無機ポリリン酸の細菌のための試金

サマリー

多様な細菌、グラム陰性菌、グラム陽性菌、抗酸菌種を含むポリリン酸の迅速定量のための簡単な方法について述べる。

要約

無機ポリリン酸 (ポリープ) は、生活のすべてのドメインからの細胞は、生体高分子を病原性および多くの細菌のストレス反応に必要です。さまざまな労働集約的なまたは小文字を区別しない、その有用性を制限することは、多くの生体物質の定量化のポリープの方法があります。我々 提示ここで細菌、ポリープの定量化のための合理化された方法複数サンプルがあり、ポリープ固有 exopolyphosphatase ScPPX とポリープの消化および検出の迅速な処理のために最適化されたシリカ膜列抽出を使用して、敏感なアスコルビン酸ベースの比色試金とフリーのりん酸塩を生じる。このプロシージャは簡単、安価で、し多様な菌種で、信頼性の高いポリープ定量化。グラム陰性細菌 (大腸菌)、乳酸グラム陽性細菌 (乳酸菌ロイテリ) 抗酸菌種 (アラビノースイソメラーゼ) から代表的なポリープ定量化を提案します。私たちもこれは現在市販されていない ScPPX、mg 量のニッケル親和性の浄化のための単純なプロトコルを含まれます。

概要

無機ポリリン酸 (ポリープ) はライフ^1,2,3のすべてのドメインである phosphoanhydride リンク リン酸単位の線形生体高分子です。多様な細菌でポリープは欠かせないストレス反応、運動、バイオ フィルム形成、細胞周期制御、抗生物質耐性、病原性^{4,5,6,7,8 ,9,10,11}。ポリープ細菌で代謝の研究したがって病気を引き起こす、さまざまな環境で繁栄する細菌の能力に根本的な洞察力をもたらす可能性があります。多くの場合、細菌細胞における定量化のポリープとして使用する方法が、これらの研究を制限する要素です。

現在ポリープ生体試料中濃度を測定するために使用....

プロトコル

1. 浄化酵母 Exopolyphosphatase (ScPPX)

1. エレクトロポレーション³²または³³化学変換によって大腸菌蛋白質過剰発現株プラスミド pScPPX2⁶ BL21(DE3)³¹を変換します。
2. BL21(DE3) pScPPX2 を含む単一コロニーを 2 L ないフラスコ 100 μ g mL^-1アンピシリンを含むホストゲノム スープ (LB) の 1 L を接種して 600 で吸光度を振ることがなく 37 ° C で一晩インキュベート nm (₆₀₀) の約0.3、分光光度計で測定しました。
3. 文化 (180 rpm) を揺れを起動し、セルが 0.4 - の A₆₀₀に成長する時間の間に、37 ° C で 30 分間インキュベート 0.5。
4. 最終濃度 1 mM と、追加 100 μ g mL^-1アンピシリン、イソプロピル β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) を追加し、180 rpm で振とうしながら 37 ° C で 4 時間孵化させなさい。
   注: この過剰発現プロトコルは可溶性 ScPPX の大規模な....

結果

プロトコルの主な手順は、図 1の単純な形で立てます。

グラム陰性菌、野生型大腸菌にこのプロトコルの使用を示すため MG1655³⁹だった LB (200 rpm) の揺れで 37 ° C で豊富な培地の中間ログ段階に成長して、洗浄し、でさらに 2 時間インキュベートmorpholinopropanesulfonate バッファー (モップ) 最小限中⁴⁰ g L^-1のグルコースと 0.1 ミリメートル K₂HPO₄、ポリープ^14,29の生産を誘導するために知られている状態を含みます。

ディスカッション

ここで説明されているプロトコルは、簡素化、24 サンプル処理に約 1.5 時間を取っての典型的なセットを持つ多様な細菌のポリープ レベルの定量化を加速します。これはサンプルの迅速なスクリーニングと変異ライブラリ解析が可能、簡単に時間をかけてポリープの蓄積を測定の実験。プロトコルが 3 つ門の代表者で効果的に動作することを実現した: フィルミクテス門、プロテオ バクテリアとアクチノ バクテリアは、その弾力性のあるために悪名高いが、細胞壁⁴⁹を分離することは困難。

ScPPX と消化によるポリープの検出はより具体的と、DAPI の蛍光検出より敏感より安くより技術的にポリープの PPK を使用して ATP への変換よりも簡単です。ScPPX は、DNA および RNA の¹²によって阻害される、我々 は以上 6,000 nmol ポリープ mg^-1蛋白質²⁹を含んでいる細菌でさえ完全な消化力を達成するために非常に大過剰の酵素.......

