式と単一粒子の低温電子顕微鏡による構造決定のための人間脂質感受性陽イオン チャネル TRPC3 の精製

サマリー

このプロトコルは、バキュロ ウイルス システムを効率的に最小限の労力と毒性、蛋白質の抽出、精製、哺乳類細胞の遺伝子を表現するために使用を含むクライオ電子顕微鏡によるイオン チャネルの構造を決定するために使用方法をについて説明します品質チェック、サンプル グリッドとスクリーニングと同様、データ収集と処理。

要約

正規の TRP 亜科の一過性受容体電位チャンネル (TRPCs) が重要な役割を果たすカルシウム恒常性、特にストア作動性カルシウム エントリの適切な機能を維持するために不可欠な非選択的陽イオン チャネルシナプス小胞の放出と細胞内シグナリング。したがって、TRPC チャネルは、さまざまな心臓肥大などの心臓血管疾患、パーキンソン病などの神経変性疾患、脊髄小脳変性症などの神経系の疾患を含む人間の病気に関与しています。したがって、TRPC チャネルは、人間の病気の潜在的な薬理学的ターゲットを表します。ただし、これらのチャネルのゲーティングの分子メカニズムはまだ明らかではありません。安定性、均一な精製されたタンパク質の大量の取得の難しさ構造決定研究、特に TRPC イオン チャネルなどの哺乳類の膜タンパク質の制限要因となっています。ここでは、親和性とサイズ排除クロマトグラフィーによって変更されたバキュロ ウイルス遺伝子の転送システムとこれらの蛋白質の精製を用いた哺乳類のイオン チャンネル膜タンパク質の大量発現のためのプロトコルを提案する.さらに浄化された蛋白質から単一粒子の低温電子顕微鏡画像を収集するために、これらの画像を使用して蛋白質の構造を確認するプロトコルを提案します。構造決定は、ゲートとイオン チャネル機能のメカニズムを理解するための強力な方法です。

概要

カルシウムは、ホルモン分子合成^1,2,3伝達物質の放出、転写制御カスケードのシグナリングを含むほとんどの携帯電話のプロセスに関与しています。細胞内の自由なカルシウムの恒常性の維持は健康と細胞の機能に不可欠です。ストア作動性カルシウム エントリ (SOCE) カルシウムの枯渇に格納する小胞体 (ER) トリガー イオン チャンネルの開口部を容易にする膜のプロセスは、細胞内のカルシウムの恒常性の主要なメカニズムの 1 つ、さらに^4,5,6のシグナル伝達に使用できます、小胞体カルシウムの補充。TRP スーパーファミリーに属するカルシウム透過チャネルである、潜在的な一過性受容体チャンネル (TRPCs) は、SOCE^7,8,9の主要な参加者として識別されています。

TRPC 家族の 7 人のメンバーの間で TRPC3、TRPC6、および TRPC7 ホモログ サブグループを形成し、脂質二次メッセンジャー ジアシルグリセ ロール (DAG) シグナル伝達脂質の分解物によって活性化することで一意ホスファチジルイノシトール 4, 5-二リン酸 (PIP2)^10,11。TRPC3 は、平滑筋と神経伝達と神経新生^12,13に影響を与えるカルシウム シグナル伝達に重要な役割を果たしている脳の大脳と小脳の地域に強く表されます。TRPC3 の機能不全は、中枢神経系疾患、心血管疾患、卵巣腺癌^14,,1516など特定の癌にリンクされています。したがって、TRPC3 は、これらの疾患の治療のための医薬品のターゲットとしての約束を保持しています。TRPC3 作用する特化した医薬品の開発は、脂質結合サイト^17,18を含むその分子活性メカニズムの理解の欠如によって制限されており。我々 はこれらのメカニズムの¹⁹に重要な洞察を提供する人間 TRPC3 チャネル (hTRPC3) と閉じた状態その 2 つの脂質結合部位の最初の原子分解能の構造を報告しています。

