このプロトコルは、バキュロ ウイルス システムを効率的に最小限の労力と毒性、蛋白質の抽出、精製、哺乳類細胞の遺伝子を表現するために使用を含むクライオ電子顕微鏡によるイオン チャネルの構造を決定するために使用方法をについて説明します品質チェック、サンプル グリッドとスクリーニングと同様、データ収集と処理。
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方法論記事
式と単一粒子の低温電子顕微鏡による構造決定のための人間脂質感受性陽イオン チャネル TRPC3 の精製
* These authors contributed equally
この記事について
サマリー
要約
正規の TRP 亜科の一過性受容体電位チャンネル (TRPCs) が重要な役割を果たすカルシウム恒常性、特にストア作動性カルシウム エントリの適切な機能を維持するために不可欠な非選択的陽イオン チャネルシナプス小胞の放出と細胞内シグナリング。したがって、TRPC チャネルは、さまざまな心臓肥大などの心臓血管疾患、パーキンソン病などの神経変性疾患、脊髄小脳変性症などの神経系の疾患を含む人間の病気に関与しています。したがって、TRPC チャネルは、人間の病気の潜在的な薬理学的ターゲットを表します。ただし、これらのチャネルのゲーティングの分子メカニズムはまだ明らかではありません。安定性、均一な精製されたタンパク質の大量の取得の難しさ構造決定研究、特に TRPC イオン チャネルなどの哺乳類の膜タンパク質の制限要因となっています。ここでは、親和性とサイズ排除クロマトグラフィーによって変更されたバキュロ ウイルス遺伝子の転送システムとこれらの蛋白質の精製を用いた哺乳類のイオン チャンネル膜タンパク質の大量発現のためのプロトコルを提案する.さらに浄化された蛋白質から単一粒子の低温電子顕微鏡画像を収集するために、これらの画像を使用して蛋白質の構造を確認するプロトコルを提案します。構造決定は、ゲートとイオン チャネル機能のメカニズムを理解するための強力な方法です。
概要
カルシウムは、ホルモン分子合成1,2,3伝達物質の放出、転写制御カスケードのシグナリングを含むほとんどの携帯電話のプロセスに関与しています。細胞内の自由なカルシウムの恒常性の維持は健康と細胞の機能に不可欠です。ストア作動性カルシウム エントリ (SOCE) カルシウムの枯渇に格納する小胞体 (ER) トリガー イオン チャンネルの開口部を容易にする膜のプロセスは、細胞内のカルシウムの恒常性の主要なメカニズムの 1 つ、さらに4,5,6のシグナル伝達に使用できます、小胞体カルシウムの補充。TRP スーパーファミリーに属するカルシウム透過チャネルである、潜在的な一過性受容体チャンネル (TRPCs) は、SOCE7,8,9の主要な参加者として識別されています。
TRPC 家族の 7 人のメンバーの間で TRPC3、TRPC6、....
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プロトコル
1. DH10α バクミド DNA を生成する有能なセルの変形
- 興味の遺伝子を合成し、N 末端 (pFastBacI)20トロンビン胸の谷間サイトとツインの連鎖球菌性タグ、His8-タグ、および GFP を含むペグ ベクトルの修正バージョンに subclone。
- 5 を追加して有能なセルを変換 DH10α 1.5 ml チューブし、氷で 10 分間インキュベートの 50 μ L を pFastBacI で目的遺伝子を含むプラスミドの ng。熱衝撃 45 セル 42 ° C で sチューブに異化リプレッサー (SOC) 中に超最適のスープの 200 μ L を追加し、225 rpm で軌道シェーカーで 37 ° C で 4-8 時間インキュベートします。
- (50 μ g/mL カナマイシン、7 μ g/mL ゲンタマイシン、10 μ g/mL テトラサイクリン、100 μ g/mL、黄色 gal、40 μ g/mL イソプロピル β-D-1-thiogalactopyranoside [IPTG] 寒天) バクミド LB 寒天培地プレート上のセルの 5 μ L をプレートします。
- 37 ° C で 48 h 用プレートを孵化させなさい
注: まだ lacZ (ベクター挿入失敗) を表現している黄色ギャル インジケーター汚れの植民地白人 (正常にトランス フォーム) が植民地を選択できます。
....
