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方法論記事

病原性と線虫モデルにおけるアエロモナス感染症の病態の評価

7.4K 閲覧数

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DOI：

10.3791/58768

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2018年12月20日

 ,  ,  , 
1Institute of Basic Medical Sciences, College of Medicine, National Cheng Kung University, 2Department of Internal Medicine, National Cheng Kung University Hospital, College of Medicine, National Cheng Kung University, 3Department of Biochemistry and Molecular Biology, College of Medicine, National Cheng Kung University, 4Department of Microbiology and Immunology, College of Medicine, National Cheng Kung University

この記事について

サマリー

線虫におけるアエロモナス感染症を研究する 3 つの実験を紹介します。これらの便利なメソッドを使用して、間とAeromonas種内の毒性を評価するために簡単です。

要約

ヒトの病原体アエロモナスは胃腸炎、創傷感染、敗血症、尿路感染症を引き起こす臨床的に示されています。最も人間の病気は、細菌の種に関連する報告されている:アエロモナス ポリエステルアエロモナスより、アエロモナス サルモニシダアエロモナス dhakensis。モデル生物線虫は、アエロモナスの病原細菌を研究する優れた感染モデルを提供する bacterivore です。生存、液体毒性、筋壊死アッセイなど線虫モデルを用いたアエロモナス感染症を研究する 3 つの実験を紹介します。アエロモナスの病原性を決定する 3 つの方法の結果は安定していた。A. dhakensisは、臨床感染症の原因 4 主要アエロモナス種の中で最も毒性の高いことが示されました。これらのメソッドは、アエロモナス種内の中で毒性を評価し、アエロモナス感染症の病態の理解に貢献する便利な方法に表示されます。

概要

ヒトの病原体、アエロモナスは、胃腸炎や創傷感染、敗血症、尿路感染症1,2を引き起こす臨床的に示されています。最も関連する疾患は、4 つの細菌種に関連する報告されている:アエロモナス ポリエステルアエロモナスより、アエロモナス サルモニシダアエロモナス dhakensis 2,3,4,5.アエロモナス感染症の中で軟部組織感染症を引き起こす可能性が罹患率と死亡率の人間で。注、筋壊死軟部組織感染症6の最も深刻な形です。生存の観察、感染後線虫の筋肉壊死アエロモナスの毒性を推測する便利な方法です。

科学者は、細菌感染症を研究する多くのモデル生物を既に開発しました。従来、マウス、zebrafishes、および線虫アエロモナス6,7,8の病原性と病因を研究する動物モデルとして使用されました。すべての動物のモデルには、その ' 利点と用途。モデル生物、線虫、bacterivorous 線虫は、摂取量の細菌が foodnaturally として。線虫はその進化の過程で細菌感染に対する複雑な生得の免疫組織を開発しました。細菌感染症のストレスの下でc. の elegansは、アエロモナス6,7,9および他の病原体の病原細菌を研究する優れた感染モデルであること実証されていますのような菌10と出血性大腸菌o157: h711。ただし、アエロモナスの病原性を研究するためのモデルとして線虫を使用して方法論に焦点を当てた出版物はまだありません。

動物モデルとして線虫を用いたアエロモナス感染症を研究する 3 つの実験をご紹介: 生存、液体毒性と筋壊死のための試金。これらのメソッドは、アエロモナス種内の中で毒性を評価し、アエロモナスの病因の理解を改善する便利な方法です。

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プロトコル

1. 培地の準備

注: ソリューションの準備のための表 1 を参照してください。

  1. M9 中12を準備するには、KH2PO41.5 g、Na2HPO4、5.66 g と 500 mL の脱イオン水で塩化ナトリウム 2.5 g を溶かします。121 ° C、20 分でのオートクレーブは室温に冷却されるまで待つし、最初に使用する前に 1 M MgSO4の 0.5 mL を追加します。
  2. 線虫の成長媒体 (NGM)12を準備するには、3 g 食塩 2.5 g 細菌ペプトン、1 L の脱イオン水に 20 g の寒天を溶解します。121 ° C、20 分でのオートクレーブは、55 ° C の水浴中に冷却されるまで待機し、1 M CaCl2の 1 mL、1 M MgSO4の 1 mL、エタノール 5% コレステロールの 1 mL、25 mL のリン酸バッファーを追加します。よく混ぜて旋回。
  3. 各 6 cm シャーレに約 5 mL NGM を注ぐ。プレートの表面に泡の生産を避けるためです。1 泊と 4 ° C で保存するパッケージのため室温でプレートを残してください。使用する前に室温に戻します。
  4. 濃縮 NGM (ENGM) を準備するには、塩化ナトリウム 3 g、5 g 細菌ペプトン、1 g 酵母エキス、1 L の脱イオン水に 30 g の寒天を溶解します。121 ° C、20 分でのオートクレーブは、水浴の 55 ° C に冷却するまで待つし、1 M CaCl2の 1 mL、1 M MgSO4の 1 mL、エタノール 5% コレステロールの 1 mL、25 mL のリン酸バッファーを追加します。よく混ぜて旋回。
  5. 各 9 cm シャーレに約 10 mL ENGM を注ぐ。プレートの表面に泡の生産を避けるためです。1 泊と 4 ° C で保存するパッケージのため室温でプレートを残してください。使用する前に室温に戻します。
  6. S 中12を準備、40 mL S 基底、0.4 mL 1 M クエン酸カリウムをミックス、0.4 mL の微量金属ソリューション、0.12 mL 1 M CaCl2、1 M MgSO40.12 mL、エタノール 5% コレステロール 40 μ L と使用前に 8 mm FudR 1 mL。