高解像度での膜タンパク質の構造決定の重要な要因は、高品質の蛋白質を得ることです。高品質の蛋白質を得るに必要な発現と精製条件の対応するスクリーニングは、時間がかかり、高価な努力をすることができます。ここで表現と hTRPC3 は、私たちの最初のスクリーニングで不完全の浄化のための最適の条件を識別する方法を詳しく説明するプロトコルを提案する.トラブルシューティングおよび電顕 (Cryoem) 私たちの低温電子の固体基盤を築くタンパク質の動作を最適化する方法でいくつかの重要なポイントを紹介します。生成するベクトル (pEG) Gouaux と同僚が開発したスクリーニング アッセイおよび哺乳類細胞²⁰でバキュロ ウイルスの効率的な生成のために最適化されている変更された baculoviral を使用します。この表現方法は哺乳類の細胞膜のタンパク質の発現を迅速かつコスト効果の高い適切です。ベクトルの使用この蛍光検出のサイズ排除クロマトグラフィー ベースと (FSEC) 法²¹の細胞診を組み合わせています。このメソッドは、興味の構造を融合した緑色蛍光タンパク質 (GFP) タグを使用して、小さな、細胞可溶化されたサンプルのターゲット蛋白質の可視化を向上させます。これは異なる洗剤や添加物、thermostabilizing の突然変異で、タンパク質の安定性のスクリーニングにより、小規模なトランスフェクション細胞の数が少ないを使用できます。このように、条件の多くを急速に大規模な蛋白質の浄化に移動する前に検査します。次の式、スクリーニング、および浄化を取得し、タンパク質のde novoの構造決定を生成する低温電子顕微鏡から画像を処理するためのプロトコルを提案する.ここで説明したアプローチ、TRP チャネル受容体および他の膜タンパク質の構造研究のための汎化可能なプロトコルとなることと考えています。

プロトコル

1. DH10α バクミド DNA を生成する有能なセルの変形

1. 興味の遺伝子を合成し、N 末端 (pFastBacI)²⁰トロンビン胸の谷間サイトとツインの連鎖球菌性タグ、His8-タグ、および GFP を含むペグ ベクトルの修正バージョンに subclone。
2. 5 を追加して有能なセルを変換 DH10α 1.5 ml チューブし、氷で 10 分間インキュベートの 50 μ L を pFastBacI で目的遺伝子を含むプラスミドの ng。熱衝撃 45 セル 42 ° C で sチューブに異化リプレッサー (SOC) 中に超最適のスープの 200 μ L を追加し、225 rpm で軌道シェーカーで 37 ° C で 4-8 時間インキュベートします。
3. (50 μ g/mL カナマイシン、7 μ g/mL ゲンタマイシン、10 μ g/mL テトラサイクリン、100 μ g/mL、黄色 gal、40 μ g/mL イソプロピル β-D-1-thiogalactopyranoside [IPTG] 寒天) バクミド LB 寒天培地プレート上のセルの 5 μ L をプレートします。
4. 37 ° C で 48 h 用プレートを孵化させなさい
   注: まだ lacZ (ベクター挿入失敗) を表現している黄色ギャル インジケーター汚れの植民地白人 (正常にトランス フォーム) が植民地を選択できます。
5. 青いコロニーと接触するいると一晩で 225 rpm で軌道シェーカー 37 ° C バクミド LB 培地 (50 μ g/mL カナマイシン、7 μ g/mL ゲンタマイシン、テトラサイクリン 10 μ g/mL) の 6 mL のセルを育てる白人の植民地を避け、白い植民地の分離を慎重に選択します。

