抗有糸分裂治療に対するアポトーシス応答を評価するために DR3 を過剰発現細胞株の確立

サマリー

遺伝子機能の研究に興味の遺伝子を過剰発現安定細胞株を確立することは、株それらを介してレトロ ウイルス感染後安定したトランスフェクション ピッキング単一クローンによって行うことができます。この方法で生成される DR3 HT29 細胞が死受容体 3 (DR3) antimitotics によるアポトーシス誘導に貢献機構を解明を紹介します。

要約

興味の遺伝子の機能を勉強しては、ノックダウン細胞発現の減少や過剰発現細胞で発現を増加などの表現のレベルを操作することによって実現できます。過渡と安定したトランスフェクションは、外因性の遺伝子発現のため頻繁に使用される 2 つの方法です。トランスフェクションは、安定したトランスフェクションにより宿主細胞のゲノムに統合される外因性の遺伝子、継続的に表現されるに対しにのみ短期的な表現に便利です。その結果、安定したトランスフェクションは長期の遺伝的調節に研究のため通常用いられます。ここでタグ死受容体 3 DR3 関数を探索する (DR3) を過剰発現安定したセルラインを生成するための単純なプロトコルについて述べる。均質性と安定したセルラインの純度を維持するためにレトロ ウイルス感染後単一クローンを選んだ。このプロトコルを使用して生成された安定したセルラインはこうして HT29 細胞におけるアポトーシス応答を再構成すること、抗がん剤の薬剤に敏感な DR3 欠損 HT29 細胞をレンダリングします。また、DR3 にフラグの札良い DR3 抗体の可用性の損失を補償し、体のエージェントは、アポトーシスを誘導する分子機構の生化学的研究を促進します。

概要

異種遺伝子発現されている興味のある遺伝子の機能を勉強する.2 つの方法、過渡と安定したトランスフェクション海抜ホスト セル^1,2に DNA または RNA のセグメントを挿入する細胞および分子生物学で使用されます。一過性トランスフェクション DNA または RNA 渡すことができない娘細胞、遺伝子は短い期間だけ保持ことができますように。その一方で、固定して transfected セルで外因性の遺伝子は細胞株での発現を維持ホスト細胞のゲノムに統合されます。したがって、安定したトランスフェクションは、長期の遺伝的調節に関する研究の通常予約されている方法です。生体内でのマウス ・ モデルに異種移植片の研究³として、安定したセルラインを移植もことができます。安定したトランスフェクションは、2 つのカテゴリに分けることができます: ウイルスや nonviral。Nonviral 遺伝子導入と比較して、ウイルス感染は、幅広い高効率^4,5,6,7で人間の細胞に遺伝子を転送できます。さらに、単一のクローンから安....

プロトコル

ここで説明したすべてのマウス実験が承認され、機関動物ケアおよび使用委員会 (IACUC) 清華大学に従って実施されますのでご注意ください。

1. DR3 過剰発現細胞株の生成

1. 3 DR3 cDNA を挿入することによって DR3 式 (pMXs IRES DR3 フラグ) のプラスミドを構築 retroviral ベクトルに対するブラストサイジン pMXs IRES 病原/XhoI の制限のサイトでに C 末端のフラグ x。
2. ダルベッコ変法イーグル培地 (DMEM) 4 mL で 60 mm 料理のぷらっと A 細胞を成長します。とき、電池が 80-90% の合流点に達する、次の日は transfect 2 μ g のプラスミド pMXs の IRES-DR3-フラグと細胞のトランスフェクション試薬を使用して (材料の表を参照してください) 製造元のマニュアル²⁰によると。
3. 72 時間後の上清を収集、0.45 μ m の滅菌フィルターを使用してメディアを濾液および 4 ° C で暗闇の中でウイルスの懸濁液を保つ
4. 60 mm ディッシュに DMEM HT29 細胞を成長し、5% CO₂と 37 ° C でセルを孵化させなさい。
5. とき、電池が 30-50% の合流点に達する、次の....

