ここでは、網膜色素変性症に関連付けられているロドプシン変異体の輸送を定量化する高コンテンツ イメージング法について述べる。多波長得点分析は、タンパク質ロドプシン細胞表面に、または全体のセルを定量化に使用されました。
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この記事について
サマリー
要約
ロドプシンもって変異は常染色体優性支配的な網膜色素変性症 (RP)、まばゆいばかりの効果的な治療法がない疾患進行として明示されるロッド視細胞死に します。我々 は誤って折りたたまれたロドプシン変異体の細胞毒性が薬理学的変異型ロドプシン蛋白を安定化により軽減できることを仮定します。他のクラス II ロドプシン遺伝子の変異の中で、P23H の突然変異は野生型ロドプシン、哺乳類の細胞膜に輸送されるに対し小胞体 (ER) の蓄積は構造的に不安定なロドプシンの変異体タンパク質をエンコードします。セルです。以前発光による高スループット画面 (HTS) を行い細胞膜と小胞体から P23H ロドプシンのトランスポートを救出した薬理学的シャペロンのグループを識別します。ここでは、高コンテンツ イメージング解析に続いて免疫染色法を使用すると、セル全体で膜上の変異型ロドプシン蛋白の量を数値化。この方法は有益であり誤次の HTS. から真のヒット数を識別するために効果的ですさらに、高コンテンツ画像解析では、各化合物の薬理学的特性評価のための単一の実験から複数のパラメーターを数値化することができました。6 関連する RP ロドプシン変異体、これらロドプシン変異体の構造安定性に関する定量的および定性的な理解のための 2 D の薬理学的プロファイルを取得に向けて 11 さまざまな化合物の効果を行ったこの試金を使用して、これらの変異体に向けてさまざまな化合物の有効性と。
概要
タンパクは、筋ジストロフィー、神経変性、網膜色素変性症 (RP)1を含む、まばゆいばかりの病気に関与しています。RP は継承と進歩的な網膜変性と機能とロッド視細胞や網膜色素 epitheliums (RPEs)2,3の恒常性に影響を与える 60 以上の遺伝子の突然変異に関連付けられているです。RP には現在効果的な治療法はありません。ロドプシンの突然変異は、RP の場合優性 (ad) の約 25-30% を占めています。クラス II 変異以上 150ロドプシン変異4 (ひと遺伝子変異データベース、http:/ www.hgmd.cf.ac.uk/) 中、ロッド視細胞死に貢献するロドプシン蛋白構造不安定になるとビジョンの損失5,6,7,8。P23H は北アメリカの最も頻繁なロドプシンの突然変異もクラス II ロドプシン変異9,
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プロトコル
注: ロドプシン輸送アッセイ.
1. 調製と細胞の培養
- 野生型 (WT) または変異マウス ロドプシン-金星の融合蛋白質を表現する低温保持 U2OS 安定した細胞を復活させます。バイアルに小さな氷の結晶だけが残るまで、37 ° C で細胞を解凍します。
注: U2OS 細胞が使用されるこのプロトコルでの in vitro研究光受容細胞ラインはありませんロドプシンの前毛様体の生合成は哺乳類細胞で同様の分子メカニズムによって調整されます。さらに、U2OS セルはプレートの底にしっかりと接続、ロドプシン輸送アッセイに最適ですので大型の細胞体があります。7 U2OS 安定細胞 WT、T4R、P23H、P53R、C110Y、D190N と P267L ロドプシンの突然変異体を使用ここでは品質と分析の信頼性を示す例として。他のロドプシンの変異体または他の膜タンパク質を発現する安定細胞は、アッセイの目的に応じて使用できます。利用可能な場合、ヒト ロドプシンを発現する安定細胞はこの試金で使用できます。マウスとヒト ロドプシン蛋白 95% の相同性を共有し、テスト生体内でモデルを使用マウス adRP P23H 変異8ロドプシンを運ぶこの試金によって同定された化合物になりますので、マウス ロドプシンはここに使いました。安定した細胞は、
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結果
我々 は 3 つのパラメーターを持つロドプシン トランスポートを特徴付けられる: 全体のセル (ロドプシン-金星は INT)、ロドプシンの細胞膜 (細胞膜におけるロドプシン INT) の染色強度との比でロドプシン-金星強度ロドプシン ロドプシン-金星度のセル全体 (MEM 総比率) 細胞表面の汚れ。ロドプシン輸送アッセイの代表的な結果を図 3 図 4に示します。DMSO と 9 を使用してcis-網膜治療、それぞれ 0 と 100% コントロール P23H ロドプシン金星を表現するセル Z'-これらの 3 つのパラメーターは、0 から 0.5、アッセイは、中程度の品質を持っていることを示唆している間の範囲のための要因高コンテンツ画像21のために十分。にもかかわらず、最適化された Z'-要因は、HTS アッセイに比べて、比較的複雑なプロシージャのための 0.5 よりも低く、この試金はまだ堅牢.......
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ディスカッション
ここでは、ヒット、HTS. から識別の特性評価に使用される高いコンテンツ イメージング アッセイを示したこれらのプロトコルに関連する唯一のオートメーションは高固体撮像素子です。染色とロドプシンの蛍光イメージングは、ロドプシン5,14,15,16のローカリゼーションを特徴付けるために一般的に使用されています。しかし、従来の撮像方法で撮影した画像の定量化は、1 つの条件、実験、あたりのイメージの低容量で品質管理パラメーターの不足十分な細胞像の欠如によって制限されます。我々 は 384 ウェル フォーマットに伝統的な染色プロトコルに適応、高コンテンツ イメージングに伝統的なイメージングを置き換え。この高コンテンツ イメージング プロトコルを使用して、我々 は正常に選択され、HTS11,.......
