哺乳動物の細胞質分画に存在する 2 つのタンパク質既知のバインディング サイト: SLBP および 3' hExo16,17,18。pcB-dH3/5 mショウジョウバエH3 ヒストン mRNA の 63 ヌクレオチド断片であり茎ループに加えてショウジョウバエU7 snRNP (図 2) を結合するシーケンスが含まれています。

dH3 Ext (125 ヌクレオチド) T7 転写によって生成され、ビオチンとトランスの写真分解スペーサー基板/22mer、化学的に合成されたアダプター オリゴヌクレオチド (に熱処理によって提供することができます長い RNA 基板の例ですトランス構成)。プリント基板/22mer 5' 端に 2 つのグループが含まれているし、22 の 2' O メチル modifed ヌクレオチド (図 3 a) で構成されています。プリント基板/22mer(underlined in the sequence in Figure 3A) の 3' 端に 19 のヌクレオチドが最後 19 dH3 Ext mRNA のヌクレオチドに補足。この mRNA が長くなるほか、合成基板の dH3/5 m からに有意差、2 つのキー、同じ内容を含んだ信号処理: 茎ループ、U7 結合部位。

pcB SL RNA は S100 エキスによるマウス骨髄腫細胞19と効果から得られる細胞質画分 (1 時間 100,000 × g) 遠心の 1 mL の培養し、UV 溶出効率最初銀染色により解析しました。UV 溶出 (図 1 b、1 レーン) 前にストレプトアビジン ビーズにタンパク質の数が検出されました。長波長紫外線照射リリースこれらの蛋白質の一部のみ (図 1 b車線 3) 清、ビーズ (図 1 b、2 車線) に非特異的なバック グラウンドを残して、それゆえ UV 溶出のステップの重要性を強調します。主要な UV 溶出蛋白質は 3' hExo、全長タンパク質 (フロリダ州) と短く分解産物 (DP) の数で表される SLBP と SLBP として質量分析によって識別されました。様々 な RNA 結合タンパク質 (Rbp) として識別される他の蛋白質の量は少なくは (図 1 b車線 3) 紫外線照射によるソリューションにも選択的にリリースされました。

ショウジョウバエKc から核抽出液の 1 mL を添加して mRNA pcB/22mer (図 3) を熱処理した pcB-dH3/5 m mRNA (図 2) または dH3 Ext フォーム複合体20,21を処理する細胞します。各ヒストン mRNA に結合する蛋白質の特異性をよりよく評価するには、負の制御並列で核に 2 つの競合他社を抽出追加することによって準備された: SLBP、sequesters SL RNA とのペアを基本短いアンチセンス オリゴヌクレオチドU7 に snRNA と U7 snRNP、mRNA 上のサイトとの相互作用を防ぐことができます。

固定化基板-dH3/5 m の mRNA の UV 溶出のステップはビーズ (図 2 b に残って無指定蛋白質の強烈なバック グラウンドを持つ (図 2 b、1 レーン)、上清に蛋白質の小さい数だけの選択的なリリースとなりました、車線 3)。これらの蛋白質は A をラベル-、私は U7 snRNP15のコンポーネントとして質量分析によって識別されました。また部分的に含まれているサンプル 10 kDa で移行 SLBP を低下し、のみ SDS/ポリアクリルアミド ゲル濃度が高いほど上に表示することができます。これらのタンパク質は、ヒストン (図 2 b, 2 の車線) mRNA に U7 snRNP の結合をブロックする 2 つの処理競合他社の存在下では検出されなかった。

ショウジョウバエU7 snRNP の同じコンポーネントは、dH3 Ext mRNA と pcB/22mer (図 3 b、1 レーン) から成る固定二重の紫外線照射によるソリューションにリリースされました。このサンプルは、dH3 Ext mRNA との二重を形成する過剰使用基板/22mer オリゴヌクレオチドと相互作用する複数の RNA 結合タンパク質をさらに含まれています。U-7 のサブユニットと対照をなして snRNP、これらの汚染タンパク質として、ビーズ上に残されたすべての背景蛋白質の処理の競合他社の存在下で永続化 (図 3 bレーン 1 と 2 と 3 と 4 レーンを比較)。

