クリプトコッカスの研究における顕微鏡技術と蛍光読解の補完的利用-アメーバ相互作用

Summary

本論文では、静止画、蛍光画像、高解像度透過電子顕微鏡画像を用いて研究されたクリプトコッカス細胞とアメーバの共培養を調製するためのプロトコルについて詳しく述べたい。次に示すように、定量的データがこのような定性的情報を補完する方法について説明します。

Abstract

クリプトコッカス感染をシミュレートするために、環境中のクリプトコッカス細胞の自然捕食者であるアメーバをマクロファージのモデルとして使用することができます。この捕食生物は、マクロファージと同様に、内在細胞を殺すために食細胞細胞症を採用している。共焦点レーザー走査顕微鏡の助けを借りて、クリプトコッカス細胞とアメーバの間のインタラクティブな瞬間を描いた画像がキャプチャされます。電子顕微鏡の分解能はまた、アメーバ食品の真空中に閉じ込められたときにクリプトコッカス細胞の超構造的な詳細を明らかにするのに役立ちます。咽頭症は連続的なプロセスであるため、定量的なデータを分析に統合して、画像がキャプチャされた時点で何が起こるかを説明します。具体的には、クリプトコッカス細胞の内部化におけるアメーバの効率を定量するために相対蛍光単位が読み取られる。この目的のために、クリプトコッカス細胞は、食品真空の酸性環境の中に一度閉じ込められた蛍石を作る色素で染色されます。このような技術を通じて収集された情報は、アメーバによって内部化された場合、および場合によっては他の食細胞によって細胞の挙動と運命に関する結論を導き出すのに役立つ重要な情報を提供することができます。

Introduction

微生物は、土壌と水の開いた物理的境界などの異なる生態学的ニッチを占有し、繁栄するために時間をかけて進化^{してきました。}これらのニッチでは、微生物はしばしば限られた資源のための直接競争に従事します。重要なことは、彼らが拡大する人口2、3を収容するために必要な成長または空間をサポートするために使用する栄養素のために。特定の例では、アメーバのようないくつかのホロゾニック生物は、バイオマス4、5から栄養素を抽出する方法としてクリプトコッカス細胞に先行することさえある。その結果、このような生物は、獲物の個体数を制御することにより、領土の支配を確立することができます。この捕食圧のために、一部の獲物は、圧力の負の影響を和らめるために、クリプトコッカス^{カプセル6}などの微生物因子を生成するために選択されてもよい。しかし、この圧力の意図しない結果として、一部の微生物は、種の障壁を越え、栄養素が豊富で理想を持つ人体の限られた空間のように、7を植民地化するための新しいニッチを探し出すことを可能にする因子を獲得する。条件。後者は、クリプトコッカスのような地上微生物がど....

Protocol

クリプトコッカスネオフォーマンといくつかのアカントアメーバカステラニ株は、バイオセーフティレベル2(BSL-2)病原体とみなされます。したがって、研究者は、これらの生物を扱う際に適切な予防措置を取る必要があります。例えば、ラボの担当者は、ラボコート、手袋、目の保護などの特定のトレーニングおよび個人用保護具(PPE)を持っている必要があります。生物学的安全キャビネット(レベル2)は、感染を引き起こす可能性のある手順に使用する必要があります¹⁴.

1. 真菌細胞の培養と標準化(Madu^ら15から改変)

1. 酵母ペプトンデキストロース(YPD)寒天プレート上のストック培養(9ヶ月未満)から試験真菌株(すなわち、C.ネオフォルマンスUOFS Y-1378およびC.ネオフォルマンスLMPE 046)をストリークアウト。YPD寒天の成分に関する情報は、表1に示されています。
   注:C.ネオフォルマンスUOFS Y-1378は3-ヒドロキシ脂肪酸を産生することが示されているが、C.ネオフォルマンスLMPE 046は3-ヒドロキシ脂肪酸を産生しない。これらの分子の存在がどのように決定されるかについては、補足ファイル1

Results

微生物は肉眼では知覚できない微生物です。しかし、その影響は、皮膚感染症などの観察可能な臨床的に明らかな病気をもたらす可能性があります。微生物の形態、副産物、相互作用に至るまで、微生物の特定の側面を研究する際に、絵画やビデオの証拠を提供できることが最も重要です。

まず、クリプトコッカス細胞とアメーバとの相互作用を可視化することを目指しました。この目的のために、2時間共インキュベートされた細胞を示す明視野画像を最初に研究した。ある画像は、アメーバに近接していたクリプトコッカス細胞を明らかにした。アメーバ細胞の1つは、クリプトコッカス細胞を捕捉するために拡張擬似ポジアで見られた(図1A)。次に、蛍光中の対応する画像を参照用に撮影した(図1B)。染色された細胞の表面上の緑色蛍光は、クリプトコッカス細胞の存在を.......