結果

DR3 を安定して発現する HT29 細胞の特性は図 1に示します。陰性対照となる野生型細胞が外因性の遺伝子発現を示さない間、クローンは DR3 のさまざまなレベルを表現します。ここでは 5 つの複製を示す中でクローン 1 と 5 は DR3 の最高レベルを表現します。1、5 次の実験のためのクローンを選びました。

Diazonamide の投与後 HT29 DR3 と HT29 細胞の形態は、図 2に 10 倍の倍率で倒立顕微鏡で観察されました。10 nM diazonamide 投与 48 h 後、HT29 DR3 は壊れた細胞膜と細胞の残骸 (底板) の明白なアポトーシスを示した。しかし、HT29 のみラウンド アップ細胞の形 (上部パネル) を出展そのままなセルの細胞分裂停止を示した。

ディスカッション

本稿では、HT29 DR3 安定したセルラインを生成する手法について述べる。DR3 HT29 細胞は、DR3 が体のエージェントによって誘導されるアポトーシスに貢献する分子機構を研究するためのモデルを提供します。このアプローチは、汎用性と再現性です。プロシージャの成功を確保するためプロトコルの 4 つのステップを考慮する必要があります。まず、高を生成するために十分なウイルスの力価はお勧めされる 80%-90% 合流、ぷらっと A 細胞 DNA トランスフェクションを実行します。第二に、光から 2 週間以上覆われているためウイルスの懸濁液を 4 ° C で保存する必要があります。第三に、150 mm 料理に感染した細胞を分割するときに、良く分離コロニーを取得するシリアルの希薄が感染効率が異なるセルに変化するよう勧めします。最後に、単一コロニーを拾うときべきである周囲の植民地すべて混入。

このプロトコルはほとんどの細胞株でうまく動作しますが、単一コロニーを形作りがちではセルの困難な可能性があります。この場合において、蛍光活性化セル (FACS) を並べ替えと組み合わせて抗生物質などの他.......

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
DMEM	Invitrogen	は	10% FBS および 1% ペニシリン/ストレプトマイシンを添加
C11965500BT 発光細胞生存率アッセイ	Promega	G7571
パクリタキセル	Selleck	S1150
pMXs-IRES-Blasicidin	Cell Biolabs	RTV-016
ジメチルスルホキシ	Sigma	D2650
PBS	Invitrogen	C14190500BT
Trypsin-EDTA (0.25%)	Invitrogen	25200056
1,5-ジメチル-1,5-ジアザウンデカメチレンポリメトビド	Santa Cruz	sc-134220
トランスフェクション試薬	Promega	E2311
抗マウス二次抗体	Jackson ImmumoResearch	115-035-166
抗フラグ抗体	Sigma	F-3165
HT29細胞株	ATCC	HTB-38
plat-A細胞株	Cell Biolabs	RV-102
PVDF Immobilon-P	Millipore	IPVH00010
クローニングシリンダー	Sigma	C1059
細胞イメージング マルチモードリーダー	Biotek	BTCYT3MV
CKX53 倒立顕微鏡	オリンパス	CKX53
12ウェル細胞培養プレート	Nest	712001
60 mm 細胞培養プレート	Nest	705001
15 mL 遠心分離チューブ	Nest
0.22 μm 滅菌フィルター	Millipore	SLGP033RB
Centrifuge 5810 R	Eppendorf	5810000327
96 Well White Polystyrene Microplate	コーニング	3903
ウェスタン ECL 基質	BIO-RAD	1705060
ImageQuant LAS 4000	GE Healthcare	ImageQuant LAS 4000
脱色シェイカー	HINOTECH	TS-2000A
ブラストサイジン	InvivoGen	ant-bl-1
全自動セルカウンター	BIO-RAD	TC 20
Opti-MEM I 還元型血清培地	サーモフィッシャー	31985070

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