2. c. の elegans6,9,12の同期

  1. 15 mL チューブに無菌純水 10 mL で大人妊娠段階で約 2,000 のワームを洗います。洗って細菌 3 x、管の下部にワームを維持ください。
  2. ワームをプルダウンする 500 × gで 1 分のサンプルを遠心します。、上清を除去し、3.5 mL の脱イオン水でワームを保ちます。
  3. 1 mL NaOCl (10-15%) とチューブ 0.5 mL 5 M 島を追加します。揺れによって均等にミックス < ワームの体を溶解へ 6 分。
  4. ワームから卵がリリースされた後、10 mL の脱イオン水、換散を停止するを追加します。卵をプルダウンし、可能な限り、上清を除去 1,200 × gで 1 分間遠心します。15 mL M9 媒体の少なくとも 3 x で洗ってください。
    注: は、手順 1.1 M9 培地の組成を参照してください。
  5. 1 mL M9 媒体に卵をしてください。1 泊 (約 12-18 h) 20 ° c の孵化のための 3.5 cm 皿に卵を輸送します。
    注: 孵化後卵孵化幼虫 (L1) の最初の段階と呼ばれる幼虫をワームにします。
  6. M9 中 L1 ワームの 10 μ L をピペットします。ワームの数をカウントし、M9 培地でワームの L1 の濃度を計算します。
  7. 最大で 10,000 の種培養大腸菌OP50 で広がる 9 cm ENGM プレートにピペットを使い、L1 虫。
    1. この手順ではスプレッド 0.5 mL はルリア ベルターニカミラ (LB) 9 cm ENGM プレートにスープとエシェリヒア属大腸菌OP50 一晩培養。16-18 h の 37 ° C でプレートを孵化させなさい
      注: 汚染を避けるためには、拡散のステップは層流フードで実行する必要があります。
    2. L1 ワームを播種する前に室温に涼しい。せいぜい 10,000 種培養エシェリヒア属大腸菌OP50 で ENGM プレートに L1 虫。
  8. 20 ° c 44 h または 4th幼虫 (L4) の段階になるまでワームを孵化させなさい。
    注:手順 1.3 ENGM 培地の組成を参照してください。ワーム L4 段階で車体側面の中で半月形に白のドットには。
  9. 同期の L4 段階次の試金でワームを使用します。野生型アエロモナス dhakensis生存線虫抗体、アエロモナス dhakensisにc. の elegans液体毒性試験の N2 のワームを使用します。RW1596 ワーム (myo-3(st386);を使用します。stEx30 [墓-3p::GFP::myo-3 + rol-6(su1006)])アエロモナス dhakensis線虫筋壊死抗体。

3アエロモナス6,9 c. の elegans生存分析。

  1. エシェリヒア属大腸菌OP50 で広がる ENGM に L1 ワームをシードの日、各 4アエロモナス菌や大腸菌OP50 流体培養基 LB 2 mL の 16 h の 37 ° C でそれぞれの文化の単一コロニーを拾います。
    注:汚染を避けるためには、層流フードでこの手順を実行する必要があります。ここでは、以下の菌株を用いて:エシェリヒア属大腸菌OP50、 C. elegans の通常の食品のソース。A. dhakensis AAK1、最初完全にシーケンス病原性臨床A. dhakensisを分離します。A. サルモニシダA2 066、 A. よりA2-007、およびA. ポリエステルA2-9307121 は、国立チェン Kung 大学病院から代表して臨床分離株です。
  2. 細菌の流体培養基の OD600吸光度を測定し、調整外径600に細菌の流体培養基 LB のスープと 2.0 を =。
  3. スポットし、広がる細菌の流体培養基の 30 μ L 各 6 cm NGM プレート。一晩常温でプレートを文化します。
    注:手順 1.2 NGM 培地の組成を参照してください。
  4. L4 段階に成長する L1 ワーム日ランダムにピックアップし、50 ワームを各 4アエロモナス菌またはエシェリヒア属大腸菌OP50 で NGM プレートに転送します。
  5. 分析が完了するまでは、20 ° C で NGM プレートを孵化させなさい。
  6. すべてのワームは、生きている細菌との番号生きて、死んで、カウント センサー ワームと新規に準備した NGM 板最後のワームがデッドになるまで毎日に転送します。
    注:滅菌のワームを使用して場合でも、感染の維持のため、毎日新鮮な準備 NGM プレートにワームを転送 (例えば、glp 4、または FudR)。
  7. 毎日のデータ計算に基づく生存曲線をプロットします。

