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方法論記事

クリプトコッカスの研究における顕微鏡技術と蛍光読解の補完的利用-アメーバ相互作用

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DOI：

10.3791/58698

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2019年6月22日

 , 
1Department of Microbial, Biochemical and Food Biotechnology, University of the Free State

この記事について

サマリー

本論文では、静止画、蛍光画像、高解像度透過電子顕微鏡画像を用いて研究されたクリプトコッカス細胞とアメーバの共培養を調製するためのプロトコルについて詳しく述べたい。次に示すように、定量的データがこのような定性的情報を補完する方法について説明します。

要約

クリプトコッカス感染をシミュレートするために、環境中のクリプトコッカス細胞の自然捕食者であるアメーバをマクロファージのモデルとして使用することができます。この捕食生物は、マクロファージと同様に、内在細胞を殺すために食細胞細胞症を採用している。共焦点レーザー走査顕微鏡の助けを借りて、クリプトコッカス細胞とアメーバの間のインタラクティブな瞬間を描いた画像がキャプチャされます。電子顕微鏡の分解能はまた、アメーバ食品の真空中に閉じ込められたときにクリプトコッカス細胞の超構造的な詳細を明らかにするのに役立ちます。咽頭症は連続的なプロセスであるため、定量的なデータを分析に統合して、画像がキャプチャされた時点で何が起こるかを説明します。具体的には、クリプトコッカス細胞の内部化におけるアメーバの効率を定量するために相対蛍光単位が読み取られる。この目的のために、クリプトコッカス細胞は、食品真空の酸性環境の中に一度閉じ込められた蛍石を作る色素で染色されます。このような技術を通じて収集された情報は、アメーバによって内部化された場合、および場合によっては他の食細胞によって細胞の挙動と運命に関する結論を導き出すのに役立つ重要な情報を提供することができます。

概要

微生物は、土壌と水の開いた物理的境界などの異なる生態学的ニッチを占有し、繁栄するために時間をかけて進化してきました。これらのニッチでは、微生物はしばしば限られた資源のための直接競争に従事します。重要なことは、彼らが拡大する人口2、3を収容するために必要な成長または空間をサポートするために使用する栄養素のために。特定の例では、アメーバのようないくつかのホロゾニック生物は、バイオマス4、5から栄養素を抽出する方法としてクリプトコッカス細胞に先行することさえある。その結果、このような生物は、獲物の個体数を制御することにより、領土の支配を確立することができます。この捕食圧のために、一部の獲物は、圧力の負の影響を和らめるために、クリプトコッカスカプセル6などの微生物因子を生成するために選択されてもよい。しかし、この圧力の意図しない結果として、一部の微生物は、種の障壁を越え、栄養素が豊富で理想を持つ人体の限られた空間のように、7を植民地化するための新しいニッチを探し出すことを可能にする因子を獲得する。条件。後者は、クリプトコッカスのような地上微生物がどのように説明するか(C.)ネオフォーマンは病原性に変容する可能性があります。

そのためには、クリプトコッカス細胞がアメーバと共に持つ可能性のある初期接触と、これが病原性になるためにそれらを選択する方法を研究することが重要です。より具体的には、これは、感染中にマクロファージによって作用したクリプトコッカス細胞がどのように動作するかの手がかりを与える可能性があります。アメーバは、研究室8でアメーバの培養を比較的安価で維持しやすいため、マクロファージのモデルとして選ばれたのはこのためです。興味深いのは、クリプトコッカス二次代謝産物viz.3−ヒドロキシ脂肪酸9、10がアメーバとクリプトコッカス細胞との相互作用にどのように影響するかを調べることであった。

アメーバとその獲物と肉眼との相互作用を知覚する簡単な方法は、寒天プレートとスポットアメーバの表面に獲物を使用して芝生を作成することです。寒天プレート上のプラークまたはクリアゾーンの視覚化は、アメーバが獲物に餌を与えた可能性のある領域を示しています。しかし、このマクロレベルでは、プロセスの結果のみが指摘され、咽頭細胞症が機械化される過程は観察できない。したがって、細胞間ベースでプロセスを評価するために、11、12を使用することができるいくつかの顕微鏡的方法がある。例えば、インキュベーションチャンバを有する反転顕微鏡は、咽頭細胞とその標的13との間の事象のタイムラプスを記録するために使用することができる。残念ながら、タイムラプス機能を備えた顕微鏡のコストのために、実験室は、特にリソースの貧弱な設定で、このような顕微鏡を購入することが常に可能であるとは限りません。