Discussion

論文では、アメーバがクリプトコッカス細胞と相互作用する際に生じる可能性のある結果を明らかにするために、さまざまな技術がうまく用いられた。また、クリプトコッカス-アメーバ相互作用の結果に対する3-ヒドロキシ脂肪酸の影響を示すことに興味を持った。

最初に使用された技術は、静止画をレンダリングした共焦点顕微鏡検査でした。ここでのこの手法の主な欠点は、特定のタイムポイントに限定された情報のみを提供してくれたことです。結果に基づいて引き出すことができる結論は、誘導的推論に適しており、一連の^観察32に基づいて結論に達することができる。ただし、パターンが存在するいくつかの状況を観察したからといって、そのパターンがすべての状況に当てはまるというわけではありません。したがって、研究では、そのような限られた情報が根拠のない結論につながる可能性があることが示され、おそらく注意が必要です。要するに、矛盾または支持的な、相補的な証拠がない場合、内部化が細胞の咽頭細胞症につながった可能性があると結論付けてもよい。

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Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,4-ジアザビシクロ-[2.2.2]-オクタン価	Sigma-Aldrich	D27802-1.5-mL
プラスチックチューブ	サーモフィッシャーサイエンティフィック	69715-15
mL 遠心分離チューブ	サーモフィッシャーサイエンティフィック		7252018-50
mL 遠心分離チューブ	サーモフィッシャーサイエンティフィック		1132017-8
ウェルチャンバースライド	サーモフィッシャーサイエンティフィック	1109650	-
アセトン	メルク	SAAR1022040LC	-
アメーバ株	ATCCÒ	30234TM	-
ATCCミディアム 712	ATCCÒ	712TM	アメーバミディアム
ブラック 96ウェルマイクロタイタープレート	サーモフィッシャーサイエンティフィック	152089	-
遠心分離	機 Hermle	-
-クロロホルム	グマ-アルドリッチ	C2432	-
共焦点顕微鏡	ニコン	ニコン TE 2000	-
エポキシ樹脂:
[1] NSA	[1] ALS	[1] R1054	-
[2] DER 736	[2] ALS	[2] R1073	-
[3] ERL Y221樹脂	[3] ALS	[3] R1047R	-
[4] S1 (2-ジメチルアミノエタノール)[	4] ALS	[4] R1067	-
フルオレセインイソチオシアネート	Sigma-Aldrich	F4274	-
ギ酸	Sigma-Aldrich
489441-Fluoroskan Ascent FL	サーモフィッシャーサイエンティフィック	374-91038C	マイクロプレートリーダー
Glucose	Sigma-Aldrich	G8270	-
グルタルアルデヒド	ALS	R1009	-
血球計算盤	Boeco	-	-
クエン酸鉛	ALS	R1209	-
液体クロマトグラフィー質量分析計	Thermo Fisher	Scientific-Methanol
	Sigma-Aldrich	R 34,860	-
オービタルシェーカー	Lasec	-	-
四酸化オスミウム	ALS	R1015-pHrodo
グリーンザイモサンAバイオ粒子	ライフ	テクノロジーP35365	これはpH感受性染料
生理学的緩衝液	Sigma-Aldrich	P4417-50TAB	-
ロータリーシェー	カーLabcon	です-	-
リン酸ナトリウム緩衝液:
[1] オルトリン酸水素二ナトリウム	[1] メルク	[1] 106580	-
[2] ナトリウム二水素オルトリン酸二水和物	[2] メルク	[2] 106345
透過型電子顕微鏡	Philips	Philips EM 100	-
トリパンブルー	Sigma-Aldrich	T8154	-
ウルトラミクロトーム	ライカ	EM UC7	-
ウラニルアセテート	ALS	R1260A	-
真空デシケーター	Lasec	●
バイアル	シグマ-アルドリッチ	29651-U-YNB
	ラセック	239210-YPD
寒天	Sigma-Aldrich	Y-1500	-