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方法論記事

トロイの木馬として経路を用いたトウモロコシ蛋白質場配信で

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DOI:

10.3791/58746

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2019年2月8日

 ,  , 
1Department of Biology, Regensburg University, 2Department of Biology, Ludwig-Maximilians University of Munich

この記事について

サマリー

この作品は、3 つの異なったタイプのトウモロコシのティッシュに分泌されたトウモロコシ蛋白質の原配信経路トロイの木馬ひずみのクローニングについて説明します。

要約

Homer´s トロイの木馬神話に触発され、我々 はトウモロコシの病原体に体内の表現型解析を許可するトウモロコシのアポプラストから分泌されるタンパク質を提供する経路を設計されています。このメソッドは、トウモロコシの変換に依存しないが、微生物遺伝学、病原体の分泌機能を悪用します。ここで、体内の検査感染サイトや組織の異なる種類の高時空間解像度の分泌された蛋白質を配信できます。トロイの木馬戦略は一過性機能的タンパク質ドメイン、オフのターゲット蛋白質の効果を分析したり、オンサイド タンパク質過量投与、それにのための強力なツールを研究を特徴づけるためのトウモロコシの機能喪失の表現型を補完するために利用できます。トウモロコシの収穫システムにおけるタンパク質研究。この作業には、3 種類の異なるトウモロコシ組織にこのメソッドを適用するプロトコルを標準化された感染症に続いてトロイの木馬ひずみが発生する方法の正確なプロトコルが含まれています。

概要

赤病原体経路トウモロコシ黒穂病病1の原因となるエージェントです。Melanized、黒い胞子を含む大きな腫瘍でトウモロコシのすべての空中部分に感染します。グローバル レベルで米国アルテリシジンはメキシコで美食珍味として腫瘍を感謝しながらトウモロコシ収量の約 2% の年次損失を引き起こすと推定されます。植物の感染症は、トウモロコシの表皮細胞の最初の層を貫通する細胞壁溶解酵素を分泌する付着器によって開始されます。一次感染サイトから米国アルテリシジン成長細胞内と intercellularly、毎日1,2層 1 ~ 2 セルに侵入します。5 日に目に見える腫瘍に変わる植物の肥大で成功の感染結果感染1,3,4を投稿します。段階すべて感染菌糸はホスト細胞質1,2に任意の直接接触しなくても植物細胞質膜を鞘に収めた。感染菌糸と植物細胞膜間のタイトな apoplasmic スペースは、赤の相互作用ゾーンと呼ばれる宿主・病原体のインタラクティブなサイトと見なされます。植物自然免疫系を克服するためには、米国アルテリシジンは赤相互作用ゾーン1にエフェクター蛋白質の配列を分泌します。他の赤の相互作用ゾーン5,6,7,8のままいくつかのエフェクタの植物細胞にとられます。1 つ細胞壁のエフェクターは、シグナル伝達ペプチド ZmZIP1 ZmPROZIP から細胞壁プロテアーゼ活性9,10のリリースを防ぐためにトウモロコシの細胞壁酵素と相互作用する UmPit2 です。

最後の十年にわたって米国アルテリシジンなった植物-病原菌の相互作用、菌類の遺伝学もバイオ テクノロジー遺伝子手軽周知のライフ サイクルのために貴重なツールのためのモデルだけとの異種発現分泌タンパク質11,12,13。両方の従来型およびタンパク質の分泌のための信号は、翻訳後修飾14の制御を可能に決定されています。最近、米国アルテリシジンは小さい、勉強するトロイの木馬ツール分泌されるその場15トウモロコシ蛋白質として採用されました。トロイの木馬のアプローチは、小さな、分泌された蛋白質は葯の発達に関与する ZmMAC1 の機能を分析する正常に使用されました。ZmMAC1 は、多能性細胞と新しく生まれてくる細胞15の細胞運命仕様の周縁部を誘導します。同じ方法では、トウモロコシの被害関連ペプチド ZmZIP1 の生物学的機能が明らかになった。米国アルテリシジンZmZIP1 は、トウモロコシを分泌障害、腫瘍形成10です。したがって、トロイの木馬のアプローチを表す貴重な代替ルートはどちらも高時空間解像度でその場研究でタンパク質に必要な安定したトウモロコシ変換行もの組織浸潤の世代クローン発現と精製したタンパク質。特に、トロイの木馬戦略は、トウモロコシのアポプラストに任意の異種タンパク質の分泌と同じ組織内にある感染対非感染植物細胞の直接比較をできます。