上記の制限を回避するために、本研究は、C.ネオフォルマンスviz C.ネオフォルマンスUOFS Y-1378とC.ネオフォルマンスLMPE 046とアカンタモエバ・カステラニとの相互作用を評価する順次探索的設計を提示する。.まず、定量的方法に先行する定性的な方法が用いられる。静止画は、反転蛍光顕微鏡と透過電子顕微鏡を使用して撮影され、アメーバ-クリプトコッカス相互作用を描写します。続いて、プレートリーダーを用いて蛍光を定量し、クリプトコッカス細胞を内部化するアメーバの効率を推定した。データ解釈段階でこれらの方法から得られた結果を調整する場合、これは、咽頭細胞症のタイムラプスビデオを熟読するのと同じくらい重要な情報を明らかにする可能性があります。

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プロトコル

クリプトコッカスネオフォーマンといくつかのアカントアメーバカステラニ株は、バイオセーフティレベル2(BSL-2)病原体とみなされます。したがって、研究者は、これらの生物を扱う際に適切な予防措置を取る必要があります。例えば、ラボの担当者は、ラボコート、手袋、目の保護などの特定のトレーニングおよび個人用保護具(PPE)を持っている必要があります。生物学的安全キャビネット(レベル2)は、感染を引き起こす可能性のある手順に使用する必要があります14.

1. 真菌細胞の培養と標準化(Maduら15から改変)

  1. 酵母ペプトンデキストロース(YPD)寒天プレート上のストック培養(9ヶ月未満)から試験真菌株(すなわち、C.ネオフォルマンスUOFS Y-1378およびC.ネオフォルマンスLMPE 046)をストリークアウト。YPD寒天の成分に関する情報は、表1に示されています。
    注:C.ネオフォルマンスUOFS Y-1378は3-ヒドロキシ脂肪酸を産生することが示されているが、C.ネオフォルマンスLMPE 046は3-ヒドロキシ脂肪酸を産生しない。これらの分子の存在がどのように決定されるかについては、補足ファイル1を参照してください。
  2. 寒天プレートを30°Cで48時間インキュベートします。
    注:プレートは、廃棄またはストックカルチャー16を作るために使用する前に、4 °Cで最大2ヶ月間保存することができます。
  3. クリプトコッカス細胞(C.ネオフォルマンスUOFS Y-1378またはC.ネオフォルマンズLMPE 046)のループを削り取り、化学的に定義されたYNBブロス(6.7 g/L)の100mLを含む250 mLの円錐フラスコに接種する(w/v)ブドウ糖。YNBスープの成分に関する情報は表2に示されています。
  4. ロータリーシェーカーで160rpmで攪拌しながら、フラスコを30°Cで24時間インキュベートします。
  5. 24時間のインキュベーション期間の後、ヘモサイトメーターを使用して真菌細胞をカウントし、pH 7.4でPBSで細胞数を1 x 106細胞/mLに調整します。
    注:調製されたC.ネオフォルマンスUOFS Y-1378接種はステップ3.1および3.2で使用され、C.ネオフォルマンスLMPE 046接種はステップ3.2でのみ使用された。

2. アメーバ細胞の培養と標準化(Maduら15から改変)

  1. アカンタモエバ・カステラニのストック培養を解凍し、室温(RT)にします。
    注:アメーバは、アクセルソン・オルソンら8とシュースター17の修正されたプロトコルに基づいて調製されました。
  2. 解凍培養のピペット1mLを、ATCC培地712の15mLを含む50mL遠心管に接種する。ATCC培地712の成分に関する情報は、表3に示されています。
  3. 400 x gと30°Cで5分間、手動で軽く、すぐに遠心分離機を振ります。
  4. 上清を吸引する。
  5. ATCC培地712の15mLで細胞を再中断し、14日間30°Cでチューブをインキュベートする。
    注:定期的に、単純な光顕微鏡を使用して、細胞がトロフォゾイテ状態であるかどうかを判断するために、細胞をチェックします。彼らはトロポゾイテ状態になったら、新鮮な文化を開始します。
  6. ピペット1mLをトロポゾイテ状態で細胞を示し、それを用いて、新鮮な無菌ATCC培地712の15mLを含む無菌50mL遠心管を接種する。
  7. ロータリーシェーカーで160rpmで攪拌しながら、チューブを30°Cで1週間インキュベートします。
  8. 1週間後、血球計を用いてアメーバ細胞をカウントし、新鮮な無菌ATCC培地712で細胞数を1 x 107細胞/mLに調整する。
  9. ストロバー18によって詳述されているように、トリパンブルーの染みを使用して生存率アッセイを行う。少なくとも 80% の生存率を示すカルチャをさらに進めます。