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結果
表現のプロトコルの概要と hTRPC3 の精製は、図 1 aに表示されます。理想的な白人植民地、バクミド DNA 精製のために選択のような hTRPC3 バクミド板のイメージは図 1 bに表示されます。わかったその 48 h は明確な黄色 gal は、隔離されたコロニーの存在を維持しながらの染色に最適です。P2 hTRPC3 GFP 蛍光で可視化としてのウイルスの生産ピークは感染 Sf9 昆虫細胞 (図 1) の 4 d の後見られました。
P2 baulovirus 1% を添加したメディアから収穫された FBS、HEK293 細胞の懸濁液に感染するために使用します。酪酸ナトリウムが追加されたタンパク質式20を後押しするウイル.......
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ディスカッション
低温電子顕微鏡による蛋白質の構造決定はしない蛋白質の構造決定を大きく短縮新しいカメラやアルゴリズムの開発のおかげで、過去数年間で構造生物学の分野に革命をもたらしました容易に、特に膜タンパク質結晶化します。すべての低温電子顕微鏡技術の最近の進歩にもかかわらず、高画質頻繁化を容易にするために十分な質と量で浄化された蛋白質の準備の時間がかかり、高コスト、かつ挑戦的なままです。プロトコルを上で説明するよう迅速かつコスト効果の高い高品質の生産を許可することでこのプロセスの効率を改善する急速に表現する能力、複数の遺伝子をさまざまな精製条件の下で構築画面Cryoem 研究の使用のための浄化された蛋白質。
ここで説明したメソッドによって直接よりも少ないコストで哺乳類の膜タンパク質の大量を浄化するための方法を提供しますより迅速により固定して transfected セル行の生成、多くの手順がある、それぞれの最適化する必要がするには高品質の蛋白質収量を提供します。内で生産し、hTRPC3 を浄化するために使用する生化学的手法、重要なステップとチェックポイントの数があります。最初の重要なチェックポイント.......
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開示事項
著者が明らかに何もありません。
謝辞
デビッドのヴァン アンデル高度なクライオ電子顕微鏡スイートでデータ収集をサポート、G. 趙と X. 孟に感謝します。バリ ハイ パフォーマンス コンピューティング チーム計算サポートのお願い申し上げます。我々 はこの原稿を大幅改善コメント (名) ・ クレメンテ、D. 会費、j. Floramo、雄黄、Y のキム c. ミューラー、B. Roth、Z. ルアンに感謝の意を与えます。D. Nadziejka は、この原稿の編集サポートを感謝いたします。この仕事は、内部のバリによって支えられた資金。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| pEG BacMam ベクター (pFastBacI) | addgene | 31488 | |
| DH10α 細胞 | Life Technologies | 10361-012 | |
| S.O.C. 培地 | Corning | 46003CR | DH10&alpha の形質転換用; Bacmid |
| Bacmam 培養プレート | Teknova | L5919 | 形質転換 DH10&α; 細胞 |
| インキュベーションシェーカー細菌細胞用 | Infors HT | Multitron standard | |
| 細胞用インキュベーションオービタルシェーカー | サーモフィッシャー | SHKE8000 | |
| リーチイン CO2 哺乳類細胞用インキュベーター | サーモフィッシャー | 3951 | |
| 卓上オービタルシェーカー | サーモフィッシャー | SHKE416HP | 哺乳類細胞 |
| 用リーチインCO2インキュベーターに使用インキュベーター | VWR | 1535 | バクテリアプレート用 |
| QIAprep スピン ミニプレップキット | Qiagen | 27106 | プラスミド抽出および精製用 |
| フェノール:クロロホルム:イソアミルアルコール | DNA抽出用 | Invitrogen | 15593031 |
| Sf9細胞 | Life | 12659017 | 産生昆虫細胞 |
| Sf-900培地 | Gibco | 12658-027 | 細胞培 |
| FBS | アトランタバイオロジカルズ | S11550 | |
| 細胞トランスフェ | クション用Cellfectin II | Gibco | 10362100 |
| ポフェクタミン2000 | 哺乳類細胞トランスフェクション用 | Invitrogen | 11668-027 |
| VWR | 28145-501 | P1ウイルスろ過用 | |
| 0.2mmフィルターフラスコ500ml | P2ウイルス | ||
| 角マイヤー培養フラスコ(平底2L)をろ過するためのコーニング430758(平底2L) | 昆虫細胞培養用 | 遺伝子メイト | F-5909-2000 |
| 三角培養フラスコ(バッフル2L) | 哺乳類細胞培養用 | 遺伝子メイト | F-5909-2000B |
| ナノドロップ2000分光光度計 | モフィッシャーND-2000 | ||
| HEK293 | ATCC | CRL-3022 | タンパク質産生用哺乳動物細胞 |
| フリースタイル 293 発現 培地 | Gibco | 1238-018 | タンパク質発現用哺乳動物細胞培地 |