4.アエロモナス7 c. の elegans液体毒性アッセイ

注:汚染を避けるためには、層流フードの手順を実行する必要があります。

  1. エシェリヒア属大腸菌OP50 で広がる ENGM プレート L1 ワームを播種後日は LB スープ 16 h の 37 ° C で 4アエロモナス菌と大腸菌OP50 と 5 mL の文化のそれぞれ単一コロニーを拾います。
    注: プロトコルでは、次の菌株を用いて:エシェリヒア属大腸菌OP50、 C. elegans の通常の食品のソース。A. dhakensis AAK1、最初完全にシーケンス病原性臨床A. dhakensisを分離します。A. サルモニシダA2 066、 A. よりA2-007、およびA. ポリエステルA2-9307121 は、国立チェン Kung 大学病院から代表して臨床分離株です。
  2. 菌液の OD600吸光度を測定します。
  3. 流体培養基 LB を削除する 15 分間 3,500 x gで細菌の流体培養基を遠心します。細菌を再懸濁し、OD600に細菌の流体培養基を調整 = 3.0 S 媒体。96 ウェル プレートの少なくとも 8 井戸に S 培地で細菌の流体培養基の 195 μ L を追加します。
    注:手順 1.6 S 培地の組成を参照してください。
  4. M9 媒体を用いた大腸菌OP5 を ENGM 板 L4 ワームを洗浄します。Μ L あたり 5 ワームの濃度に worm ソリューションを調整し、96 ウェル プレートの各ウェルに worm ソリューションの 5 μ L を追加します。ウェルあたり約 25 ワームがあることを確認します。
  5. 25 ° C で 200 rpm でシェーカーの 96 ウェル プレートを孵化させなさい
  6. 24、48、および 72 h は次の式の各ウェルの生存率を計算後、ライブ ワーム、死んでワームの数をカウント: (ライブ ワーム/総ワーム) × 100%。
  7. 毎日のデータの計算と、散布図グラフを描画します。

5. c. の elegans筋壊死アッセイアエロモナス6

注:汚染を避けるためには、層流フードでこれらの手順を実行する必要があります。

  1. エシェリヒア属大腸菌OP50 で広がる ENGM のシードが L1 ワームの日に、4 つのアエロモナス菌と大腸菌OP50 と各 16 h の 37 ° C で 2 mL LB のスープと文化のそれぞれのシングル コロニーをピックアップします。
    注:ここでは、次の菌株を用いて:エシェリヒア属大腸菌OP50、 C. elegans の通常の食品のソース。A. dhakensis AAK1、最初完全にシーケンス病原性臨床A. dhakensisを分離します。A. サルモニシダA2 066、 A. よりA2-007、およびA. ポリエステルA2-9307121 は、国立チェン Kung 大学病院から代表して臨床分離株です。
  2. 菌液の OD600の吸光度を測定し、OD600細菌スープを調整 = 流体培養基 LB の 2.0。スポットし、6 cm NGM プレートに細菌の流体培養基の 30 μ L を広めます。一晩常温でプレートを文化します。
  3. 当日 L1 ワーム 4アエロモナス菌や大腸菌OP50 のそれぞれに各 NGM プレートに転送 50 ワーム L4 段階に成長します。20 ° C で NGM 版を孵化させなさいワームのすべての 24 h を細菌と新規に準備した NGM プレートに転送します。
  4. 蛍光顕微鏡を用いた筋画像を取る。
    1. ランダムにスライド M9 培地 2% アガロースゲルに 10 ワームを選択します。画像を撮影する前に 5 分以内の agarose M9 培地アジ化ナトリウム 1% の 2 μ L を使用してワームを麻痺させます。
    2. カバー スリップを置き、緑の蛍光蛋白質 (GFP) フィルター蛍光顕微鏡を用いた電荷結合素子カメラで筋肉画像をキャプチャします。24、48、72 時間後、L4 期で筋肉画像をキャプチャします。
  5. 画像処理ソフト、画像解析および図の準備を行います。
    注:スコアと筋損傷レベルの定義はに示す図 3の条件は次のように記載されて: 不足している筋線維の 3 ポイント破裂または壊れた筋の線維の 2 点曲がっている筋線維の 1 ポイント健全な筋線維の 0 点。