2. 細菌に備えてバクミド DNA の分離

1. バクミドの DNA を分離するには、2880 × gで 10 分間の大腸菌細胞をスピンします。
2. 上澄みと、miniprep からセル再懸濁溶液 200 μ L にペレットを再懸濁しますを (材料表参照) キット ピペッティングにより破棄。ペレットが完全にゆく中断を必ずです。その後、1.5 mL チューブに細胞懸濁液を転送します。
3. Miniprep キットとミックスから細胞溶解液 200 μ L を追加するには、数回チューブを反転します。常温 (RT)、細胞を溶解するまで 5 分間インキュベートします。数回チューブを反転して miniprep キットとミックスから中和溶液 200 μ L を追加溶解反応を停止します。
4. テーブル トップ遠心分離機で 21,130 x gで 10 分の間回しなさい。2 mL チューブに上清の 600 μ L を収集します。600 μ L フェノール: クロロホルム: イソアミル アルコール溶液を追加 (材料の表を参照してください)、セル換散の製品の残りの部分から DNA を抽出する徹底的にミックス。
   注意: フェノール: クロロホルム: イソアミル アルコール溶液は皮膚との接触、吸入すると有毒と飲み込んだ場合。それは化学やけどを引き起こすことができ、発癌性がある可能性があります。手袋とケリの白衣を着用します。発煙のフードで働いてください。この有害廃棄物を適切に破棄します。
5. テーブル トップ遠心分離機で 21130 x gで 10 分間のチューブをスピンします。液体フェーズの 2 つが表示されます。慎重に上部の水相の 300 μ L を新しいチューブに転送します。600 μ L の DNA を洗浄し、100% エタノールを追加します。やさしくミックス チューブを転倒させます。
   注: は、バクミド DNA をせん断することができますこのようない渦をしないでください。
6. 10 分-20 ° C のフリーザーにそれらを置くことによってクール チューブはテーブル トップ遠心分離機で 21,130 x gで 10 分間回しなさい。上澄みを廃棄し、DNA の餌を保持します。
7. ペレットを洗浄する 70% エタノール 1 mL を加えます。やさしくミックス チューブを転倒させます。テーブル トップ遠心分離機で 21,130 x gで 10 分間のスピンします。上澄みを廃棄し、液体が管に表示されていない DNA の餌が半透明になるまで約 5 分、または乾燥空気にペレットを許可します。
8. 50 μ L の滅菌、DNase 自由で乾燥ペレットを再懸濁します、脱イオン水。DNA 濃度を測定します。
   注: は、バクミド DNA を凍結しないでください。数日まで 4 ° C で保存します。

3. P1 バキュロ ウイルスを生成するバクミドと Sf9 昆虫細胞のトランスフェクション

1. シード 0.9 x 10⁶適切な培地 2 mL に Sf9 細胞/ウェル (材料の表を参照してください) 6 ウェル培養プレートの各ウェルに。プレートへの愛着を促進するために 20 分の 27 ° C でセルを孵化させなさい。
   注意: 培養細胞は、潜在的なバイオハザードです。無菌技術を使用して承認された層流フードの動作推奨の防護服と実験を実行する前に廃棄物の適切な処分の制度や政府のガイドラインを確認してください。
2. 取付後のトランスフェクション試薬の 8 μ L を追加 (材料の表を参照してください)、6 のためのメディアの 100 μ L をウェル プレート生殖不能の管に導入されています。バクミド DNA の 6 μ g を別の生殖不能の管の中の 100 μ L に追加します。結合した 2 つのソリューションで 5 分間インキュベートし、室温 45 分間インキュベート
3. 6 井戸の中を新鮮な培地 2 mL に置き換えます。前の手順からそれぞれの混合物を滴下も追加 (200 μ L/ウェル)。トランスフェクション ソリューションの培地に混合できるようにプレートがみ合います。
   注: いない旋回かデタッチする細胞が生じるために、プレートを振る。
4. 5 d (120 h) のセルを 27 ° C の加湿インキュベーターで孵化させなさい。そのウイルスは細胞の大きな割合で生産されていることを確認するために収穫前に GFP 蛍光を確認します。割合が低い場合は、必要に応じてインキュベーション時間を延長 (図 1を参照)。
5. 上清含む P1 ウイルス (各ウェルから約 2 mL) を収集します。3 mL シリンジと小さな 0.2 μ m フィルターを用いた 2 mL チューブに培 P1 ウイルスをフィルター処理します。1% の最終的な集中に滅菌ウシ胎児血清 (FBS) を追加します。
   注: この株式 P1 ウイルスの 4 ° C で保存する必要があります、光から保護します。

