無機ポリリン酸の細菌のための試金

サマリー

多様な細菌、グラム陰性菌、グラム陽性菌、抗酸菌種を含むポリリン酸の迅速定量のための簡単な方法について述べる。

要約

無機ポリリン酸 (ポリープ) は、生活のすべてのドメインからの細胞は、生体高分子を病原性および多くの細菌のストレス反応に必要です。さまざまな労働集約的なまたは小文字を区別しない、その有用性を制限することは、多くの生体物質の定量化のポリープの方法があります。我々 提示ここで細菌、ポリープの定量化のための合理化された方法複数サンプルがあり、ポリープ固有 exopolyphosphatase ScPPX とポリープの消化および検出の迅速な処理のために最適化されたシリカ膜列抽出を使用して、敏感なアスコルビン酸ベースの比色試金とフリーのりん酸塩を生じる。このプロシージャは簡単、安価で、し多様な菌種で、信頼性の高いポリープ定量化。グラム陰性細菌 (大腸菌)、乳酸グラム陽性細菌 (乳酸菌ロイテリ) 抗酸菌種 (アラビノースイソメラーゼ) から代表的なポリープ定量化を提案します。私たちもこれは現在市販されていない ScPPX、mg 量のニッケル親和性の浄化のための単純なプロトコルを含まれます。

概要

無機ポリリン酸 (ポリープ) はライフ^1,2,3のすべてのドメインである phosphoanhydride リンク リン酸単位の線形生体高分子です。多様な細菌でポリープは欠かせないストレス反応、運動、バイオ フィルム形成、細胞周期制御、抗生物質耐性、病原性^{4,5,6,7,8 ,9,10,11}。ポリープ細菌で代謝の研究したがって病気を引き起こす、さまざまな環境で繁栄する細菌の能力に根本的な洞察力をもたらす可能性があります。多くの場合、細菌細胞における定量化のポリープとして使用する方法が、これらの研究を制限する要素です。

現在ポリープ生体試料中濃度を測定するために使用するいくつかの方法があります。これらのメソッドは通常 2 つの明瞭なステップを含む: それらの抽出物でポリープを抽出し、ポリープを定量化を提示します。Bru と同僚で¹²フェノールを使用する RNA と DNA 抽出ポリープ酵母酵母として開発した現在の金本位法、クロロホルム、エタノールの沈殿物、治療が続く出芽酵母ポリープ分解酵素 exopolyphosphatase (ScPPX)¹³を使用して定量化は、フリーのりん酸塩を生成するために結果として得られる精製ポリープの消化およびリボヌクレアーゼ (RNase)、デオキシリボヌクレアーゼ (DNase)、マラカイト グリーンを用いた比色定量法。この手順は、非常に数量が、労働集約的な単一の実験で処理することができ、細菌性のサンプルのために最適化されていませんするサンプルの数を制限することです。他の人はさまざまな細胞や組織をシリカビーズ ("glassmilk") またはシリカ膜列^{6,14,15,16,17を使用してからポリープを抽出を報告しています。 18}。これは主に合成と一般的に考えられている細菌をそれほど考慮これらのメソッドは効率的に短鎖ポリープ (未満 60 リン酸単位)^12,14,15, を抽出できません。長鎖ポリープ³。強い酸^19,20を使用してポリープ抽出のより古い方法はもはや広く利用されてポリープは酸性条件¹²の下で安定しているので。

また、さまざまな定量化ポリープの報告方法があります。最も一般的なの間では 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) 蛍光色素の詳細は通常、DNA を染色に使用です。DAPI ポリープ錯体 DAPI DNA 複合体^21,22より異なる蛍光励起と放射マキシマが RNA、ヌクレオチド、イノシトールなど他の細胞部品からかなりの干渉があります。リン酸塩^12,15,16,23, 特異性とこのメソッドを使用してポリープ測定の感受性を減らします。ポリープとアデノシン二リン酸 (ADP) をアデノシン三リン酸 (ATP) を精製した大腸菌を使用してに変換する代わりに、ポリープのキナーゼ (PPK) およびルシフェラーゼ^{14,17 を用いて定量化結果 ATP ,18}。これはポリープの非常に少量の検出が可能、2 つの酵素反応ステップ ルシフェリンと非常に純粋な ADP は、高価な試薬であるが必要です。ScPPX フリーのりん酸塩^6,12,13,24、簡単な方法、しかし ScPPX を使用して検出することができますに特にダイジェスト ポリープは DNA および RNA の¹²によって阻害されます。ポリープを含む必要と DNase、RNase 処理を抽出します。PPK も ScPPX も市販と PPK の浄化は比較的複雑な^25,26。

