方法論記事

生きている細胞の単一テロメアから表現されるテロメア繰り返し含む RNA テラを視覚化するがん細胞クローンの生成

DOI：

10.3791/58790

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2019年1月17日

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1Laboratory of Cell Biology and Molecular Genetics, Department of Cellular, Computational and Integrative Biology - CIBIO, University of Trento, 2Department of Life Sciences, University of Trieste

この記事について

サマリー

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ここでは、単一 subtelomere で MS2 シーケンス タグを含む癌細胞のクローンを生成するためのプロトコルを提案する.MS2 GFP システムに依存して、このアプローチは、内因性の転写産物のテロメア繰り返し含む RNA (テラ) 生きている細胞の単一テロメアから表現の可視化を実現。 にします。

要約

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テロメアは、転写、テロメア長鎖非コード Rna (テラ) の繰り返しを含むに上昇を与えるテロメア生物学、ヘテロクロマチン形成とテロメアの長さの恒常性などで重要な役割を果たしているが提案されています。最近の知見では、テラの分子はまたマウス胚性幹 (ES) 細胞における遺伝子発現を調整するために内部の染色体領域と対話することを明らかにしました。この証拠に沿った RNA 蛍光の in situハイブリダイゼーション (RNA 魚) 分析サブセットのみが示されている染色体の両端にテラのトラン スクリプトをローカライズします。テラ分子のダイナミクスの理解は、彼らの機能と作用機構を定義に役立ちます。ここでは、ラベルし、MS2 GFP を用いた癌細胞の単一テロメア テラ転写物を可視化する手法について述べる。この目的に単一の subtelomere で統合 MS2 シーケンスを含んでいる AGS ヒト胃がん細胞ラインを使用して安定したクローンを生成するプロトコルを提案します。MS2 タグ テロメアからテラの転写は、GFP (MS2 GFP) を融合した MS2 RNA 結合タンパク質の共発現時に生細胞の蛍光顕微鏡による可視化 MS2 タグ テラ分子の発現の結果します。このアプローチにより、癌細胞の単一テロメア テラ分子のダイナミクスを研究する研究者とその他の細胞に適用できます。

概要

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染色体の subtelomeric 領域から長鎖非コード RNA テラを転写し、その転写染色体はテロメアの繰り返し管1,2内終了終了へ向かって。このため、テラの成績証明書は 5' 端に subtelomeric の派生シーケンスから成り、テロメアの繰り返し (脊椎動物の UUAGGG)3で終了します。重要な役割は、テロメア4,5, DNA 複製6、染色体の間での相同組換えの促進のヘテロクロマチン形成を含む終了する7,8テラ、提案されています。,9、テロメア構造10およびテロメアの長さの恒常性2,11,12,13を規制します。さらに、テラの成績証明書は、マウス胚性幹 (ES) 細胞14における広範な遺伝子発現を調節する多数の extratelomeric サイトと対話します。これらに伴い、RNA 蛍光性の現場の交配 (RNA 魚) 解析はテラ成績のサブセットのみを示している証拠はテロメア1,2,15ローカライズします。さらには、テラはマウス細胞2,16の X および Y 染色体でローカライズする原子集合体を形成する報告されています。テラ成績が核内の複雑なダイナミクスを受けることが示唆されました。テラ分子のダイナミクスを理解し彼らの機能と作用機構を定義するのに役立ちます。