4. Sf9 昆虫細胞 P2 バキュロ ウイルスを生成する P1 バキュロ ウイルスの感染

1. 準備 200 mL (または音量) Sf9 細胞濃度 0.8 - 適切な培地に 10 の⁶セル/mL x 0.9 (材料の表を参照してください) に十分なサイズの底が平らな三角培養フラスコで。
   注: 懸濁培養の使用量を超えないフラスコの総容量の 40%。
2. 懸濁培養細胞 Sf9 に 3.5 から P1 ウイルス ストックのデジタルラ スター比率 (v/v) を追加します。最適なウイルス発現 (タンパク質構造に応じて通常 48 120 h) 時 27 ° c 115 rpm で軌道シェーカーで孵化させなさい。
   注: 相対ウイルス表現は文化のサンプルでウイルスの GFP 蛍光を表示することによって決定できます。
3. 11,520 x gで 40 分の細胞懸濁液を遠心分離し、上清含む P2 ウイルスを収集します。使い捨て 0.2 μ m フィルターを使用して上清をフィルター処理します。FBS を最終濃度 0.5% に追加します。
   注: この株式 P2 ウイルスの 4 ° C で保存する必要があります、光から保護します。
4. Sf9easy 細胞またはウイルス カウンターを用いた P2 ウイルスの力価を取得します。

5. HEK293 細胞大規模タンパク質発現の P2 バキュロ ウイルスの感染

1. HEK293 哺乳類の細胞懸濁培養 (4-6 L 冷凍グリッドの準備のために推奨) 3.5 3.8 x の濃度での望ましい量を準備 10⁶セル/mL 表現媒体 (材料の表を参照) 1% を添加した (v/v) 滅菌 FB 困惑下部エルレンマイヤーの文化に十分なサイズのフラスコ。
   注: 懸濁培養の使用量を超えないフラスコの容量の 40%。
2. HEK293 細胞懸濁培養にステップ 4.3 から P2 ウイルス原液の 8% (v/v) を追加します。37 ° c で 135 回転軌道シェーカーで孵化させなさい。
3. 感染後 12-18 h で 10 mM 酪を追加します。最適な蛋白質の表現 (通常 36 72 h) 30 ° C での時間インキュベートします。
4. 2,880 × gで 20 分間遠心分離によって細胞を収穫します。約 100 mL 含有トリス緩衝生理食塩水 (TBS) 細胞収穫の 1 リットル当たりの再によって細胞を洗います。再び 2,880 × gで 20 分間遠心し、細胞ペレットを収集します。
   注: プロトコルはここで一時停止可能性があります。細胞ペレットをスナップ液体窒素で凍結し、浄化まで-80 ° C で保存できます。
   注意: 低温やけどや怪我、液体窒素する場合があります。それは凍傷を起こすことがあります。それは酸素を追い出して、急速な窒息を引き起こすことがあります。冷たい絶縁手袋、顔面シールドを着用します。
5. 様々 な時点で 1 mL の小さな収穫を収集し、揺動するか別の洗剤や添加剤の存在下で攪拌、4 ° C で 2 時間可溶化します。サイズ排除クロマトグラフィ (SEC) カラムに 30 μ L のサンプルとして 4 ° C および実行で 10 分の 235,000 × gで遠心によってこれらの小さい細胞可溶化されたサンプルを明らかに (材料の表を参照) に最適な時間を決定するには式は、最適な可溶化条件。
   注: hTRPC3、場合このスクリーニング含ま 4.0 9.5 50-500 mM の塩濃度からの pH 値の異なるバッファー別のイオン組成 (MgCl₂ NaCl など)。0.1 ~ 20 mM の臨界ミセル濃度 (CMC) 値と異なる洗剤ジチオトレイトールなど添加物を減らし tris(2-carboxyethyl) 燐化水素と β-メルカプトエタノール;カルシウム キレートと添加物のエチレンジアミン四酢酸 (EDTA)。