DAPI 染色^27,28,29,30、チェーン長さの評価を許可して、メソッドは負で、セル lysates または抽出物でポリープのポリアクリルアミドゲルで視覚化できるも低スループットと低い定量。

我々 は今多様な細菌種のレベル ポリープの急速な定量化を可能にする安価な高速、中速のポリープ アッセイを報告します。このメソッドは、複数のサンプルの迅速な処理のために最適化されたシリカ膜列抽出に続いて携帯電話のホスファターゼを不活化する 95 ° c 4 M グアニジン イソチオ シアン酸 (GITC)¹⁴で細菌細胞の分離によって開始します。得られたポリープを含む抽出液は、DNase、RNase の治療の必要性を排除する ScPPX の大過剰と消化されます。ScPPX の mg 量の簡単なニッケル親和性の浄化のためのプロトコルが含まれます。最後に、ポリープ由来フリーのりん酸塩は、単純な敏感なアスコルビン酸ベースの比色定量法²⁴の定量化し、総細胞蛋白質に正規化します。このメソッドは、細菌細胞、ポリープの測定を合理化し、グラム陰性菌、グラム陽性菌、抗酸菌の代表種でその使用を示します。

プロトコル

1. 浄化酵母 Exopolyphosphatase (ScPPX)

1. エレクトロポレーション³²または³³化学変換によって大腸菌蛋白質過剰発現株プラスミド pScPPX2⁶ BL21(DE3)³¹を変換します。
2. BL21(DE3) pScPPX2 を含む単一コロニーを 2 L ないフラスコ 100 μ g mL^-1アンピシリンを含むホストゲノム スープ (LB) の 1 L を接種して 600 で吸光度を振ることがなく 37 ° C で一晩インキュベート nm (₆₀₀) の約0.3、分光光度計で測定しました。
3. 文化 (180 rpm) を揺れを起動し、セルが 0.4 - の A₆₀₀に成長する時間の間に、37 ° C で 30 分間インキュベート 0.5。
4. 最終濃度 1 mM と、追加 100 μ g mL^-1アンピシリン、イソプロピル β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) を追加し、180 rpm で振とうしながら 37 ° C で 4 時間孵化させなさい。
   注: この過剰発現プロトコルは可溶性 ScPPX の大規模な量を生成します。ただし、ScPPX の過剰発現は非常に寛容とさまざまなその他の一般的な蛋白質過剰発現のプロトコルは正常に ScPPX を浄化するために使用されています。
5. 1 L 遠心ボトルにセルを転送し、4 ° C で 5000 × g で 20 分間遠心分離することでそれらを収穫上澄みを除去し、細胞ペレットを 50 mL の円錐管に転送します。
   注: 細胞ペレット格納できます無期限に-80 ° C で
6. 氷上では、ペレットを解凍し、50 mm HEPES 9 mL、0.5 M の NaCl および 5 mM のイミダゾール (pH 8) 約 10 mL の容量のためにそれを再懸濁します。
7. (最終濃度) 1 mg mL^-1リゾチーム、2 mM MgCl₂、および RNA と DNA 分解酵素の 50 単位 mL^-1を追加 (材料の表を参照) し、氷上で 30 分間インキュベートします。
   注: ScPPX バインド (データは示されていない)、核酸精製ヌクレアーゼ治療が必要であるので。
8. 超音波発生装置を用いた、陰極 (材料の表を参照)、50% の電力、パルス 5 氷に対する超音波照射の 2 サイクルで細胞を溶解 s サイクル間 2 分休憩と 5 s。
   注: は、超音波処理中に適切な公聴会保護を使用します。同様に過剰発現ケースに、さまざまなセル換散方法は ScPPX 浄化のため許容されます。
9. ライセートの 4 ° C で 20,000 × g で 20 分間遠心分離によって不溶性の残骸を削除します。0.8 μ m 孔サイズ酢酸セルロース シリンジ フィルターを通して結果上清 (約 10 mL) をフィルターします。
10. 読み込む列をキレート ニッケル充電の 5 mL に溶解液 (材料表参照) 蠕動性ポンプまたは大規模な注射器を使用して。
11. 50 ml 50 mM HEPES、0.5 M の NaCl 5 mM のイミダゾール (pH 8) の列をすすいでください。
12. 50 ml 50 mM HEPES、0.5 M の NaCl、20 mM のイミダゾール (pH 8) の列をすすいでください。
13. 50 mm HEPES ScPPX、0.5 M の NaCl と 0.5 M イミダゾール (pH 8) 収集 15 1 mL の一部分を溶出します。ブラッドフォード蛋白質の試金³⁴コンテンツ蛋白質のためのこれらの溶出画分をテスト (材料の表を参照) を分数に浄化された ScPPX が含まれている確認する SDS ページのゲル³⁵を実行し、(分子量 = 45 kDa)。
14. 純粋な ScPPX を含む画分をプールし、約 2 mg mL^-1 50 mM HEPES と 0.5 M の NaCl をプールされたタンパク質の濃度を調整します。高蛋白質濃度は、次の手順で沈殿させるかもしれない。
15. 透析によるストレージ バッファー (20 mM トリス-HCl [pH 7.5] 50 mM KCl、10% [v] のグリセロール) に精製した ScPPX を交換します。シール長さ 12,000-14,000 Da 分子量カットオフ透析膜チューブ (材料の表を参照してください) のプール ScPPX 分数を置き、1 l 連続攪拌 4 ° C で少なくとも 4 h、新鮮なこの手順でストレージ バッファーの中断ストレージ バッファー バッファーの 3 つの変更の合計のため。
16. 遠心分離機管または管不溶性集計を削除する 4 ° C で 20,000 × g で 20 分間遠心分離して精製、透析の蛋白質を転送します。慎重にきれいな 15 mL コニカル チューブに上清を転送します。
17. 1 mg mL^-1ストレージ バッファーに精製した ScPPX の濃度の調整、追加 0.1% (w/v) プロテアーゼ無料ウシ血清アルブミン (BSA; 最終濃度) と 4 ° C で最大 6 ヶ月のための店
    注: ScPPX は、冷凍¹³だとその活動の 90% 以上を失います。