MS2 GFP システムは、広く様々 な生物17,18から細胞内 RNA 分子を可視化するために使用されています。このシステムは、タグを出芽酵母12,19のシングル テロメア テラ分子を可視化する以前使用されています。このシステムを使用すると、最近、酵母テラ成績証明書をポスト発酵から呼吸へシフト フェーズでローカライズ細胞質内テラ可能性がありますにおける核外機能20を及ぼすことを示唆しているが示されました。最近がん細胞21シングル テロメア テラ トラン スクリプトを勉強する MS2 GFP システムを使いました。この目的には、MS2 単一テロメア (テロメア 15q、以下 Tel15q) でシーケンスを統合する CRISPR/Cas9 ゲノム編集ツールを採用し、MS2 タグ内因性 Tel15q テラ (テラ MS2 クローン) の表現のクローンを得た。認識し、生活で単一テロメア テラ成績の MS2 RNA シーケンスにより可視化を結合する GFP 融合 MS2 RNA 結合タンパク質 (MS2 GFP) の共発現細胞21です。ここに示されているプロトコルの目的は、テラ MS2 クローンの生成のために必要な手順の詳細に説明することです。

テロメア 15q、subtelomeric 地域で統合され、MS2 カセット テラ MS2 のクローンを生成するテラ プロモーター領域と転写開始部位の下流。MS2 カセットには lox p サイトに挟まれたネオマイシン耐性遺伝子が含まれています、subtelomere 15q での統合は、CRISPR/Cas9 システム22を使用して実行されます。カセット、単一クローン MS2 のトランスフェクションが選択され PCR によってカセットの subtelomeric 統合が確認されたら、DNA 配列と南部のしみ。肯定的なクローンは、subtelomere 15q で単一 lox p サイト MS2 シーケンスだけを残して、カセットの選択マーカーを除去するために Cre を発現アデノ ウイルスに感染しています。RT qPCR により Tel15q からタグ付きの MS2 のテラの式を確認すると.最後に、MS2 GFP の融合蛋白質を表現に蛍光顕微鏡による MS2 テラ成績を視覚化するためにレトロ ウイルス感染テラ MS2 クローンで。RNA 魚でテラの成績証明書を容易に検出できるし、テロメア繰り返し固有を使用して生細胞イメージング プローブ1,2,15,23。これらのアプローチは、単一セルの解像度でテラ分子の総人口の局在に関する重要な情報を提供します。単一 subtelomere で MS2 シーケンスを含んでいるクローンの生成には、関数とテラの作用のメカニズムを定義する生きた細胞の単一テロメア テラ転写物のダイナミクスを研究する研究者が有効になります。