このプロトコルは興味の蛋白質を調査する米国アルテリシジントロイの木馬歪みを生成するための主な手順を示しています。それさらを含む 3 つの異なるトウモロコシ組織型 (成人の葉、タッセルと耳) の感染対策に関する正確な情報米菌と時空間感染の進行そして蛋白質の機能を研究するための前提条件であります。これらのターゲットのティッシュ。それ以上の仕様は、トウモロコシの遺伝子増幅し顕微鏡イメージング技術、手順、ターゲット特定機器に依存したので。したがって、このプロトコルは、標準的な分子生物学の技術の経験豊富なユーザーに解決されます。

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プロトコル

1.米国アルテリシジン木馬の建設

注:図 1を参照してください。

  1. 遺伝子特定のプライマーおよび校正のポリメラーゼは DNA を使用してトウモロコシの cDNA からの興味の遺伝子を増幅します。プライマリの PCR の製品をクローンし、大腸菌プラスミドのベンダーの指示に従って.構造体に変換サンガーのクローン作成、次の手順を使用する前にシーケンスによって興味のシーケンスの正しい遺伝子を確認します。
    注:PCR 仕様はプライマー シーケンスの特異性と最適な DNA ポリメラーゼ反応条件のために最適化する必要があります。
  2. 信号のペプチッド (SP) のエンコード順序なし興味のトウモロコシの遺伝子を増幅するプライマーを設計します。
  3. RSIATA モチーフと下士官逆プライマーの 5´ 端を拡張サイト (表 1) を切る私。
  4. PCR のテンプレートとして 1.1 で生成された PCR コンストラクトを使用して校正の DNA ポリメラーゼと興味のトウモロコシの遺伝子を増幅します。
  5. ダブル ダイジェスト PCR の製品、米国アルテリシジン変換プラスミド p123 PUmpit2-SpUmpit2- ザンビアmac1 mCherry-ハ15、 Xbaと私は、下士官I. 消化の PCR 産物とプラスミドを浄化します。
  6. P123 PUmpit2-SpUmpit2- ザンビアmac1 mCherry-ハテンプレートに manufacturer´s の指示に従って T4 DNA リガーゼを使って消化液の PCR の製品を縛る。エシェリヒア属大腸菌に結紮製品を変換し、サンガーによる興味のシーケンスの正しい遺伝子を確認シーケンス。
  7. P123 PUmpit2-SpUmpit2- ザンビアの関心 mCherry の遺伝子- 制限の酵素SspとHaをリニア化」私と変換 solopathogenic米国に DNAアルテリシジンSG20016のひずみ。Carboxin 選択による米菌の形質転換細胞を分離し、南部で孤立した形質転換体のしみの分析16を確認します。
    注:興味、少なくとも 3 つの独立した米国アルテリシジンの各蛋白質の形質転換体を分離し、背景のランダムな突然変異の表現型効果を推定する分析する必要があります。

2. 培地

  1. YEPSlight 液体中16の準備: 1.0% (w/v) 酵母エキス、0.4% (w/v)、バクト ペプトンおよび 0.4% (w/v) ショ糖。DdH2O および 15 分; 121 ° c のオートクレーブのすべてのコンポーネントを解散します。オートクレーブ高温で長期間または繰り返しの培地の品質が低下するでしょう。
  2. 準備ジャガイモ デキスト ロース寒天培地 (PD 寒天培地)20: 3.9% (w/v) ジャガイモ デキスト ロース寒天培地、および 1.0% (w/v) 1 M トリス-HCl pH 8.0 (0.01 M ・ fc)。オートクレーブのボトルに直接すべてのコンポーネントをミックスし、ddH2O プラス磁気攪拌棒を追加します。オートクレーブで 121 ° C、15 分;オートクレーブ高温で長期間または繰り返しの培地の品質が低下するでしょう。
  3. PD 炭寒天培地20の準備: 3.9% (w/v) ポテト ・ デキスト ロース寒天培地、1% (w/v) 木炭、1.0% (v/v) 1 M トリス-HCl pH 8.0 (0.01 M ・ fc)。オートクレーブのボトルに直接すべてのコンポーネントをミックスし、ddH2O プラス磁気攪拌棒を追加します。オートクレーブで 121 ° C、15 分;オートクレーブ高温で長期間または繰り返しの培地の品質が低下するでしょう。

