成人再生療法のための機械的微細化

サマリー

ここでは、一連の機械的なプロセス、乳化および複数の遠心を含む脂肪組織から間質血管の一部を取得するためのプロトコルを提案する.

要約

様々 な疾患の再生ツールとなっている間質血管分数 (SVF)しかし、法律は厳密にコラゲナーゼを使用して細胞製品の臨床応用を調整します。ここでは、純粋に機械的なプロセスによって、脂肪組織から SVF 細胞と細胞外マトリックスのネイティブの注射混合物を生成するためのプロトコルを提案する.成人は遠心分離機に入れ、3 分間 1,200 x gでスピンします。中間層の収集し、二層 (下部に高密度脂肪) と上に低密度脂肪に分かれています。上位層を直接 8 x 6 x 用 20 mL/秒のレートで intersyringe シフトすることによって乳化します。乳化脂肪は 3 分間 2,000 × gで遠心分離し、油の層の下に粘着性物質が収集され、細胞外マトリックス (ECM) として定義されている/SVF ゲル。最上層に油が収集されます。約 5 mL のオイルは、高密度脂肪 15 mL に追加され、intersyringe シフト、6 x 8 x に 20 mL/秒のレートで乳化します。乳化脂肪は 3 分間 2,000 × gで遠心分離し、粘着性物質も ECM/SVF-ゲルです。ECM/SVF-ゲルのヌードマウスへの移植後、移植、収穫、組織検査によって評価。結果は、このプロダクトに通常の脂肪組織に再生成する可能性があることを示しています。この手順は、再生のための自然な支援の ECM に埋め込まれた SVF 細胞を凝縮して、シンプルで効果的な機械的解離プロシージャです。

概要

幹細胞療法は、様々 な疾患¹の代替治療を提供することがありますので、組織の修復・再生のためのパラダイム シフトを提供します。幹細胞 (例えば、誘導多能性幹細胞、胚性幹細胞) は偉大な治療可能性を秘めているが、携帯規制と倫理的配慮により制限されます。脂肪由来間葉系間質/幹細胞 (Asc) は成人と同じ制限を受けないを入手しやすいしたがって、実用的な再生医療²理想的なセルタイプをなっています。加えて、彼らは nonimmunogenic して自家脂肪³から豊富な資源があります。

現在、Asc は、脂肪組織のコラゲナーゼを介した消化によって主に得られます。脂肪組織の間質の血管分数 (SVF) には、Asc、内皮前駆細胞、血管、免疫細胞が含まれています。有益な効果があることが示された酵素によって SVF/Asc の高密度を取得、いくつかの国の法律は厳密にコラゲナーゼ⁴を使用してセル ベースの製品の臨床応用を調整します。SVF のセルを取得する 1 時間 30 分のコラゲナーゼと脂肪の消化準備し、生物学的汚染両方の外因性物質のリスクが高まります。付着性文化と日を週には、Asc、精製特定の検査機器が必要です。さらに、ほとんどの研究では、懸濁液中の SVF セルと Asc が使用します。細胞外マトリックス (ECM) または別のキャリアの保護がなければフリー セルを受けます、注入後、不良セルの保持を引き起こす、治療結果⁵を危険にさらします。これらすべての理由は、幹細胞療法のそれ以上の適用を制限します。

コラゲナーゼを介した消化せず脂肪組織から Asc を取得、遠心分離、まな板、破砕、pureeing、ミンチ、機械を含むいくつかの機械的処理は開発^6,7をされています。^,8,9します。 これらのメソッドは、成熟脂肪細胞とその油を含む小胞を機械的に破壊して組織と Asc を凝縮すると考えられています。また、動物における再生医療モデル^8,9,10として、Asc の高濃度を含むこれらの準備はかなり治療の可能性を示した。

2013 年には、Tonnardらは接木処理¹¹intersyringe による乳化成人の生産を含む nanofat を導入しました。Intersyringe シフトによって作成された剪断力は選択的に成熟脂肪細胞を破ることができます。彼らの調査結果に基づいて、我々 SVF 細胞と ECM/SVF-ゲル¹²分別された ECM だけを残して、成人の脂質と流体のほとんどを削除する純粋に機械的処理方法を開発しました。ここで、ECM/SVF-ゲルを生成するひと由来脂肪組織の機械的なプロセスの詳細について述べる。

プロトコル

この研究は、南方病院、広州、中国の倫理審査委員会によって承認されました。脂肪組織は健康なドナーから与えたインフォームド コンセントを書かれて、研究に参加する収集されました。すべての動物実験は南方病院機関動物ケアおよび使用委員会によって承認され、国民の健康および医学研究評議会 (中国) のガイドラインに従って実行されます。