6. 凍結細胞ペレット hTRPC3 タンパク質の精製

1. 500 mM の NaCl、1 mM 特異フッ化物 (PMSF)、0.8 μ M アプロチニン、2 μ g/mL leupeptin、2 mM ペプスタチン A、20 mM トリス (pH 8.0) を含むバッファーのペレットを解凍し、100 mL の 1 リットルあたりのセルのバッファーを使用して、1% ジギトニン収穫します。解凍後、ピペット、攪拌によりソリューションの均一性を確保します。攪拌バー回転氷に没頭してビーカーの 4 ° C で 2 時間可溶化することができます。
2. 4 ° C で 1 時間 235,000 × gで遠心して細胞の残骸を削除します。SEC の列に 30 μ L のサンプルを実行することによって蛋白質の量を確認 (材料の表を参照してください) 高速液体クロマトグラフィー (HPLC) による可視化する標的タンパク質 GFP 信号出力と。
3. 4 ° C で 1-2 時間のコバルトの親和性の樹脂の可溶化されたタンパク質 (清) を孵化させなさい樹脂に結合する蛋白質を確認するには、秒の列に 30 μ L のサンプルを実行します。
   注意: 蛋白質の結合が発生した場合、フロー ・ スルーで見つからなかったカラムの GFP タグ付きタンパク質ターゲットが保持されます。したがって、GFP シグナルされません現在流れを介して高速液体クロマトグラフィーで実行するとき、ターゲット蛋白質のサイズに対応する位置にあります。
4. 10 列 (20 mM トリス、pH 8.0、500 mM の NaCl、15 mM のイミダゾールおよび 0.1% ジギトニン) バッファー量の樹脂を洗浄します。SEC の列に 30 μ L のサンプルを実行することによって蛋白質の損失を確認します。
   注: 列からの蛋白質の損失が発生した場合 GFP タグ付きタンパク質ターゲットは列以上経過した洗浄バッファーで見つかりましたが。したがって、GFP の信号は高速液体クロマトグラフィーで洗浄バッファーを実行するとき、ターゲット蛋白質のサイズに対応する位置に存在します。蛋白質の損失が発生した場合は、洗浄バッファーのイミダゾールの集中をアフィニ ティー ・ カラムに彼のタグのバインディングを中断することを防ぐために低下する必要があります。
5. バッファー (20 mM トリス、pH 8.0、500 mM の NaCl、250 mM のイミダゾールと 0.1% ジギトニン) と樹脂連結 hTRPC3 を溶出します。1:20 にトロンビンを追加 (GFP タグを切断) をモル比溶出サンプルに 10 mM EDTA (hTRPC3 の安定化剤) を追加し、4 ° C で 3 時間インキュベートSEC の列にサンプル希釈 1: 100 の 90 μ L を実行してターゲット蛋白質のサイズに対応する位置に gfp の有無確認タンパク質が溶出されてことを確認します。
   注: この時点で、溶出の総蛋白質からトリプトファンの信号も表示できます。プロファイルで同一の近くにのみターゲット アフィニ ティー精製タンパク質が溶出し、GFP に残ります、トリプトファンの信号になります。標的タンパク質が溶出で大量では見られない、フロースルーまたは洗浄を失っていた場合蛋白質は列にバインド可能性が残っているし、イミダゾールの高濃度を使用して、バッファーで溶出することができます。
6. 500 μ L に溶出液を集中または 2,880 × gで 5 分刻みで 4 ° C で回して (材料の表を参照) をチューブ 15 mL 100 K 遠心フィルターで少ない。Overconcentrating を避けるためにスピン間ソリューションを上下にピペッティングしてタンパク質を再懸濁します。
   注: ボリューム希望最終巻に近づくにつれて遠心時間が短くなります。
7. (20 mM トリス、pH 8.0、500 mM の NaCl、1 mM EDTA および 0.1% ジギトニン) バッファーの秒列に集中をロードします。実行します。
8. UV 吸光度信号によって可視化として、そのまま TRPC3 テトラマーを含有するピーク画分を組み合わせるし、少なくとも 5 mg/mL の最終的な集中に再び集中。