UV 清含む加工団地のごく一部とネガティブ コントロール (2 つのライバルのオリゴヌクレオチドを調製、加工団地をそれ故に欠けている) から UV 上清の同じ割合を直接することができます。ゲルの電気泳動15によって溶出蛋白質の前分離なし質量分析法による分析。このメソッドはその大きさと豊かさに関係なくすべて溶出蛋白質を検出するに非常に敏感な否定的なサンプルと組み合わせて特に 3' 末端を実施するヒストン mRNA を関連付ける蛋白質の完全なリストを提供します。反応を処理します。

図 1: マウスの細胞質蛋白質の浄化は pcB SL RNA にバインドします。化学的に合成された pcB SL RNA (31-ヌクレオチド) の A (A) 図。5' 末端をビオチン (ビオ) に続いて写真分解部位 (pc) 長波紫外線に敏感 (366 nm)、2 18 原子スペーサーや 31 核酸ヒストンの成熟した Mrna の 3' 末端は、保存された茎ループ構造を形成します。(B) pcB SL RNA は S100 マウス骨髄腫細胞から細胞質抽出物で孵化します。広範囲洗浄、UV 銀染色 (3 車線) で溶出を行い、ストレプトアビジン ビーズにバインドされたタンパク質と RNA を精製しました。タンパク質 UV 溶出する前にストレプトアビジン ビーズに固定化したビーズ左側に UV 溶出がそれぞれ 1 と 2、レーンに表示されます後.(KDa) のタンパク質サイズ マーカーの位置は、左側に示されます。

図 2:ショウジョウバエ加工団地の精製 pcB-dH3/5 m mRNA 上で組み立てます。(A)の図は化学的に合成されたショウジョウバエ-特定の pcB-dH3/5 m mRNA (63-ヌクレオチド)。5' 末端をビオチン (ビオ) に続いて写真分解部位 (pc)、2 つの 18 原子スペーサーと 2 つのシーケンスの要素の重要な処理を含む 63 のヌクレオチド: 茎ループ構造と U7 結合部位。2 つの要素の間にある主要な胸の谷間のサイトの周りの 5 つのヌクレオチドは、U7 snRNP によって複雑なアセンブリの中に、胸の谷間をブロックする (ライン交差した) O メチル基 2' で変更されます。(B) プリント基板-dH3/5 m だった処理の複合体を組み立てるためのショウジョウバエ核エキスと孵化します。否定的な制御には核エキスにはヒストン mRNA に SLBP と U7 snRNP の結合をブロックする 2 つの処理の競合他社が含まれています。ストレプトアビジン ビーズに固定化された組み立ての複合体が、洗浄、ソリューション サンプルの長波紫外線への露出によってリリース広範囲。銀染色により UV 溶出物質 (UV sup) と次の UV 溶出 (UV ビーズ) ビーズの同じ割合を行った。(KDa) のタンパク質サイズ マーカーとストレプトアビジン (SA) の位置は、右側に示されます。

図 3:ショウジョウバエ加工団地の精製組み立て dH3 Ext mRNAトランスで写真分解のグループに接続されています。(A) T7 生成 dH3 Ext mRNA と化学的に合成された pcB/22mer オリゴヌクレオチド、次の一連の熱処理によって生成された dH3 Ext 二重の図: 5' ビオ/pc/18 歳未満/18 歳/mAmGmUmAmGmCmUmUmAmCmAmCmUmCmGmAmGmCmCmUmAmC。オリゴヌクレオチド、ビオチン (ビオ) 5' 端に配置し、写真分解 (pc) リンカーが続きます。(上記のシーケンス内の下線付き) 最後 19 ヌクレオチドが dH3 Ext mRNA に追加 3' 拡張子を補完します。2' O メチル変更 (図では表示されません) の存在は 2 つの目的を提供しています: それに対してエキス核酸オリゴヌクレオチドを安定化し、dH3 Ext mRNA で形成された二重の強度を向上させます。Ext 二重ショウジョウバエKc 核とし (B) dH3 抽出不在または存在広範囲洗浄とバインドされたタンパク質と一緒に UV 溶出、ストレプトアビジン ビーズに固定化した競合を処理します。銀染色により UV 溶出物質 (UV sup、車線 1 と 2) と UV 溶出 (UV ビーズ、3 と 4 レーン) に続くビーズの同じ割合を行った。加工団地 (競合を処理することによって排除されるもの) の特定の componenst は、F の文字に A で示されます。主要な非特定の RNA 結合蛋白質は (UV 溶出が、2 つの処理の競合他社の存在を永続化するもの) は、アスタリスクで示されます。(KDa) のタンパク質サイズ マーカーの位置は、右側に示されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

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