3. 植物感染

  1. トロイの木馬 (例えば顕微鏡を用いた細胞カウント) タンパク質を配信する応答のトウモロコシの細胞分裂の分析を行う事前。米国アルテリシジン -トウモロコシの細胞増殖を誘発して 4-5 日ポスト感染周りその後腫瘍の形成開始。疾患の定量的評価は組織に依存しており、6 から 14 日までに行わなければなりません。
    注:明確なトウモロコシの品種は、米国菌感染に感受性の異なるレベルを表示します。トウモロコシ c対W23、ガスペ フリント A188 初期黄金のバンタムや Va35 のこの病原体に対する感受性を示すトロイの木馬研究に適した品種で、このように。
  2. 米菌接種の準備
    1. 形質転換株による感染に対する副作用を推定するためにすべてのトロイの木馬の実験で否定的な制御として前駆ひずみ SG200 が含まれます。ここで、ネガティブ コントロールとして興味の蛋白質の非分泌のバージョンを表す米国アルテリシジンひずみを使用します。ただし、実用性 (例えばより大きい上映) の理由から、前駆ひずみ制御の簡単選択であるかもしれない。
    2. 実験を開始する前に推定感染文化の相当するものが必要があります。トウモロコシの組織型によって異なります各植物の感染が米国菌懸濁液の 1 〜 1.5 mL を必要があること注意してください。
      注:外径600 YEPS光中の 0.2 で 20 mL の希釈のための十分な一晩文化約 1 mL を 13-16 植物の感染症のための十分な 0.8 1.0 の OD600 米アルテリシジン文化の 25 mL。
    3. PD 寒天培地からスクラッチ米国アルテリシジンの滅菌パスツール ピペットを使用してプレート、YEPS光媒体の 5 mL に接種させ 28 ° C で 16 時間 200 rpm で一定振動成長文化。
    4. 感染する前に適切な成長と 400 倍の倍率で細菌汚染の標準の光顕微鏡による米菌接種文化を調べます。
      注:適切なカルチャ葉巻状菌だけは表示されている (図 2) です。
    5. 新鮮な YEPSライトの 900 μ L を混ぜて一晩文化を 100 μ l 添加し、分光光度計分析のブランクとして YEPS光媒体を用いた外径600を測定します。
    6. 0.2 の OD600に新鮮な YEPS光の中で一晩文化を希薄させ OD によって示される中間ログ成長段階に達するまで、200 rpm で一定振動 28 ° C で成長文化600 nm 0.8 1.0。
      注:米国アルテリシジン細胞はこれらの条件の下ですべての 2 h を複製する、従って目的 OD600は栽培の 4-5 時間後に達されます。
    7. 3,000 x gで 10 分間で回して 0.8 1.0 の OD600細胞を収穫し、上澄みを廃棄します。
    8. 洗浄細胞ペレット ddH2o. と 1 時間この目的のためには、ddH2O、スピン 3000 × gで 10 分間の 1 つの文化ボリュームを追加し、上澄みを廃棄します。
    9. 慎重に ddH2O 20 mL ガラス ピペットを使用してそれにより最終的な OD600 (トロイの木馬の試金) の 3.0 または 1.0 (病気の評価) のための調整の細胞ペレットを再懸濁します。
  3. トロイの木馬の検証: planta トウモロコシ融合タンパク質の分泌
    1. トロイの木馬ひずみ17トウモロコシ幼植物に感染します。
    2. 共焦点レーザー走査顕微鏡を使用して 2-3 日ポスト感染感染苗の顕微鏡イメージングを実行します。このため、葉の挿入ポイントの下 1 cm の長方形の部分を切除、顕微鏡スライド上にサンプルを置く、ddH2o. のドロップを追加MCherry 融合タンパク質を視覚化する λ で供試体をエキサイト = 561 nm、λ レコード放出 = 580 630 nm。
  4. 大人のトウモロコシの葉の感染
    1. 成人の葉の段階にトウモロコシを栽培する (とき少なくとも葉茎の中で成長する 7)。
      注:この段階に達する 14 h、28 ° C の日/10 h、品種 W23 を使用して 22 の ° C 夜リズムの温室条件下で播種時に 4 週間後。トウモロコシの品種と温室効果の条件によって期間が異なります。
    2. 米国アルテリシジン文化を転送 (3.2.9 参照) 20 × 1 皮下注射針付き 3 mL 注射器に。
    3. 茎頂組織をローカライズする慎重に茎を押します。分裂組織の拠点は、柔らかい組織を困難茎からの移行によって区別できます。
    4. ペンを使用して茎の生長点をマークします。
    5. 米菌培養シュートの分裂組織または花序メリステムの上 1 cm の 1.5 mL を注入します。
    6. 6 と 12 日ポスト感染病の症状を評価します。
  5. タッセルの感染
    1. タッセルの段階に達するまでには、トウモロコシの植物を育てます。
      注:トウモロコシ品種 W23 で葯とタッセルの開発に関する詳細なタイムラインは、前述の18、19だった。減数分裂前の葯を含むタッセルが米菌感染に非常に敏感トウモロコシ品種 W23 のタッセル、4-7 cm のサイズです。
    2. 慎重に幹にタッセルをローカライズする茎を押します。
    3. マークの先端とペンを使用して茎のタッセルの基本。
    4. 米国アルテリシジン文化を転送 (3.2.9 参照) 20 × 1 皮下注射針付き 3 mL 注射器に。
    5. 房周り接種の 1.5 mL を注入します。接種の等しい配分を確保するため、ゆっくりと先端、中央部とペンでマークされているタッセルのベースに 0.5 mL を配置します。
    6. 10 日間ポスト感染病の症状を評価します。
  6. 耳の感染症
    注:    耳組織開発明確なトウモロコシの品種と温室効果の条件が異なり、接種前に注意深く観察する必要があります。シルクを脱却し始めて耳は非常米菌感染に受けます。
    1. 米国アルテリシジン文化を転送 (3.2.9 参照) 20 × 1 皮下注射針付き 3 mL の注射器に。
    2. 殻葉間のスペースにできるだけ深く耳を傷つけることがなく接種針を挿入します。
    3. 耳の周りの接種材料の 1.5 mL のリリースです。
    4. 注射器と針を取り外して米国アルテリシジンソリューションを均等に配布するコブを慎重にマッサージします。
    5. 14 日記事感染病の症状を評価します。
  7. 米菌接種の有効性を確認します。
    1. PD 木炭寒天プレートに接種の 10 μ L を削除し、2 日間室温でインキュベートします。
      注:場合は、それぞれ米国アルテリシジン文化はフォームのフィラメントが、ふわふわ、白い菌糸が表示されます (図 5)