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プロトコル

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1。ネオマイシン耐性クローンの選択

  1. 10% 胎仔ウシ血清 (FBS)、2 mM L グルタミン、ペニシリン (媒体の mL あたり 0.5 単位)、37 ° C、5% CO2でストレプトマイシン (媒体の mL あたり 0.2 μ g) とハムの F-12_K (Kaighn) 培の AGS セルを育てます。SgRNA/Cas9、1:10 でベクトルと MS2 カセットを表現すると 50-60% の合流点で細胞を transfect モル比21。
    注: 並列実験 gfp 発現するベクトル (すなわち、 Cas9 GFP のベクトル) を株で遺伝子導入効率を確認します。少なくともトランスフェクション効率は 60-70% を達成する必要があります。
  2. 次の日は、ネオマイシン 0.7 μ g/mL 最終濃度 (選択培地) を含む培地で培養培地を置き換えます。
    注: セルを分割、トランスフェクションは、選択プロセスをスピードアップする翌日の選択培地でそれらを播きます。すべての非トランスフェクト細胞がすぐに死んでしまいます。6 ウェル プレートでトランスフェクションを実行、する場合、その場合 60% で合流含まれます約 0.7 x 10 の6セル 10 cm 皿含む選択培地に単一の井戸からセルを分割することができます次の日に。
  3. 媒体ごとに 1 つの変更 7-10 日間、選択培地で細胞を維持または 2 日間、単一のクローンを作成するまでが表示されます。
  4. 細胞クローンのピッキング
    1. 各ウェルに 0.25% トリプシンの 10 μ L を含む 96 ウェルのプレートを準備します。
      注: 準備 2 96 ディープウェル プレートの場合よりも 96 クローンが選ばれると予想されます。
    2. 顕微鏡を使って、各クローンの位置表示でマーク 10 cm 皿ドット マーカーを使用して皿の下部にすることによって。各ドットは、選ばれるコロニーに対応します。
    3. 交換して養殖中とだけで十分なリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) クローンの液体の薄いフィルムを形成し、細胞クローン選択時に乾燥をさせてください。
    4. 10 μ L ピペットを使用して単一コロニーを拾います。植民地にトリプシンの 5 μ L を含むヒントを添付し、植民地にローカライズされた残りますトリプシンをゆっくりと解放します。1 分のセルをデタッチし、先端でコロニーをこすりし、先端にそれを吸うにトリプシンを許可します。
      注: この手順中に選ばれているコロニーのまわりの PBS の容積を減少する植民地周りトリプシンを希釈を避けることによってピッキング処理を助ける 1 つの側面で少し料理を反転しています。クローンのリングの使用はまた単一クローンを拾うを助けるかもしれない。
    5. 植民地から 0.25% トリプシンの 10 μ L を含む 96 well プレートのウェルにセルを配置します。
    6. 室温で 5 分間インキュベートし、150 μ L の選択培地 (ハムの F-12 K (Kaighn) 中 10 %fbs、2 mM L グルタミン、ペニシリン (0.5 mL 中の単位)、ストレプトマイシン (媒体の mL あたり 0.2 μ g) で補われ、含む、ネオマイシンと井戸を埋める0.7 μ g/mL の濃度です。
      注: 培養時間の間に他のクローンを選ばれることができます。可能な限りとして多くのクローンを選択することをお勧めします。多くのクローンを選んだほどチャンスは肯定的なものを識別するでしょう。
    7. すべてのクローンが選ばれ、96 well プレートに転送、選択培地 10 %fbs、2 mM L グルタミン、ペニシリン (0.5 mL 中の単位)、ストレプトマイシン (1 mL あたり 0.2 μ g のハムの F-12 K (Kaighn) 培で数日間、成長する細胞を許可します。媒体) の 90% の合流点に到達するまでの 37 ° C、5% CO2で 0.7 μ g/mL の濃度でネオマイシンを含んでいます。
  5. クローンの分割
    1. 3 つの準備追加 100 μ L/ウェル、ゼラチンのゼラチンでコーティング 96 ウェル プレートは、室温で 30 分間インキュベートし、PBS で 2 回を洗浄します。これらのプレートは、クローン (凍結板) を凍結、DNA 抽出 (DNA プレート) のために使用されます。
      注: ゼラチン添付ファイル、細胞や DNA の井戸を推進していきます。特にゼラチン コーティングは、DNA 抽出中に井戸の下部に固執し、手順 (後述) を洗浄する DNA になります。クローン分割処理中にマルチ チャンネル ピペットを使用することをお勧めします。
    2. クローンが 90% の合流点に達すれば、96 well プレートの各ウェルから培地を吸引、PBS で洗浄、好評につき、0.25% トリプシンの 30 μ L を追加し、37 ° C で 5 分間インキュベート
      注: クローンはクローンあたり選んだセルの数に依存、また異なる速度で成長します。したがって、このステップを異なるクローンが 90% の合流点に達するといくつかの日の間に行います。
    3. 70 μ L/ウェル選択培地を追加し、井戸の中を上下にピペッティングにより細胞を混乱させる、120 μ 糊凍結板事前ウィットによく、30 μ L あたり選択培地が充填された糊の DNA プレートに 100 μ L の 30 μ L を転送h 50 μ L 中、選択。
    4. インキュベーターで DNA のプレートを置き、細胞は、37 ° C、5% CO2 90% の合流点までいく。
    5. 凍結プレートの各ウェルに冷たいの 80 μ L たて凍結中 (80 %fbs と 20% ジメチルスルホキシド (DMSO)) x 2 を追加、各ウェルのシール、上に蓋を置き、アルミホイルでプレートをラップするので板の上にパラフィルム (70% エタノールを散布) を追加します。 -80 ° C で凍結のプレートを配置します。
    6. 分割されてくださいが、PCR のスクリーニング結果まで文化おいてクローンを含む元の 96 ウェル プレートに 90 μ L/ウェル選択培地を追加します。このプレートは、プレートのバックアップとして使用されます。