7. 負染色電子顕微鏡によるタンパク質のスクリーニング

1. グロー放電マシンをオンにします。タンパク質溶液の添加する前に親水性銅 400 メッシュ グリッドのカーボン被覆を作るプログラム 30 s. 実行のアルゴンと酸素を使用してカーボン コーティングのグリッドを放電するためのプログラムを設定します。
2. 設定 5 40 μ L 滅菌水滴と 2 つ 40 μ L 1% ウラニル ギ酸溶液の滴 (ラボ映画、ワックス ペーパー、または同様な表面で、材料の表を参照してください)。手順 7.1 からグリッドを取るとダークサイドに蛋白質の 2.5 μ L サンプル 5 mg/mL (50-200 μ M) を追加し、1 分に座ってみましょう。
3. 1 分後、ろ紙を使用してグリッドを乾かしてください。グリッド表面に直接フィルター ペーパーに触れないで代わりに、液体の液滴の端に用紙を持っていき、フィルター ペーパーにグリッドから液体を引っ張って、毛管作用を許可します。
4. グリッドを最初の一滴の水に浸し。ろ紙を乾燥し、水の残りの滴とギ酸ウラニルの最初のドロップを繰り返します。ウラニル ギ酸 1 分座っているの 2 番目のドロップを許可し、ろ紙を乾燥します。保存する前に完全に乾燥空気に (約 1 分) グリッドを許可します。
   注: この汚損のプロトコルは、すべてのタンパク質洗剤の組み合わせに最適なできない場合があります。ウラニル ギ酸濃度の異なる染色、上記の手順は、良好なコントラストの汚れを提供しない場合汚れ露出時間の異なる長さをテストする必要があります。
5. イメージの電子顕微鏡にグリッド (テーブルの材料を参照) 蛋白質粒子の品質をチェックします。均一分布と一般的な外観は、多数の粒子を顕微鏡写真に示すように、良いコントラストを表示およびターゲット蛋白質の予測サイズに合わせてください。
6. 予備を生成、低解像度、二次元 (2 D) 分類チェックする粒子 50-100 の顕微鏡写真 (データ処理-手順 10 を参照) を使用して単一の一貫性のある構造の異なるビューを表します。
   注: 顕微鏡写真と、上記プロトコルが蛋白質の浄化のため十分に最適化されているという強力な指標としての十分な品質の予備の 2 D クラス。準備と Cryoem グリッドのスクリーニングはこの時点で保証されます。

8. EM 試料

1. グロー放電金ホーリーファイバー カーボン グリッド (テーブルの材料を参照) 手順 7.1 で説明しました。
2. グリッド上に集中している hTRPC3 蛋白質のサンプル (5 mg/mL) の 2.5 μ L を適用します。1.5 のグリッドをしみしみを使用して s を強制的に 1 と 5 の待機時間の湿度 100%、4 ° C で s は、ガラス固化機を使用して液体窒素で冷却された液体のエタンにグリッドを突入します。
   注: 湿度、温度、しみ力、しみ時間、および待機時間のここに記載されては、著者の hTRPC3 研究¹⁹使用されました。彼らは、他の蛋白質および洗剤用最適なガラス質の氷を生成する変更する必要があります。
3. 画面がフリーズ Cryoem 顕微鏡を用いた最適な氷の条件のためのグリッド (材料の表を参照) と手動で氷の表示領域 (グリッドの正方形より小さいと暗く表示される)、氷の厚さの薄い氷 (グリッドの正方形より大きいと明るく表示される)、および媒体.
   注: さらに厚い氷の中には薄い氷はしばしばより良いコントラストと解像度を期待しながら多くの場合より粒子を保持します。氷を決定する画像の使用マニュアル スクリーニング条件良好なコントラストと解像度単分散粒子の多数の結果です。良い条件を検証すると、300 kV の低温電子顕微鏡顕微鏡画像コレクションに移動します。

9. EM データ コレクション

1. 1.074 のビン分割ピクセル サイズで超解像カウント モードで画像のスタックを記録自動収集プログラムを使用して、Å 電子顕微鏡を 300 で 130,000 X の名目倍率で kV 直接電子検出器。
2. 8 の総露光時間と 40 フレームにすべての画像を線量分別 0.2 s フレームと 6.76 e^{− − 2} Å s^{− 1} (筆者らの実験では 2.5 μ m 1.0 から様々 な名目のデフォーカス値) の線量率毎秒。

10. EM データ処理

1. 動きの補正合計映画スタック²²を実装し、デフォーカス²³データ処理ソフトウェアを使用しての値の推定 (材料の表を参照)²⁴。
2. 粒子の顕微鏡写真からを選択します。粒子を選んだこれらを使用して、ソフトウェア²⁴を使用して初期参照無料 2 D 分類を構築します。選択した理想的な 2 D クラスは、データ セット全体の自動化された粒子ピッキングのテンプレートとして使用する平均します。
3. 手動で自動ピックアップ粒子の品質をチェックし、悪い粒子を削除します。2D の分類を複数回を使用すると、選んだ粒子をクリーンアップします。
4. 初期モデル²⁵を生成します。件名 2 D は、参照モデルとして C1 対称性と 60 Å の初期復興低域通過フィルターを用いた三次元 (3 D) 分類 (約 5 クラス) に粒子を選んだ。どのクラス高解像度機能を持っているし、そのようなクラス内の粒子を組み合わせて決定します。
5. C4 対称性 (hTRPC3) の場合適用局所細分割を使用して粒子をさらに絞り込むし、粒子の配向の高解像度制限 4.5 Å の²⁶に設定します。