3. 食欲細胞症を研究する細胞の蛍光染色(Madu et al. 15から改変)

  1. 蛍光顕微鏡を用いて定性データを収集
    注:アカンタモエバ・カステラニとC.ネオフォルマンスUOFS Y-1378でこのアッセイを行います。
    1. 標準化されたアメーバ(ATCC培地712の1x 107細胞/mL)の200μL懸濁液を付着スライドのチャンバーウェルに分配し、細胞が表面に付着するために30°Cで2時間インキュベートする。
    2. アメーバ細胞が付着している間、1.5 mLのプラスチックチューブにフルオレセインイソチオシアネートの1 μLで1 x 106細胞/mL(PBSの999 μL)に調整された標準化されたC.ネオフォルマンスUOFS Y-1378細胞を染色する。
      注:アセトンの1mLにフルオレセインイソチオシアネートの1mgを溶解することにより、汚れを調えます。
    3. Rtと暗闇で2時間50rpmに設定された軌道シェーカー上のC.ネオフォルマンUOFS Y-1378細胞を穏やかに攪拌する。
    4. 2時間後、遠心分離機を960xgで30°Cで5分間ペレット化する。
    5. 上清を吸引して、汚れでPBSを除去します。
    6. セルペレットを洗浄するためのチューブに1 mLのPBSを追加します。ゆっくりとピペッティングして細胞を洗います。
    7. 30°Cで5分間960 x gで細胞を遠心分離します。上清を捨てます。洗浄手順をもう一度繰り返します。
    8. 洗浄した細胞を1mLのPBSで再中断する。
    9. 染色されたC.ネオフォルマンスUOFS Y-1378細胞の200 μL懸濁液を、未染色アメーバ細胞を含むチャンバーウェルに分配する。
    10. さらに2時間の期間、30°Cで調製した共培養をインキュベートする。
      注:共培養は、実験の目的に合わせて異なるタイムポイントに対してインキュベートすることができる。
    11. 共同インキュベーション期間の終了時に、井戸の内容物を吸引する。
    12. 300 μLのPBSをウェルに加えて、チャンバーウェルを洗浄し、非結合共培養細胞を除去します。穏やかなピペッティングによってこれを行います。井戸の中身を吸引する。洗浄手順をもう一度繰り返します。
    13. 蒸留水の97 mLにグルタルアルデヒドの3 mLを加えることによって3%グルタルアルデヒド溶液を調べます。
    14. チャンバーウェルに250μLの3%溶液を加え、1時間インキュベートして共培養細胞を固定します。
    15. 固定剤を吸引し、ステップ3.1.13から詳細に部屋の井戸を洗います。
    16. チャンバースライドを備えたツールを使用してチャンバーウェルを解体します。
    17. 自動漂白を防ぐために、アンチフェード化合物、1,4-ジアザビクロ-[2.2.2]-オクタンをスライドに一滴加します。カバースリップでカバーし、蒸発を防ぐためにマニキュアで側面を密封します。
    18. 共焦点レーザー走査顕微鏡の100倍対物レンズ(油付き)を用いて共培養細胞を見る。