2. ネオマイシン耐性クローンのスクリーニング

  1. 96 ウェル DNA プレートからの DNA の抽出。
    1. DNA プレートで培養したクローンが 90% の合流点に達すれば、PBS で 2 回を洗浄し、50 μ L 換散バッファー (10 mM Tris pH 7.5、10 ミリメートルの EDTA、10 mM の NaCl、0.5 %sds および 1 mg/mL, プロテイナーゼ K) で溶解します。パラフィルム プレート カバー、シールふた、各ウェルに、サランラップでカバー、37 ° C で一晩します。
    2. 冷たいエタノール (エ-オハイオ州) を 100 μ l 添加/食塩 (100% エタノールで 0.75 M の NaCl) それぞれによく、6 時間または一晩室温を沈殿させます。
      注: プロトコルはここで一時停止することができます。
    3. プレートを反転エ-オ/食塩を削除し、ウェルあたり 70% エタノール 200 μ L で 3 回を洗浄します。
    4. 蒸留水で RNAse A 溶液の 25 μ L を追加し、37 ° C 1 時間インキュベートします。
  2. PCR の拡大のため、ゲノム DNA の 3 μ L を使用します。ネオマイシン耐性遺伝子と subtelomere 15q 内アニールするプライマーを使用して選択されたクローンの PCR のスクリーニングを実行します。標準のポリメラーゼの酵素と PCR プロトコル21を使って PCR 増幅を行います。
    注: MS2 プライマー (MS2-subtel15q-プライマー-S および MS2 としてプライマー) とプライマーのクリック率 (CTR プライム S と CTR プライマーとして) のための PCR 条件は、次のよう: 98 ° C、20 変性のステップと、98 ° C 10 s、58 ° C 20 s 72 ° C 15 s、34 サイクル s、ポリメラーゼの酵素を 25 μ L で反応ミックス (材料の表を参照してください)。プライマー シーケンスは、表 1に示されます。
  3. Agarose のゲルの PCR の反作用を実行し、標準的なゲル抽出プロシージャ (ゲル抽出試薬、材料表を参照) を使用して肯定的なクローンから得られる PCR バンドを抽出します。
  4. MS2 シーケンス21の存在の確認のためゲル抽出 PCR の製品の DNA シーケンス解析を実行します。
    注: シーケンス解析は PCR のスクリーニング用プライマーを使用して実行できます。
  5. 南しみ PCR 陽性クローンのスクリーニング
    1. クローンを PCR とシーケンス スクリーニング元 96 well プレート (バックアップ プレート) から 10 %fbs、2 mM L グルタミン、ペニシリン (0.5 mL 中の単位)、ストレプトマイシン (あたり 0.2 μ g を添加したハムの F-12 K (Kaighn) 中 6 ウェル プレートを肯定的な成長します。媒体の mL)、37 ° C 5% CO2で 0.7 μ g/mL の濃度でネオマイシンを含みます。
      注: また、これらのクローンのいくつかが失われている場合それらを解凍凍結板 (プロトコル 2.6 を参照) のいずれかから。
    2. クローンは、90% 合流 6 ウェル プレート、PBS のセルを洗浄して、まあ当たり 0.5 μ g, プロテイナーゼ K を含む換散バッファーの 250 μ L を追加します。
    3. 細胞スクレーパーを使用して細胞をこすりし、1.5 mL チューブのライセートを転送します。
    4. 16 h の 37 ° C で孵化させなさい。
    5. 100% エタノール 1 mL を追加し、積極的に振るし、沈殿する少なくとも 2 時間または-20 ° C で一晩に DNA を許可します。
      注: プロトコルはここで一時停止することができます。
    6. 13,400 x g で 10 分間の 4 ° C で回転、上澄みを廃棄し、70% エタノールでペレットを洗浄します。常温乾燥ペレット空気をみましょう。また、真空濃縮を使用します。
    7. RNAse A を含む蒸留水 50 μ L の DNA ペレットを再懸濁します、37 ° C で 1 時間インキュベート