2. ポリリン酸抽出のサンプルを収穫

1. ポリープのコンテンツを決定する金利の条件下で細菌を成長します。このプロトコルのリンゴ酸酵素誘導 (MEI) 中³⁷システイン (メイ C) なしで振動なし乳酸菌ロイテリ³⁶ 37 ° C で一晩で育ちます。
2. 細胞蛋白質の 50-100 μ g の合計 1.5 mL 遠心チューブに遠心分離によって十分なセルを収穫 (下記の手順 3 を参照)。これは 0.2 - A₆₀₀でログ相文化の 1 mL、エシェリヒア属大腸菌、0.4。これは、 l. ロイテリ、一晩文化の 1 mL です。興味の他の種のために必要に応じて調整します。
3. 細胞ペレットから上清を完全に削除します。
4. GITC 換散バッファー (4 M グアニジン イソチオ シアン酸、50 ミリメートル トリス-HCl、pH 7) の 250 μ L で細胞ペレットを再懸濁し、10 分-80 ° C でストア lysates 95 ° C で培養による溶解させます。
   注: は、高温で長期の潜伏が加水分解³⁸ポリープの劣化になるので溶解時間と一致します。Lysates は-80 ° C で不明確に保存されることができます。
   注意: イソチオ シアン酸グアニジン カオトロ ピック塩ですと手袋をはめて処理、有害廃棄物としています。

3. セル Lysates のタンパク質含有量の測定

1. 0、0.1、0.2、0.4 mg mL GITC 換散バッファー内^-1 BSA の含まれている BSA 基準を準備します。
   注: GITC ブラッドフォードの試金の発色に影響を与えるので、GITC で BSA の基準にすることが重要です。BSA の標準は、-20 ° C で不明確に保存されることができます。
2. 分注 5 μ 解凍、十分に混合されたセル lysates と BSA 基準クリア 96 ウェル プレートで井戸を分離します。
3. 各ウェルにブラッドフォード試薬³⁴ 195 μ L を追加し、595 で吸光度を測定プレート リーダーで nm (₅₉₅) (材料の表を参照してください)。
4. 数式 y を使用して BSA の標準曲線と比較して各ウェル中の蛋白量を計算 = mx+b と、y は₅₉₅x は BSA の μ g、m は標準曲線の傾き、b は標準曲線の y 切片です。各サンプルの蛋白質の総 mg は、0.05 を結果の値を掛けます。