| 酪酸ナトリウム塩 | アクロス | タンパク質発現を増幅するための | 263195000 |
| PMSF | アクロス | 215740500 | プロテアーゼ阻害剤 |
| ウシ肺由来 | Sigma-Aldrich | A1153-100MG | プロテアーゼ阻害剤 |
| ロイペプチン塩酸塩 | Sigma-Aldrich | 24125-16-4 | プロテアーゼ阻害剤 |
| ペプスタチンA | フィッシャーサイエンティフィック | BP2671-250 | プロテアーゼ阻害剤 |
| ジギトニン | EMD ミリポア | 300410 | 界面活性剤 - 膜イミダゾールからタンパク質を可溶化する |
| Sigma | 792527 | レジンカラムからタンパク質を溶出させる | |
| アフィニティー精製 | TALON樹脂 | Clonetech | 製635504 6 |
| 列 | GE | 29091596; | 29091597 HPLCおよびFPLC用 |
| プロミネンスモジュラーHPLCシステム | 島津 | 下記 | |
| コントローラモジュール | 「 | CBM20A | |
| ソルベントデリバリーシステム | 」 | LC30AD | |
| 蛍光検出器 | 「 | 冷却 | |
| オートサンプラー | 」 | SIL20ACHT | |
| 画器付きピュアFPLCシステム | |||
| Haematologic Technologies Incorporated | HCT-0020 GFP | タグ切断用 | |
| アミコンウルトラ 15mL 100K遠心フィルターチューブ | ミリポア | UFC910008 | 濃縮タンパク質 |
| EDTA | ッシャー | E478500 | 安定化用 |
| 400メッシュカーボンコーティング銅グリッドTed | Pella Inc. | 01754-F | ネガステイン用グリッド |
| クアンティフォイル 穴あきカーボングリッド (金、1.2/1.3 μmサイズ/正孔スペース、300メッシュ) | Electron Microscopy Sciences | Q3100AR1.3 | grids for Cryo-EM |
| Vitrobot Mark III | FEI | for preparing sample grids by liquid ethane freezezing | |
| liquid nitrogen | Dura-Cyl | UN1977 | |
| ethane gas | Airgas | UN1035 | |
| Solarus Plasma System | Gatan | Model 950 | for cleaning grids before.サンプル凍結 |
| Tecnai Spirit電子顕微鏡 | FEI | ネガティブステインEMイメージング用 | |
| Talos Arctica electron microsocope | FEI | オ電子顕微鏡グリッドのスクリーニングおよび低分解能イメージング用 | |
| Titan Krios 電子顕微鏡 | FEI | 高解像度クライオ電子顕微鏡 | |
| ソフトウェア | |||
| Gautomatchソフトウェア | http://www.mrc-lmb.cam.ac.uk/kzhang/Gautomatch/ | 顕微鏡写真から粒子を拾い上げる | |
| Relion 2.1ソフトウェア | https://github.com/3dem/relion | 2Dおよび3D分類を構築する | |
| CryoSPARCソフトウェア | https://cryosparc.com/ | 初期構造モデルを生成する | |
| Frealignソフトウェア | http://grigoriefflab.janelia.org/frealign | を改良するparticles | |
| Cootソフトウェア | https://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/personal/pemsley/coot/ | モデルの構築 | |
| MolProbityソフトウェア | http://molprobity.biochem.duke.edu/ | 原子モデルの形状を評価する | |
| SerialEMソフトウェア | http://bio3d.colorado.edu/SerialEM/ | 自動シリアルイメージスタック取得用 | |
| MortionCor2ソフトウェア | 合計されたムービースタックのモーション補正のための http://msg.ucsf.edu/em/software/motioncor2.html | ||
| GCTFソフトウェア | https://www.mrc-lmb.cam.ac.uk/kzhang/Gctf/ | ムービースタックの焦点ぼけ値を測定するための | |
| 初期3Dモデルの実空間の微調整のための | ソフトウェア |
参考文献
- Berridge, M. J., Bootman, M. D., Roderick, H. L. Calcium signalling: dynamics, homeostasis and remodelling. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 4 (7), 517-529 (2003).
- Kumar, R., Thompson, J. R. The regulation of parathyroid hormone se....
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