    8. 37 ° C で分解反応を一晩インキュベートし 100 μ L 反応体積に NcoI および病原の制限酵素 (2 つの独立した消化力) を用いたゲノム DNA の 5-10 μ g を消化します。
    9. 完全な消化力確認のための agarose のゲル (0.8% の agarose) の消化の 4 μ L を実行します。
    10. 制限消化反応するナトリウム酢酸 3 M ソリューション pH 5.2 と 2 100% エタノール量の 1/10 ボリュームを追加および少なくとも 2 時間孵化させなさいまたは DNA を沈殿させる-20 ° C で一晩します。
      注: プロトコルはここで一時停止することができます。
    11. 20 分の 4 ° C で 13,400 × g で遠心分離、培養上清を破棄し、70% エタノールでペレットを洗浄します。室温で空気ペレット乾燥を許可します。また、真空濃縮を使用します。
    12. 20 μ L の蒸留水でペレットを再懸濁します、0.8% の agarose のゲルの消化の DNA を読み込みます。
      注: 消化の DNA に優れた解像度のゲル、少なくとも 15 cm を長い準備し、低電圧 (̴30 ボルト) で一晩を実行します。電気泳動の設定を最適化してください。
    13. 次の日、室温で 30 分間、1 μ L/10 mL 最終濃度でエチジウム ブロマイドなどの DNA ラベリング剤ゲルを染色し、イメージング計測器ゲルのゲルに近い支配者と写真を撮る。
    14. ナイロン膜に DNA の転送を設定し、シーケンス固有の MS2 プローブ標準手順21を使用して膜の交配を実行します。
    15. 雪解けの PCR、DNA 配列と南部で肯定的なクローン (次のステップを参照)、2 つの凍結プレートの 1 つからのしみ。
  6. クローンの融解
    1. 5 mL に予め温めておいたハム F の - 12 K を含む 1 つの 15 mL チューブを準備 10 %fbs、2 mM L グルタミン、ペニシリン (0.5 単位中の mL) 解凍する各クローンのストレプトマイシン (媒体の mL あたり 0.2 μ g) と培 (Kaighn)。
    2. -80 ° の冷凍プレートの 1 つを削除し、よく解凍する肯定的なクローンを含んでいる、予め温めておいた F12K 完全培地の 100 μ L を追加します。
      注: この手順をすぐに実行する必要があります、96 well プレートは、冷凍のままに他のクローンを許可するために、各クローンを解凍後ドライアイスに配置必要があります。これは複数のクローンが同じ 96 well プレートから解凍する必要がある場合に特に重要です。
    3. 5 mL 中、室温で 5 分間 800 × g で遠心分離を含む 15 mL チューブにセルを転送します。
    4. 培地を吸引、予め温めておいた完全 F12K 培地の 500 μ L の細胞を再懸濁し、各クローンを 12 ウェル プレートの単一の井戸に転送します。
  7. MS2 カセットからネオマイシン耐性遺伝子の除去は、subtelomere 15q で統合されています。
    1. 12 ウェル プレートから完全 F12K 培地に 10 cm 皿に成長するクローンを許可します。
      注: ネオマイシンは、特に明記しない限り、メディアに含まれませんください。
    2. 70% 完全 F12K 培地 10 mL に合流で 10 センチメートルの皿で培養細胞に Cre を発現アデノ ウイルスを追加します。
      注: Cre GFP 発現アデノ ウイルスを使用すると、100% に近づく必要があります感染効率の評価ができます。文化のいくつかの文章の後、レプリケーション欠陥アデノ ウイルスは失われます。
    3. 感染後 48 時間は、3品 10 cm のセルを分割します。ネオマイシン含有細胞の成長、負の淘汰によるネオマイシン遺伝子除去の検証のため 2 つの料理をされる媒体 (最初の皿)、および南によるしみ (2 番目の料理)。
    4. 細胞凍結および RNA の抽出のためのクローンを含む 3 番目の料理を文化します。