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結果

米国アルテリシジンのトロイの木馬の実験のための構造は、プラスミド p123 PUmpit2-Umpit2Sp-関心 mCherry の遺伝子-Haに複製されます。MCherry蛍光レポーターとエピトープHAに興味のトウモロコシの遺伝子を融合-タグ。融合タンパク質の発現は、特に感染21中に活性化されている米アルテリシジンUmpit2プロモーターの制御下でです。赤相互作用ゾーンに関心ペプチド タンパク質の直接分泌するコーディングの地域は米国アルテリシジンUmpit221 (図 1) の信号のペプチッド シーケンスに融合されま...

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ディスカッション

現代の作物研究は、遺伝子の分子生物学的解析とタンパク質レベルのプロトコルを要求します。遺伝的アクセシビリティを介して変換はありません利用可能なまたは非効率的でトウモロコシなどほとんどの作物種のため時間がかかるです。また、プロモーター レポーター システムなど信頼性の高い遺伝的ツールが不足している、異なる組織サイトで高時空間解像度でその場でタンパク質の機能を研究することは困難になります。細胞壁タンパク質は、クローン表現および浄化された蛋白質の組織浸潤によって学ぶことができます。ただし、異種蛋白質の表現の進歩にもかかわらず、困難で、多くの場合非効率的なタンパク質機能解析のために対象となる作物組織浸潤が残ります。トロイの木馬戦略は、変換または蛋白質浸透を必要としない別のアプローチです。トウモロコシの病原体米国アルテリシジンの分泌装置を採用し、感染組織の植物アポプラストへの興味の蛋白質は理論的には任意の配信が実現できます。興味の蛋白質のサイズに関してこの手法の限界を探検するためにあります。旧試金 Cmu1 融合 mCherry 290 アミノ酸米アルテリシジンエフェクターは正常に分泌

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開示事項

著者が明らかに何もありません。

謝辞

著者は、ラボ スペースおよび植物材料を提供するためトーマス ドレッセルハウス場、マーティン Parniske、ヌールディン Djella とアーミン ヒルデブラントを感謝したいです。トロイの木馬方式のオリジナル作品は、レオポルジナ ポスドク親睦と NSF プロジェクト IOS13 39229 によって支えられました。この記事で紹介した作品は、DFG の SFB924 (A14 と B14 のプロジェクト) によって支えられました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
2mLシリンジ B.ブラウン4606027V
23 G x 1 1/4皮下注射針B.ブラウン4657640
バクトペプトン BD211677
トウモロコシからin トウモロコシから interrest
CharcoalSigma-Aldrich05105
共焦点レーザー走査型顕微鏡は、地元で利用可能な機器を使用
キュベット (10 mm x 4 mm x 45 mm)Sarstedt67742
インキュベーター-シェーカーを 28 °C に設定;C、200 rpm現地で利用可能な機器を使用
400 倍の倍率、現地で利用可能な機器
を使用Nco INEBR0193
p123-PUmpit2-SpUmpit2-Zmmac1-mCherry-Ha担当著者に連絡してください 
パスツールピペット(ガラス製、先端長)VWR14673-043
pCR-Blunt-II-TOPOThermo Fisher ScientificK280002は、pENTRやpJET
ポテトデキストロース寒天培VWR90000-745
シャーピーペン地元で利用可能な機器を使用
分光光度計は地元で利用可能な機器を使用
Ssp INEBR0132
ショ糖Sigma-AldrichS0389
T4 DNA リガーゼNEBM0202
TRISSigma-AldrichTRIS-RO
em>Xba INEBR0145
酵母抽出物 BDの212750
cDNA の光学顕微鏡は地などの他の基本的なクローニングベクターと交換できます。<

参考文献

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