      注:アメーバとクリプトコッカス細胞の相互作用を見るためには、明るいフィールドと蛍光で写真を撮ることが重要です。可能な限り、蛍光は明視野画像に超押し付けることができます。アメーバ細胞は、典型的にはサイズが大きくなり(すなわち、45〜60μm)、トロホゾイテ細胞は不規則な形状を持っています。クリプトコッカス細胞は直径5〜10μmであり、球状形状を持っています。レーザーにさらされると、染色されていないアメーバ細胞が自動蛍光を放出する可能性があります。自己蛍光を低減する方法については、ベイスカーとドルベア19とクランシーとコーラー20を参照してください。
  2. 蛍光プレートリーダーを用いて定量データを取得
    注:アカンタモエバ・カステラニとC.ネオフォルマンスUOFS Y-1378またはC.ネオフォルマンスLMPE 046でこのアッセイを行います。
    1. 標準化されたアメーバの100 μL懸濁液(ATCC培地712で1x107セル/mLに調整)を黒い、付着性96ウェルマイクロチタープレートに分配します。
    2. アメーバ細胞が表面に付着できるように、プレートを30°Cで2時間インキュベートします。
    3. アメーバ細胞が付着している間、標準化されたC.ネオフォルマンスUOFS Y-1378細胞を1 x 106細胞/mL(PBSの999 μL)に1μLのpHrodo Green Zymosan A生体粒子を1.5mLマイクロセントリフュージチューブで染色する。染色C.ネオフォルマンスLMPE 046細胞も別のチューブに入っています。
      注:色素は、FITCとは異なり、咽頭細胞21、22の酸性環境内に閉じ込められた細胞を選択的に染色する。この技術のためには、中性pH(PBS)およびアメーバを含む培地中のクリプトコッカス細胞を中性pH(ATCC培地712)を含む培地中に維持することが重要である。酸性環境を有する培地は、相対蛍光単位の誤検知値を生み出し、より多くのクリプトコッカスが内部化されたことを示唆する。
    4. RTと暗闇で2時間50rpmに設定された軌道シェーカー上でクリプトコッカス細胞を穏やかに攪拌する。
    5. 2時間後、微小遠心管を960xgで遠心分離し、30°Cで5分間遠心分離し、細胞をペレットする。 上清を吸引して、汚れでPBSを除去します。
    6. チューブに1 mLのPBSを加え、ペレット化した細胞を洗浄します。穏やかなピペッティングで細胞を洗います。
    7. 30°Cで5分間960 x gで細胞を遠心分離します。上清を捨てます。洗浄手順をもう一度繰り返します。
    8. 洗浄した細胞のペレットを1mLのPBSで再中断する。
    9. 染色されていないアメーバ細胞を含むウェルに染色されたクリプトコッカス細胞の100 μL懸濁液を分配する。
    10. さらに2時間の期間、30°Cで調製した共培養をインキュベートする。
      注:共培養は、実験の目的に合わせて異なるタイムポイントに対してインキュベートすることができます。
    11. 共インキュベーション期間の終了時に、マイクロプレートリーダー上の蛍光を測定する。対数シグナルを相対蛍光単位に変換します。
      注:染料の励起は492 nmで、放出は538 nmである。自己蛍光を低減する方法については、ベイスカーとドルベア19とクランシーとコーラー20を参照してください。