3. RT qPCR でテラ MS2 転写式の検証

  1. ネオマイシン遺伝子除去の検証時に有機溶剤 (フェノール及びグアニジン isothiocynate ソリューション)21を使用してテラ MS2 クローンからの総 RNA の抽出を実行します。
    1. ジエチル pyrocarbonate (DEPC) 水の 100 μ L の 10 cm 皿から抽出した RNA を再懸濁します。
    2. 3 μ L の RNA を濃度分配 (1% ホルムアルデヒドを含む) 1 x 3-(N-Morpholino) propanesulfonic 酸 (モップ) ゲルの濃度および RNA の整合性を検証するために実行します。また、分光光度計を用いた RNA 濃度を分析します。
    3. 私は DNAse の 1 単位を使用して DNAse で RNA の 3 μ g を扱う私 60 μ L 反応量の酵素。
    4. 37 ° C で 1 時間反応を孵化させなさい
  2. 逆に転写反応と qPCR 解析
    1. ヌクレアーゼ フリー微量遠心チューブに次のコンポーネントを追加: 1 μ M テラ プライマー、dNTPs ミックス (10 mM) の 1 μ L、6 μ L (̴300ng RNA に対応する) DNAse I 処理した RNA の 2 μ L。4 μ L の DEPC 水 13 μ L にボリュームを調整します。
      注: 各 Rna 分析するのに、同じ試薬がテラ プライマーの代わりに、参照特定のプライマーを含む 2 番目の管が準備されるべき。
    2. 65 ° C 5 分の混合物を加熱し、少なくとも 1 分氷で孵化させなさい。
    3. 簡単なの遠心分離によって管のコンテンツを収集し、5 X RT 酵素バッファー、1 μ L 0.1 M ジチオトレイトール (DTT) 1 μ L (4 単位) の RNAse 阻害剤と逆転写酵素の 1 μ L の 4 μ L を追加 (材料の表を参照してください)。
    4. 60 分、42 ° C でサンプルをインキュベートし、qPCR 解析の RT の反作用の 2 μ L を使用します。
  3. 2 x qPCR マスター ミックス、cDNA テンプレート 2 μ、1 μ L 前方プライマー (10 μ M)、逆プライマー (10 μ M) の 1 μ L と水の 6 μ L の 10 μ L の 20 μ L の最終巻の qPCR 反応混合物を準備します。
  4. 21標準のプロトコルを使用してたちの qPCR 反応を実行します。

4. MS2 GFP 表現するレトロ ウイルスの生産

  1. レトロ ウイルスというベクター (pBabe MS2 GFP プーロ) とモル比の 4:1 を使用して (pCMV VSVG) などのベクトルを表現するenv遺伝子を表現する MS2 GFP の融合蛋白質の 80% コンフルエント フェニックス パッケージング細胞を transfect MS2 GFP 発現するレトロ ウイルスを生成するには2 つのベクトル。
  2. 次の日に新鮮な媒体含む 10 mM ナトリウム酪で、培養培 (DMEM 10 %fbs、2 mM L グルタミンとペン/連鎖球菌) を置き換えます。
  3. 37 ° c、5% CO2、8 時間インキュベートし、そこからウイルスが収集されます新鮮な培養培地で媒体を交換します。
  4. 48 時間後に、フェニックス細胞からレトロ ウイルス含有培地を削除します。この媒体テラ MS2 クローンの感染に直接使用することができます、その場合 0.45 μ m のフィルターを通してメディアをフィルター、polybrene (30 μ g/mL 最終濃度) を追加、(この場合はプロトコルはステップ 5 に引き続き) のセルに追加。また、レトロ ウイルスは、回転ホイールに 4 ° C で一晩インキュベートを 50 %peg-8000/900 mM の NaCl 水溶液の 1/5番目のボリュームを追加して 50 mL の隼のチューブで沈殿できます。
  5. 次の日、30 分間 2,000 × g で遠心分離によるペレット レトロ ウイルス粒子に培養上清を取り外して血清なし F12K 中でペレットを再懸濁します。
    注: ウイルス粒子は元の培養上清中のボリュームの 1/100thで再停止することができます。レトロ ウイルスが細胞を効率的に感染するために必要な最小限の量を確認するために感染実験を行わなければなりません。