1. ECM/SVF-ゲル作製

1. 脂肪を収穫します。
   1. -0.75 で直径 1 mm のいくつかの鋭い側面穴を含む 3 mm のマルチポート カニューレと人間に脂肪吸引を行う吸引圧の atm。
   2. 滅菌バッグで成人の 200 mL を収集します。
2. コールマン脂肪を準備します。
   1. 4 つの 50 mL チューブに、成人を転送でき、10 分のためにまだ立って収穫された脂肪。
   2. 転送する広い先端のピペットを使用して、最上位のレイヤーに 2 つの 50 mL チューブに脂肪を収集し、底層の液体の部分を破棄します。
   3. レイヤーを使用して 50 mL チューブ、centrifugate 脂肪 1,200 x g (RT) 室温で 3 分間。
   4. コールマン脂肪として上位層 (約 80 mL) を定義します。
   5. 全体チップ ピペットを用いて 20 mL チューブにコールマン脂肪の上部の 2/3 を転送し、低密度脂肪としてこの部分を定義します。
   6. 広い先端のピペットを使用して、別の 20 mL チューブにコールマン脂肪の下の 1/3 を転送し、高密度脂肪としてこの部分を定義します。
3. 低密度脂肪から ECM/SVF-ゲルを生成します。
   1. 低密度脂肪の 20 mL を intershift に (2.4 mm の内部の直径) とメス-メス ルアーロック コネクタによって接続されている 2 つの 20 mL の注射器を使用しています。
   2. (20 mL/秒) で安定したシフトの速度を維持し、8 x 6 x を繰り返します。
   3. Centrifugate 2,000 x gで RT 3 分のための混合物。
   4. 10 mL チューブで上油部分を収集するには、さらに使用するため常温広い先端のピペットを使用します。
   5. ECM/SVF-ゲル (図 1A)、広い先端のピペットを使用して、中間層の粘着性物質を収集し、底層流体を破棄します。
4. 高密度脂肪から ECM/SVF-ゲルを生成します。
   1. 高密度脂肪の 15 mL に 5 mL のオイル (ステップ 1.3.4 採集) を追加します。
   2. 注射器 6 間混合脂肪を intershift x 8 x までエマルジョン内で、くず繭を観察します。
   3. Centrifugate 2,000 x gで RT 3 分のための混合物。
   4. 上にオイルの部分を破棄します。
   5. 広い先端のピペットを使用して中間層 (ECM/SVF-ゲル) の粘着性物質を収集し、底層流体を破棄します。
   6. 1.3.5 と 1.4.5 の手順から ECM/SVF-ゲルを混ぜます。

2. 裸 ECM/SVF-ゲル移植モデルマウス

1. 裸のマウスの麻酔 (8 週古い、女性) とイソフルレン (1%-3%)動物の手術室で麻酔します。
2. ECM/SVF-ゲルを 1 mL の注射器に転送します。
3. 鈍的浸潤カニューレを 1 mL 注射器を接続します。
4. マウスの各側面にカニューレを皮下挿入します。
5. ECM/SVF-ゲルの 0.3 mL を注入します。

3. 組織 ECM/SVF-ゲル注入後 3、15、および 90 日の収穫

1. イソフルラン (1%-3%) を持つマウスを麻酔します。吸入麻酔。
2. 頚部転位法によるマウスを犠牲に。
3. マウスの皮膚の正中線を手術用はさみで切開を行います。
4. 解剖、マウスの両側に脂肪質の接木を収穫します。一晩常温 4% パラホルムアルデヒドで脂肪質の接木を埋め込みます。
5. エタノール濃度の増加のティッシュの水分を取り除く: 70% のエタノール、2 つの変更、1 h は、それぞれ;80% エタノール, 1 つの変更, 1 h。95% のエタノール、1 つの変化、1 h。100% エタノール, 3 つの変更、1.5 h 各;キシレン、3 つの変更、1.5 h。
6. パラフィン ワックス (58-60 ° C)、2 つの変更、2 h で組織に潜入します。
7. 組織をパラフィン ブロックに埋め込みます。約 4 μ m の厚さでセクションをカット、スライド上に置きます。