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
大腸菌 BL21(DE3)	ミリポアシグマ	69450
プラスミド pScPPX2	Addgene	112877	学術機関およびその他の非営利団体に利用可能
LBブロス	フィッシャーサイエンティフィック	BP1427-2	E. coli 増殖培地
アンピシリン	フィッシャー・サイエンティフィック	BP176025
イソプロピル &β;-D-1-チオガラクトピラノシド (IPTG)	ゴールドバイオテクノロジー	I2481C
HEPES緩衝液	ゴールドバイオテクノロジー	H-400-1
水酸化カリウム (KOH)	HEPES緩衝液のpHを調整するための	フィッシャーサイエンティフィ	P250500
塩化ナトリウム(NaCl)	フィッシャーサイエンティフィ	S27110
イミダゾール	フィッシャー科学	O3196500
リゾチーム	フィッシャーサイエンティフィ	AAJ6070106
塩化マグネシウム (MgCl2)	フィッシャーサイエンティフィック	BP214-500
ピアスユニバーサルヌクレアーゼ	フィッシャーサイエンティフィ	PI88700	ベンゾナーゼ (Sigma-Aldrich cat. # E1014) は、許容される代替
モデル 120 ソニック ディスメンブレーター	フィッシャー サイエンティフィックです	FB-120	他の細胞溶解法 (例: French Press) も効果的です
5 mL HiTrap キレート HP カラム	GE Life Sciences	17040901	任意のニッケル アフィニティー クロマトグラフィー カラムまたは樹脂を置換できる
ニッケル (II) 硫酸塩 六水和物	Fisher Scientific	AC415611000	HiTrap カラム
0.8 & マイクロ;m 細孔サイズ 酢酸セルロース シリンジ フィルター	Fisher Scientific	09-302-168
Bradford 試薬	Bio-Rad	5000205
Tris buffer	Fisher Scientific	BP1525
Spectrum Spectra/POR 4 RC透析膜チューブ 12,000 to 14,000 ダルトン MWCO フィ	ッシャーサイエンティフィック	08-667B	MWCO < 30,000 Daの他の透析膜も塩
酸(HCl)	ッシャーサイエンティフィ	A144-212	トリス緩衝液のpHを調整するため
塩化カリウム(KCl)	フィッシャーサイエンティフィ
グリセロール	フィッシャーサイエンティフィック	BP2294
10x MOPS中混合物	Teknova	M2101<	em>大腸菌増殖培地
グルコース	フィッシャーサイエンティフィック	D161
一塩基性リン酸カリウム(KH2PO4)	フィッシャーサイエンティフィック	BP362-500
二塩基性リン酸カリウム(K2HPO4)	フィッシャーサイエンティフィ	BP363-500
脱水酵母エキス	フィッシャーサイエンティフィック	DF0886-17-0
トリプトン	フィッシャーサイエンティフィック	BP1421-500
硫酸マグネシウム七水和物	ッシャーサイエンティフィック	M63-50硫酸
マンガン一水和物	ッシャーサイエンティフィック	M113-500
グアニジンイソチオシアネート	フィッシャーサイエンティフィ	BP221-250
ウシ血清アルブミン(プロテアーゼフリー)	フィッシャーサイエンティフィ	BP9703100
クリアフラットボトム96ウェルプレート	シグマアルドリッチ	M0812-100EA	任意のクリア96ウェルプレートは、
Tecan M1000無限プレートリーダーTecan	、Inc.で動作します。	適用されません	595nmと882nmで吸光度を測定できるプレートリーダーは機能します
エタノール	ッシャーサイエンティフィック	04-355-451
シリカ膜スピンカラム	エポックライフサイエンス	1910-050/250
エチレンジアミン四酢酸 (EDTA)	フィッシャーサイエンティフィ	BP120500
1.5 mL マイクロチューブ	フィッシャーサイエンティフィック	NC9580154
酢酸アンモニウム	フィッシャー・サイエンティフィック	A637-500
酒石酸アンチモンカリウム	フィッシャー・サイエンティフィック	AAA1088922
4 N 硫酸 (H2SO4)	フィッシャー・サイエンティフィ	SA818-500
ヘプタモリブデン酸アンモニウム	フィッシャー・サイエンティフィ	AAA1376630
・アスコルビン酸	ッシャー科学	的なAC401471000

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