5. 生きている細胞のテラ MS2 転写物の可視化

  1. テラ MS2 クローンとガラス底の料理の WT AGS 細胞をプレートします。感染日中 (30 μ g/mL 最終濃度) ・ MS2 GFP 発現するレトロ ウイルスに polybrene を追加します。
  2. 24 時間後にウイルスを含んだ培地を除去し、新鮮な培地 - フェノールレッドなしを追加します。
  3. 適切な顕微鏡の設定を使用して倒立顕微鏡で細胞を分析します。100 X のセルや大開口 (1.4 倍) と敏感なカメラ (EMCCD) を使用して 60 の X 目的をイメージします。イメージング中に 37 ° C および 5% の CO2のサンプルを維持するのに環境制御システムを使用します。

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結果

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図1は、実験的戦略の概要を表します。プロトコルとテラ MS2 AGS 細胞クローンの生成を示すタイムラインの主な手順 (図 1A) のとおりです。1 日で 6 ウェル プレートの複数の井戸が MS2 カセット、sgRNA/Cas9 (図 1Bに示すように) ベクトルを表現するをトランスフェクトしました。2 つの異なる subtelomere 15q 固有ガイド RNA シーケンス Cas9 nickase 表現のクローンを作成 pX335 ベクトル、cotransfected MS2 カセットでは、2 つの sgRNA pX335 ベクトルを生成します。プレートの 1 つの井戸は、トランスフェクション効率を確認するベクトルを表現する GFP をトランスフェクションすることができます。2 日で細胞がトリプシ...

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ディスカッション

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この記事では MS2 シーケンス subtelomere 15q 内に統合を含むひと癌細胞のクローンを生成する手法を提案します。これらのクローンを使用して、subtelomere 15q から転写 MS2 タグ テラ分子は、MS2 GFP 融合タンパク質の共発現による蛍光顕微鏡で検出されます。このアプローチにより、単一から表明したテラのダイナミクスを研究する研究者生活のテロメア細胞21。このプロトコルでは AGS のセルライン テラ式はヒトの胃がんサンプル24で亢進なので、テラを研究に興味深いモデル システムを表すテラ MS2 クローンが選択されます。ただし、ここで説明されているプロトコルは他の細胞内のテラ MS2 のクローンの選択の合わせることができます。MS2 シーケンスの統合原理で昇格できますテロメア 15q から別の subtelomere で特定の MS2 カセットと CRISPR 戦略を使用しています。今回紹介した方法で Cas9 nickase 酵素と二重ガイド Rna は統合22...

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開示事項

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者は競合する金銭的な利益を宣言しません。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