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開示事項
著者が明らかに何もありません。
謝辞
我々 は博士マーク E. Schurdak に感謝し、ピッツバーグ大学創高コンテンツ イメージャと初期研修を提供する研究所します。博士クシシュトフ ・ Palczewski (ケース ウェスタン リザーブ大学) は寛大 B630 反ロドプシン抗体と 1 4 を共有しました。マウス ロドプシン-金星コンストラクトの cDNA を含んでいるプラスミッド博士ネビン ・ ランバート (オーガスタ大学) で共有されていました。この仕事は、健康からの助成金 EY024992 YC と P30EY008098 にピッツバーグ大学ビジョン研究コア付与の国立研究所によって支えられました。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| U2OS(rhodopsin-Venus)細胞 | NA | U2OS細胞から生成された安定細胞 | |
| U2OS(T4R-rhodopsin-Venus)細胞 | NA | NA | U2OS細胞から生成された安定細胞 |
| U2OS(P23H-rhodopsin-Venus)細胞 | NA | NA | U2OS細胞から生成された安定細胞 |
| U2OS(P53R-rhodopsin-Venus)細胞 | NA | U2OS細胞から生成された安定細胞 | |
| U2OS(C110Y-rhodopsin-Venus)細胞 | NA | U2OS細胞から生成された安定細胞 | |
| U2OS(D190N-rhodopsin-Venus)細胞 | NA | NA | U2OS細胞から生成された安定細胞 |
| U2OS(P267L-rhodopsin-Venus)細胞 | NA | NA | U2OS細胞から生成された安定細胞 |
| DMEM高グルコース | ジェネシーサイエンティフィック | 25-500 | L-グルタミン、ナトリウムピルビン酸 |
| ウシ胎児血清 (FBS) | Gibco | 16140071 | 熱不活性化 |
| プラスモシン | InvivoGen | ant-mpt | マイコプラズマ除去試薬 |
| ペニシリン-ストレプトマイシン (100X) | Gibco | 15140122 | 100X 濃縮抗生物質溶液で細胞培養の細菌汚染を防止 |
| トリプシン-EDTA | Genesee Scientific | 25-510 | 0.25%, 1mM EDTA HBSS中 カルシウムおよびマグネシウムを含まない |
| ポリ-L-リジン溶液 | Sigma-Aldrich | P4707-50ML | Mol wt 70,000-150,000, 0.01%, 滅菌ろ過済み、BioReagent、細胞培養に最適 |
| CellCarrier-384 Ultra Microplates | PerkinElmer | 6057300 | 384ウェル組織培養処理マイクロプレート、黒いウェル壁と光学的に透明な環状オレフィン底部を備えたハイコンテント解析 |
| で細胞をイメージング滅菌済み96ウェルプレート | エッペンドルフ | 30730119 | 蓋を平底にして処理した組織培養液は、検出可能なパイロジェン、Rnase、DNase、DNAを含まない無菌です。非細胞毒性 |
| リン酸塩緩衝液 Sailine (PBS) | Invitrogen | AM9625 | 10 x PBS Buffer, pH 7.4 |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D4540 | >99.5%, 細胞培養試験済み |
| 9-cis-retinal | Sigma-Aldrich | R5754 | |
| 試験済み Compounds | Selleckchem/Life Chemicals/Custom synthesized | NA | Compoundsは、異なるベンダーまたはカスタム合成 |
| B6-30抗ロドプシン抗体 | Novus | NBP2-25160 | からの贈り物 Krzysztof Palczewski |
| Cy3-標識ヤギ抗マウス二次抗体 | Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc | 115-165-146 | |
| 16%パラホルムアルデヒド | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 28908 | メタノール |
| フリー10%ノーマルヤギ血清 | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 50062Z | ブロッキングバッファーHoechst |
| 33342、Trihydroch | Invitrogen | H3570 | 核染色溶液 |
| ハイコンテントイメージャー | ImageXpress | ImageXpress®マイクロコンフォーカルハイコンテントイメージングシステム | |
| MetaXpress ハイコンテント画像取得・解析ソフトウェア | Molecular Devices | メタエクスプレス | ハイコンテント画像取得・解析ソフトウェア |
| マルチチャンネルピペット (0.5-10 & micro;L) | レイニン17013802 | 手動8チャンネルピペット、0.5-10 &L | |
| マルチチャンネルピペット (0.5-10c | レイニン | 17013805 | 手動 8チャンネルピペット、20-200 µL |
| 電動マルチチャンネルピペット (10-200 μL) | Thermo Scientific | 14-3879-56BT | 96ウェルおよび384ウェルマイクロプレートピペッティングタスク用電子マルチチャンネルピペット |
| 50ml 試薬リザーバー | ジェネシーサイエンティフィック | 28-125 | マルチチャンネルピプテ分注用試薬リザーバー |
| 8チャンネル吸引器 | ABCサイエンティフィ | EV503 | 96ウェルまたは384ウェルプレートから液体を吸引するための8チャンネルステンレス製アダプター |
| エクセル表計算ソフト | Microsoft | Excel2016 | データ分析とヒートマップ生成のためのスプレッドシートソフトウェア |
| Origin2018 科学データ分析とグラフ作成ソフトウェア | OriginLab | Origin2018 | 線量反応曲線を生成するためのデータ分析ソフトウェア |
参考文献
- Gregersen, N., Bross, P., Vang, S., Christensen, J. H. Protein misfolding and human disease. Annual Review of Genomics and Human Genetics. 7, 103-124 (2006).
- Daiger, S. P., Bowne, S. J., Sullivan, L. S. Perspective on genes and mutations causing retinitis pigmentosa. <....
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