4. 透過電子顕微鏡を用いて遠足細胞症を研究する(ヴァン・ワイクとウィングフィールド23から改変)

  1. アメーバエの5 mL懸濁液(ATCC培地712で1x 107セル/mLに調整)を15mL遠心管に加え、30°Cで30分間沈着させます。
  2. 標準化されたアメーバ細胞の5 mLを含む同じ遠心管にC.ネオフォルマンスUOFS Y-1378細胞(PBSで1x106細胞/mLに調整)の5 mL懸濁液を追加します。
  3. 30°Cで2時間チューブスタンドを許可します。
  4. チューブを640 x gで3分間3分間遠心分離し、共培養細胞をペレットする。上清を吸引する。共培養細胞を洗浄しないでください。
  5. 1.0M(pH=7.0)の3mLでペレットを再濁させて共培養細胞を固定し(pH=7.0)リン酸ナトリウム3%グルタルアルデヒドを3時間固定する。
  6. チューブを1,120 x gで30°Cで5分間遠心分離し、共培養細胞をペレット化する。上清を吸引する。
  7. 遠心管にリン酸ナトリウムバッファーの5 mLを追加し、ペレット化した細胞を洗浄します。チューブの内容物を20sに優しくピペッティングして洗います。
  8. チューブを1,120 x gで30°Cで5分間遠心分離し、共培養細胞をペレット化する。
  9. 手順 4.8-4.10 を繰り返します。上清を吸引する。
  10. 1.0M(pH=7.0)の3mLでペレットを再増止し、1.5時間のリン酸ナトリウム1%の四酸化オスミウムを再び固定する。
  11. 3%グルタルアルデヒドを除去するのと同様の方法で共培養細胞を洗浄することにより、固定性(四酸化オスミム)を除去します。
  12. それぞれ15分間に30%、50%、70%、95%および2つの変化の等級付けされたアセトン系列でTEM材料(共培養細胞とも呼ばれる)を脱水する。そのために、ペレット細胞にアセトン溶液の3 mLを加え、15分間放置します。次いで、RTで10分間200xgで遠心分離機を上清を捨て、アセトン溶液のより高い割合を加える。
  13. Spur24によるプロトコルに従って正常な一貫性のエポキシを準備する。
    注:エポキシ樹脂は断面に使用されます。
  14. 新たに調製したエポキシ樹脂にTEM材料を埋め込む。この操作を行うには、次の手順に従います。
    1. アセトンの100%溶液の3mLで再懸濁したTEM材料を含むチューブに、新たに調製したエポキシの3mLを添加する。チューブを1時間放置します。
    2. 30°Cで10分間200 x gでチューブを遠心分離します。エポキシアセトン溶液を吸引する。
    3. チューブ内のペレットに作りたてのエポキシの6mLを追加します。チューブを1時間放置します。
    4. 遠心分離機 200 x gで 30 °C で 10 分。すべてのエポキシアセトン溶液を吸引する。
    5. チューブに作りたてのエポキシの3 mLを追加します。チューブを8時間放置します。
    6. 遠心分離機 200 x gで 30 °C で 10 分。すべてのエポキシ溶液を吸引する
    7. チューブに作りたてのエポキシの3 mLを追加します。TEM材料をエポキシ溶液中に一晩真空デシケータに保管してください。
      注意:エポキシ樹脂は放射性物質です。PPEを使用してエポキシ樹脂を処理します。エポキシ樹脂はまた、ヒュームフードで処理する必要があります。研究者は、各国が定める物品を廃棄するための安全規則に従うべきである25。
  15. 70°Cで8時間TEM材料を重合する。
  16. ウルトラマイクロトームでは、エポキシ埋め込み材料から約0.1mm x 0.1 mm、厚さ約60nmの小さなセクションを取り付けたガラスナイフでトリムします。グリッド上にセクションを組み立て、染色する前にTEMサンプルホルダーボックスにグリッドを配置します。
  17. 暗闇の中で10分間6%のウラニル酢酸の滴でセクションを汚します。セクションが完全にカバーされていることを確認します。
    注:蒸留水の100 mLで汚れ(6g)を再構成します。
    注意:酢酸ウランは放射性物質です。PPEを使用して酢酸ウラネルを処理します。ウラニル酢酸塩もヒュームフードで処理する必要があります。研究者は、各国が定める物品を廃棄するための安全規則に従うべきである25。
  18. 100mLの蒸留水を含むビーカーに5回浸漬して切片をすすいでください。
    注:蒸留水は酢酸ウラネルの痕跡が含まれているので、それに応じて処分する必要があります。
  19. 暗闇の中で10分間ク硝酸鉛の滴でセクションを汚します。セクションが完全にカバーされていることを確認します。
    注:鉛クレートは、Reynold26によってプロトコルに従って準備する必要があります。
  20. 100mLの蒸留水を含むビーカーに5回浸漬して切片をすすいでください。
  21. TEMサンプルホルダーボックスに染色されたセクションを使用してグリッドを個別に組み立てます。
  22. 透過型電子顕微鏡で断面を表示します。

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結果

微生物は肉眼では知覚できない微生物です。しかし、その影響は、皮膚感染症などの観察可能な臨床的に明らかな病気をもたらす可能性があります。微生物の形態、副産物、相互作用に至るまで、微生物の特定の側面を研究する際に、絵画やビデオの証拠を提供できることが最も重要です。

まず、クリプトコッカス細胞とアメーバとの相互作用を可視化することを目指しました。この目的のために、2時間共インキュベートされた細胞を示す明視野画像を最初に研究した。ある画像は、アメーバに近接していたクリプトコッカス細胞を明らかにした。アメーバ細胞の1つは、クリプトコッカス細胞を捕捉するために拡張擬似ポジアで見られた(図1A)。次に、蛍光中の対応する画像を参照用に撮影した(図1B)。染色された細胞の表面上の緑色蛍光は、クリプトコッカス細胞の存在を...