6. 統計解析

  1. すべての実験 3 回の最小値を独立して実行します。
  2. カプラン ・ マイヤー法線虫サバイバル法を評価するために、生存率の違いを分析ログランク検定を使用します。0.05 で統計的有意性を設定します。
  3. スチューデントの t 検定を使用して、2 つの異なるグループにc. の elegans液体毒性の試金の統計結果を分析します。1 つの独立変数の 3 つまたは複数の値の間の差異を分析の一方通行 ANOVA テストを使用します。0.05 で統計的有意性を設定します。

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結果

上記で説明したプロトコルに従うことによって 4アエロモナス系統から毒性を区別するために簡単です。図 1にc. の elegansの生存分析を示します。フエレット、高から低の順に示すように感染している線虫の生存率: A. ポリエステル、A. より、A. サルモニシダ、 A. dhakensis。毒性の間で、アエロモナス種内多様性が、線虫の生存率は平均では、 A. dhakensisに感染しているワームの間で最高の死亡率を示した。A. サルモニシダの病原性は、 A. dhakensis (p < 0.01) に劣っていた.A. dhakensisとa. サルモニシダと対照をなしてA. よりのA. ポリエステル弱毒内接はc...

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ディスカッション

線虫は bacterivorous 線虫、自然食品として摂取菌し、その進化のプロセスの中に細菌を複雑な免疫を開発しました。表皮および腸の9,13主要な臓器を維持し、免疫力をサポートします。表皮と線虫の筋肉のバンドでは哺乳類と人間6軟部組織の構造に似ています。これらの特性により、線虫、アエロモナス感染症の病態を研究するためのモデル生物として適用されます。

臨床的観察74アエロモナス種間多様な毒性の代表と相関している線虫におけるアエロモナス感染症を調べるための 3 つの方法を紹介します。これらの便利なメソッドを区別アエロモナス種のなかでも毒性の程度が異なる。これらのメソッドを使用して、研究者はアエロモナス種の病原性、...

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開示事項

著者が明らかに何もありません。

謝辞

線虫中核施設診断微生物学、台湾からの支援に感謝しており、抗菌抵抗研究所の国立チェン Kung 大学病院アエロモナスを提供するための分離します。また、線虫の遺伝学センター (CGC) や、WormBase を認めます。我々 はまた、原稿を編集 Savana ムーアを感謝します。

本研究はパ陳に科学省と台湾の技術 (最も 105-2628-B-006-017-MY3) 国立チェン Kung 大学病院 (NCKUH-10705001) からの助成金によって部分的に支えられました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
シェーカーインキュベーターYIH DERLM-570Rバクテリアインキュベーション
K2HPO4J.T.BakerMP021519455培地調製 
KH2PO4J.T.Baker3246-05培地調製 
Na2HPO4J.T.BakerMP021914405培地調製 
NaClSIGMA31434培地の準備 
MgSO4SIGMAM7506培地調製 
寒天Difco214530培地の準備 
CaCl2SIGMAC1016培地調製 
コレステロールSIGMAC8503培地調製 
エタノールSIGMA32205培地の準備 
KOHSIGMAP5958培地調製 
6 cm ペトリプレートALPHA PLUS46寒天プレート
96 ウェルプレートFALCON353072液体アッセイ
細菌ペプトンAffymetrix/USBAAJ20048P2培地の準備 
酵母エキスSIGMA92144培地調製 
クエン酸&ブル;H2OSIGMAC1909培地調製 
クエン酸トリカリウム&ブル;H2OSIGMA104956培地調製 
FudR SIGMA1271008培地調製 
EDTASIGMAE1644培地二ナトリウム 
FeSO4•7 H2OSIGMA215422培地調製 
MnCl2•4 H2OSIGMA221279培地調製 
ZnSO4•7 H2OSIGMA204986培地調製 
CuSO4•5 H2OSIGMAC8027培地調製 
トリプトンSIGMA16922培地調製 
顕微鏡システムニコン エクリパーゼTi反転 顕微鏡イメージング
科学用CCDカメラQImaging レティガ-2000R ファスト 1394 顕微鏡イメージング

参考文献

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