11 モデルの構築

1. モデルを構築する (使用しているソフトウェアの材料表を参照)。HTRPC3 の一時的な受容器の潜在的な melastatin 4 (TRPM4) の膜貫通ドメイン (TMD) を使用して、構造蛋白質のデータ ・ バンク (PDB) 5wp6 ガイド²⁷として。かさばる残基と二次構造予測を使用して、 de novo建物を進めます。
2. 二次構造拘束²⁸で実空間洗練された初期モデルを対象します。手動で洗練されたモデルを調べて、remodify (使用しているソフトウェアの材料表を参照) を必要に応じて。
3. 最終的なモデルと洗練された構造の検証 EM 地図の違いを計算するフーリエ シェル (FSC) の相関曲線を適用します。(使用しているソフトウェアの材料表を参照) 原子モデルのジオメトリを評価^29,30。

結果

表現のプロトコルの概要と hTRPC3 の精製は、図 1 aに表示されます。理想的な白人植民地、バクミド DNA 精製のために選択のような hTRPC3 バクミド板のイメージは図 1 bに表示されます。わかったその 48 h は明確な黄色 gal は、隔離されたコロニーの存在を維持しながらの染色に最適です。P2 hTRPC3 GFP 蛍光で可視化としてのウイルスの生産ピークは感染 Sf9 昆虫細胞 (図 1) の 4 d の後見られました。

P2 baulovirus 1% を添加したメディアから収穫された FBS、HEK293 細胞の懸濁液に感染するために使用します。酪酸ナトリウムが追加されたタンパク質式²⁰を後押しするウイル...

ディスカッション

低温電子顕微鏡による蛋白質の構造決定はしない蛋白質の構造決定を大きく短縮新しいカメラやアルゴリズムの開発のおかげで、過去数年間で構造生物学の分野に革命をもたらしました容易に、特に膜タンパク質結晶化します。すべての低温電子顕微鏡技術の最近の進歩にもかかわらず、高画質頻繁化を容易にするために十分な質と量で浄化された蛋白質の準備の時間がかかり、高コスト、かつ挑戦的なままです。プロトコルを上で説明するよう迅速かつコスト効果の高い高品質の生産を許可することでこのプロセスの効率を改善する急速に表現する能力、複数の遺伝子をさまざまな精製条件の下で構築画面Cryoem 研究の使用のための浄化された蛋白質。