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ディスカッション

論文では、アメーバがクリプトコッカス細胞と相互作用する際に生じる可能性のある結果を明らかにするために、さまざまな技術がうまく用いられた。また、クリプトコッカス-アメーバ相互作用の結果に対する3-ヒドロキシ脂肪酸の影響を示すことに興味を持った。

最初に使用された技術は、静止画をレンダリングした共焦点顕微鏡検査でした。ここでのこの手法の主な欠点は、特定のタイムポイントに限定された情報のみを提供してくれたことです。結果に基づいて引き出すことができる結論は、誘導的推論に適しており、一連の観察32に基づいて結論に達することができる。ただし、パターンが存在するいくつかの状況を観察したからといって、そのパターンがすべての状況に当てはまるというわけではありません。したがって、研究では、そのような限られた情報が根拠のない結論につながる可能性があることが示され、おそらく注意が必要です。要するに、矛盾または支持的な、相補的な証拠がない場合、内部化が細胞の咽頭細胞症につながった可能性があると結論付けてもよい。

...

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開示事項

著者らは、彼らが競合する金銭的利益を持っていないと宣言します。

謝辞

この研究は、南アフリカ国立研究財団(助成番号:UID 87903)と自由国家大学からの助成金によって支援されました。また、顕微鏡検査研究中にピーター・ヴァン・ワイクとハンリー・グロブラーが提供するサービスと支援にも感謝しています。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
1,4-ジアザビシクロ-[2.2.2]-オクタン価Sigma-AldrichD27802-1.5-mL
プラスチックチューブ サーモフィッシャーサイエンティフィック69715-15
mL 遠心分離チューブ サーモフィッシャーサイエンティフィック7252018-50
mL 遠心分離チューブ サーモフィッシャーサイエンティフィック1132017-8
ウェルチャンバースライドサーモフィッシャーサイエンティフィック1109650-
アセトンメルクSAAR1022040LC-
アメーバ株ATCCÒ30234TM-
ATCCミディアム 712ATCCÒ712TMアメーバミディアム
ブラック 96ウェルマイクロタイタープレートサーモフィッシャーサイエンティフィック152089-
遠心分離機 Hermle-
-クロロホルムグマ-アルドリッチC2432-
共焦点顕微鏡ニコンニコン TE 2000-
エポキシ樹脂:
[1] NSA[1] ALS[1] R1054-
[2] DER 736[2] ALS[2] R1073-
[3] ERL Y221樹脂[3] ALS[3] R1047R-
[4] S1 (2-ジメチルアミノエタノール)[4] ALS [4] R1067-
フルオレセインイソチオシアネートSigma-AldrichF4274-
ギ酸Sigma-Aldrich
489441-Fluoroskan Ascent FLサーモフィッシャーサイエンティフィック374-91038Cマイクロプレートリーダー
GlucoseSigma-AldrichG8270-
グルタルアルデヒドALSR1009-
血球計算盤Boeco--
クエン酸鉛ALSR1209-
液体クロマトグラフィー質量分析計Thermo FisherScientific-Methanol
Sigma-AldrichR 34,860-
オービタルシェーカーLasec --
四酸化オスミウムALSR1015-pHrodo
グリーンザイモサンAバイオ粒子ライフテクノロジーP35365これはpH感受性染料
生理学的緩衝液Sigma-AldrichP4417-50TAB-
ロータリーシェーカーLabconです--
リン酸ナトリウム緩衝液:
[1] オルトリン酸水素二ナトリウム [1] メルク[1] 106580-
[2] ナトリウム二水素オルトリン酸二水和物[2] メルク [2] 106345
透過型電子顕微鏡PhilipsPhilips EM 100 -
トリパンブルー Sigma-AldrichT8154-
ウルトラミクロトームライカEM UC7-
ウラニルアセテートALSR1260A-
真空デシケーターLasec ●
バイアルシグマ-アルドリッチ29651-U-YNB
ラセック 239210-YPD
寒天Sigma-AldrichY-1500-
シ

参考文献

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