CIBIO トレント大学での高度なイメージング機能、ウィーンの BioOptics 光顕微鏡施設 Max F. ペルーツ研究所 (MFPL) でのスタッフに感謝しております。これらの結果につながる研究資金を受けている Mahlke-谷、同財団、研究、技術開発およびデモンストレーションのため欧州連合の第 7 フレームワーク プログラムから付与契約の下でない 609431 ecEC は、大学教育と研究 (MIUR) のイタリア省からリタ レヴィ モンタルチーニ交わりによってサポートされます。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
AGS細胞--クリスチャン・バロン(Université de Montréal)です。
F12K Nut Mix 1XGIBCO21127022AGS細胞用培養培地
L-グルタミン コーニングMT25005CI細胞培養培地の成分
ペニシリン ストレプトマイシン 溶液コーニング30-002-CI細胞培養培地の成分
ウシ胎児血清Σ AldrichF2442細胞培養培地
DMEM 1XGIBCO21068028フェニックス細胞用培地
CaCl2Σ AldrichC1016フェニックス細胞トランスフェクションに使用
HEPESSigma AldrichH3375フェニックス細胞トランスフェクションに使用(HBS溶液)
KClSigma AldrichP9333フェニックス細胞トランスフェクションに使用 (HBS溶液)
キストローSigma AldrichD9434フェニックス細胞トランスフェクションに使用
NaClSigma AldrichS7653フェニックス細胞トランスフェクション(HBS溶液)およびレトロウイルス沈殿物に使用
ニックス細胞トランスフェクション(HBS溶液)に使用Na2HPO4Sigma AldrichS3264
トリプシンEDTA溶液 1XCORNING59430C細胞分割に使用
DPBS 1XGIBCO14190250ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水
DMSOSigma AldrichD8418細胞凍結培地(80%FBBおよび20%DMSO)の成分
G-418二硫酸塩FormediumG4185選択薬 
ゼラチン溶液 Bioreagent SigmaAldrichG139396ウェルDNAプレートと凍結プレートのコーティング
トリス塩基フィッシャーBioReagents10376743ゲノムDNA抽出用細胞溶解バッファーの成分
EDTASigma AldrichE6758ゲノムDNA抽出用細胞溶解バッファーの成分
SDSSigma Aldrich71729ゲノムDNA抽出用細胞溶解バッファーの成分
プロテイナーゼKサーモフィッシャーAM2546ゲノムDNA抽出用細胞溶解バッファーの成分
RNAse Aサーモフィッシャー12091021DNA抽出中のRNA分解
アガロースシグマ アルドリッチA5304DNAゲル調製
Atlas ClearSightBioatlasBH40501アガロースゲルエタノール中のDNAおよびRNAサンプルの検出に使用される染色試薬
DNA沈殿BP28184
酢酸ナトリウム Sigma Aldrich711963M濃度でのDNA沈殿に使用 pH5.2
Wizard SVゲルおよびPCRクリーンアップシステムPromegaA9282ネオマイシン陽性クローンのPCRスクリーニング中のアガロースゲルからのPCRフラグメントの抽出
TrizolAMBION15596018RNA抽出に使用される有機溶媒
Dnase ITHERMO SCIENTIFIC89836RNAからのゲノムDNAの分解 
dNTPs mixInvitrogen10297018RTおよびPCR反応に使用
DTTInvitrogen707265MLRT反応に使用
ジエチルピロカーボネートSigma AldrichD5758でRNAsを不活性化に使用(1:1000希釈)
RibolockThermo FisherEO0381RNase阻害剤
MOPSSigma AldrichM9381RNAゲルの調製
パラホルムアルデヒド電子顕微鏡科学15710変性RNAゲルの調製(1x MOPS中の1% PFA)
上付き文字III 逆転写酵素Invitrogen18080-093後転写反応
Pfu DNAポリメラーゼ(組換え)Thermo ScientificEP0501PCR反応
2X qPCRBIO SyGreen Mix Separate-ROXPCRネオPB 20.14qPCR反応
Cre-GFPアデノウイルスhttps://medicine.uiowa.edu/vectorcore 1174-HT
酪酸ナトリウムSigma AldrichB5887フェニックス細胞でのレトロウイルス粒子産生を促進するために使用される
PEG8000Sigma Aldrich89510レトロウイルス粒子の沈殿
35µ-TERRA-MS2クローンのライブセルイメージング分析に使用されるIbidi81158
デス フェ フェニックス細胞トランスフェクション(HBS溶液) 水中マイcn遺伝子を除去するためにTERRA-MS2クローンに感染するために使用されるBIOSYSTEMS ディッシュガラスボトム

参考文献

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