ここで説明したメソッドによって直接よりも少ないコストで哺乳類の膜タンパク質の大量を浄化するための方法を提供しますより迅速により固定して transfected セル行の生成、多くの手順がある、それぞれの最適化する必要がするには高品質の蛋白質収量を提供します。内で生産し、hTRPC3 を浄化するために使用する生化学的手法、重要なステップとチェックポイントの数があります。最初の重要なチェックポイント...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
pEG BacMam ベクター (pFastBacI)	addgene	31488
DH10α 細胞	Life Technologies	10361-012
S.O.C. 培地	Corning	46003CR	DH10&alpha の形質転換用; Bacmid
Bacmam 培養プレート	Teknova	L5919	形質転換 DH10&α; 細胞
インキュベーションシェーカー細菌細胞用	Infors HT	Multitron standard
細胞用インキュベーションオービタルシェーカー	サーモフィッシャー	SHKE8000
リーチイン CO2 哺乳類細胞用インキュベーター	サーモフィッシャー	3951
卓上オービタルシェーカー	サーモフィッシャー	SHKE416HP	哺乳類細胞
用リーチインCO2インキュベーターに使用インキュベーター	VWR	1535	バクテリアプレート用
QIAprep スピン ミニプレップキット	Qiagen	27106	プラスミド抽出および精製用
フェノール:クロロホルム:イソアミルアルコール	DNA抽出用	Invitrogen	15593031
Sf9細胞	Life	12659017	産生昆虫細胞
Sf-900培地	Gibco	12658-027	細胞培
FBS	アトランタバイオロジカルズ	S11550
細胞トランスフェ	クション用Cellfectin II	Gibco	10362100
ポフェクタミン2000	哺乳類細胞トランスフェクション用	Invitrogen	11668-027
	VWR	28145-501	P1ウイルスろ過用
0.2mmフィルターフラスコ500ml		P2ウイルス
角マイヤー培養フラスコ(平底2L)をろ過するためのコーニング430758(平底2L)	昆虫細胞培養用	遺伝子メイト	F-5909-2000
三角培養フラスコ(バッフル2L)	哺乳類細胞培養用	遺伝子メイト	F-5909-2000B
ナノドロップ2000分光光度計	モフィッシャーND-2000
HEK293	ATCC	CRL-3022	タンパク質産生用哺乳動物細胞
フリースタイル 293 発現 培地	Gibco	1238-018	タンパク質発現用哺乳動物細胞培地
酪酸ナトリウム塩	アクロス	タンパク質発現を増幅するための	263195000
PMSF	アクロス	215740500	プロテアーゼ阻害剤
ウシ肺由来	Sigma-Aldrich	A1153-100MG	プロテアーゼ阻害剤
ロイペプチン塩酸塩	Sigma-Aldrich	24125-16-4	プロテアーゼ阻害剤
ペプスタチンA	フィッシャーサイエンティフィック	BP2671-250	プロテアーゼ阻害剤
ジギトニン	EMD ミリポア	300410	界面活性剤 - 膜イミダゾールからタンパク質を可溶化する
	Sigma	792527	レジンカラムからタンパク質を溶出させる
アフィニティー精製	TALON樹脂	Clonetech	製635504 6
列	GE	29091596;	29091597 HPLCおよびFPLC用
プロミネンスモジュラーHPLCシステム	島津	下記
コントローラモジュール	「	CBM20A
ソルベントデリバリーシステム	」	LC30AD
蛍光検出器	「	冷却
オートサンプラー	」	SIL20ACHT
			画器付きピュアFPLCシステム
	Haematologic Technologies Incorporated	HCT-0020 GFP	タグ切断用
アミコンウルトラ 15mL 100K遠心フィルターチューブ	ミリポア	UFC910008	濃縮タンパク質
EDTA	ッシャー	E478500	安定化用
400メッシュカーボンコーティング銅グリッドTed	Pella Inc.	01754-F	ネガステイン用グリッド
クアンティフォイル 穴あきカーボングリッド (金、1.2/1.3 μmサイズ/正孔スペース、300メッシュ)	Electron Microscopy Sciences	Q3100AR1.3	grids for Cryo-EM
Vitrobot Mark III	FEI		for preparing sample grids by liquid ethane freezezing
liquid nitrogen	Dura-Cyl	UN1977
ethane gas	Airgas	UN1035
Solarus Plasma System	Gatan	Model 950	for cleaning grids before.サンプル凍結
Tecnai Spirit電子顕微鏡	FEI		ネガティブステインEMイメージング用
Talos Arctica electron microsocope	FEI		オ電子顕微鏡グリッドのスクリーニングおよび低分解能イメージング用
Titan Krios 電子顕微鏡	FEI		高解像度クライオ電子顕微鏡
ソフトウェア
Gautomatchソフトウェア	http://www.mrc-lmb.cam.ac.uk/kzhang/Gautomatch/		顕微鏡写真から粒子を拾い上げる
Relion 2.1ソフトウェア	https://github.com/3dem/relion		2Dおよび3D分類を構築する
CryoSPARCソフトウェア	https://cryosparc.com/		初期構造モデルを生成する
Frealignソフトウェア	http://grigoriefflab.janelia.org/frealign		を改良するparticles
Cootソフトウェア	https://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/personal/pemsley/coot/		モデルの構築
MolProbityソフトウェア	http://molprobity.biochem.duke.edu/		原子モデルの形状を評価する
SerialEMソフトウェア	http://bio3d.colorado.edu/SerialEM/		自動シリアルイメージスタック取得用
MortionCor2ソフトウェア			合計されたムービースタックのモーション補正のための http://msg.ucsf.edu/em/software/motioncor2.html
GCTFソフトウェア	https://www.mrc-lmb.cam.ac.uk/kzhang/Gctf/	ムービースタックの焦点ぼけ値を測定するための
初期3Dモデルの実空間の微調整のための	ソフトウェア