4. ヘマトキシリン ・ エオシン染色

1. I、II、および III (各 10 分)、キシレンでそれらを浸すことによってパラフィン ブロック スライドを deparaffinize します。
2. 濃度 (100%、100%、95%、80%、70%) の減少を介してそれらを渡すことによってティッシュ セクションを水分補給します。3 分間エタノール風呂。
3. 蒸留水 (5 分) の組織切片をすすいでください。
4. 5 分のヘマトキシリンで切片を染色します。
5. 1% アルコールに酸 20 分 Decolorize 水道の流水で切片をリンス (1% 70% アルコールで HCl) セクションが再び青になるまで水道水を実行している 5 s. リンス。
6. ピペットでスライドに直接染料をエオシン Y の 2 〜 3 滴を追加し、10 分間設定染料。
7. スライドを 1-5 分の水道水で洗ってください。
8. (70%、80%、95%、100%、100%) 濃度の増加でスライドを脱水します。3 分間のエタノール。
9. 5 分の I および II のキシレンのスライドをオフします。
10. メディアのマウントのスライドをマウントします。

5. 免疫蛍光染色

1. キシレンで切片を deparaffinize I、II、および III (5 分)。
2. 異なる濃度 (100%、100%、95%、95%、70%) を介してそれらを渡すことによってティッシュ セクションを水分補給します。3 分間アルコール風呂。
3. 10 分間常温メタノール 3% H₂O₂ソリューションのセクションを孵化させなさい。
4. スライド 2 を洗い 5 分蒸留水 x。
5. スライド バスケットのスライドを削除します。300 mL の 10 mM クエン酸バッファー (pH 6.0) を追加し、95 から 100 ° c 10 分のスライドを孵化させなさい。
6. RT の 20 分間のスライドをクールします。
7. スライド 2 をすすぎリン酸緩衝生理食塩水 (PBS)、5 分で x。
8. スライド上に 10% 牛胎児血清の 100 μ L を追加し、1 時間室温で加湿チャンバーで孵化させなさい。
9. 4 ° C で一次抗体溶液 (モルモット抗マウス Perilipin、1: 400) でセクションを一晩インキュベートします。
10. PBS 3 でスライドをすすぎ x、5 分ごと。
11. 二次抗体の解決セクションを孵化させなさい (ヤギ反ギニア豚 488 IgG) 室温 2 時間
12. PBS 3 でスライドをすすぎ x、5 分ごと。
13. きれいなティッシュ ペーパーのセクションの周りの水を拭き取る。
14. スライドのセクションをカバーするサークルに 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) と Alexa Fluor 488 共役 isolectin をドロップします。
15. Coverslips をマウントし、暗闇の中で乾燥させます。
16. スライドを蛍光顕微鏡で観察します。

結果

ECM/SVF-ゲルにコールマン脂肪を処理した後破棄された石油の量は最終巻の 80% とオイルの層の下で保持される脂肪の 20% だけは ECM/SVF-ゲル (図 1A) とみなされます。ECM/SVF-ゲルは 27 G 針; を通過することができます滑らかな液体のような質感しかし、コールマン脂肪は大規模な繊維と一体脂肪構造で構成されています、18 G カニューレ (図 1B) を通過することができますのみ。

移植後 3 日目、複数の細胞内脂肪滴、豊富な血管に富んだ結合組織浸潤炎症細胞と脂肪細胞を小型の多数に出演。15 日以降は、徐々 に減少に開始された炎症細胞の数と脂肪細胞が成熟し始めた。90 日でグラフト血管の結合組織のほとんどは、成熟脂肪細胞 (

ディスカッション

幹細胞を用いた再生治療法は、さまざまな病気に大きな潜在的な利点を示しています。簡単に取得し、組織の修復と¹⁵新しい組織の再生能力を持っているので、Asc、卓越した治療候補です。ただし、セルおよび⁶を処理するコラゲナーゼを分離する複雑な手続きを必要とするので、臨床応用を拡大する制限があります。したがって、コラゲナーゼを使用せず幹細胞を取得する単純な手法の開発が不可欠です。

本研究ではネイティブ脂肪 ECM によって保護されている SVF のセルを取得する脂肪組織の純粋に機械的なプロセスを提案します。さらに、このプロセスは、コラゲナーゼ無料です。前研究と比較して異なる intersyringe 回を処理および 10 mL/秒の流量で 1 分は ECM/SVF-ゲル¹²を製造するための最適なプロトコル、標準コールマン脂肪の intersyringe 処理がわかった。Intersyringe シフトを使用することにより、成人のほとんどの脂肪細胞は、...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
Alexa Fluor 488-標識イソレクチン GS-IB4	分子プローブ	I21411
モルモット 抗マウス ペリリピン	Progen	GP29
DAPI	サーモフィッシャー	D1306
ワイドチップピペット	セルトリート	229211B
共焦点顕微鏡	ライカ	TCS SP2
ヌードナイス	南医学大学	/
光学顕微鏡	オリンパス	/
50mLチューブ	コーニグ	430828
滅菌袋	ライシ	/
ミクロトーム	ライカ	CM1900
遠心分離機	Heraus