4. ポリリン酸の抽出

1. 各サンプルの GITC 分離とミックスする渦に 95% のエタノールの 250 μ L を追加します。
2. シリカ膜のスピン列と 30 の遠心分離機に混合物を適用 16,100 x g で s。
3. 流れを破棄し、50 mM NaCl、5 ミリメートルの EDTA、50% エタノールと 30 の遠心分離機 (pH 7.5)、5 mM トリス-HCl の 750 μ L を追加 16,100 x g で s。
4. フロー ・ スルーと 16,100 x g で 2 分間遠心を破棄します。
5. きれいな 1.5 mL および microfuge の管に列を配置し、50 mm トリス-HCl (pH 8) 150 μ L を追加します。
6. 5 分間室温でインキュベートし、8,000 の x g で 2 分間遠心分離によってポリープを溶出します。
   注: 必要な場合、溶出格納できます-20 ° C で少なくとも 1 週間。

5. ポリリン酸の消化

1. 0、5、50、または 50 mm トリス-HCl (pH 8) リン酸カリウム 200 μ M を含む基準を準備します。
   注: カリウム リン酸基準は、室温で不明確に保存することができます。
2. 分注 100 μ L 標準リン酸塩とは、クリア 96 ウェル プレートの別の井戸にポリープのサンプルを抽出しました。
3. (サンプルごと) を含んでいるマスターの組合せを準備: 5 x ScPPX 反応バッファー (100 mM トリス-HCl、MgCl₂25 mM、250 mM 酢酸アンモニウム、pH 7.5)¹³の 30 μ L、19 μ L H₂O の 1 μ L の精製 ScPPX (1 mg mL^-1)。
4. 96 ウェル プレートの各ウェルにマスター ミックスの 50 μ L を追加します。37 ° C で 15 分間インキュベートします。
   注: 必要な場合消化ポリープ サンプルが-20 ° C で不明確に保存されます。

6. 検出フリーのりん酸塩²⁴

1. だから 4 N H₂の 150 mL を追加、水の 200 mL の酒石酸アンチモン カリウム 0.185 g を溶解することにより検出ソリューション ベースの準備₄、アンモニウム heptamolybdate の 1.49 グラムを追加します。溶解し 456 mL の最終巻にかき混ぜます。1 ヶ月の 4 ° C で光から保護された微粒子を取り出して保管するのにソリューションをフィルターします。
2. 1 M アスコルビン酸の原液を準備します。1 ヶ月の 4 ° C で光から保護されたストア。
3. 1 M アスコルビン酸 0.88 ml 検出ソリューション ベースの 9.12 mL を混合することによって、新鮮な在庫検出ソリューションの毎日を準備します。使用する前に室温に来る検出ソリューションを許可します。
4. 各サンプルと 96 ウェル プレートで標準に検出ソリューションの 50 μ L を追加し、色の開発を許可するように約 2 分間室温でインキュベートします。
5. 882 で吸光度を測定プレート リーダー nm カリウム リン酸標準曲線に比較して各サンプルのリン酸濃度を計算します。
   注意: 検出ソリューションには、有毒な塩と強い酸が含まれています。手袋を着用する、有毒廃棄物として余分なソリューションを扱います。

7. 細胞ポリリン酸の内容を計算します。

1. 次の式に従ってライセート各セルの全体のポリープ由来リン酸イオンの nanomoles の手順 6.5 で、リン酸濃度を変換します。
   nmol ポリープ 1.5 x = (μ M リン酸/10)
   注: 手順 6 で標準曲線に基づいたメソッドは、サンプルではそれぞれ 100 μ L ポリープ 5.2 の手順で検体 (μ M) におけるリン酸の濃度を決定します。この濃度を nmol 数に変換する 100 μ L を 10 で割るは⁶ l、ボリュームを与える濃度 (µmol L^-1) で乗算し、1,000 (、µmol の nmol 数) を掛けた。これは濃度を 10 で除算する減少します。手順 4 で準備総エキス量が全体のエキスにリン酸の nmol を計算するために 1.5 結果の値を乗算する必要があるので 150 μ L であります。
2. 手順 3.4 で確認した各サンプルの mg 総蛋白 nmol ポリープを除して総細胞蛋白質を細胞ポリープ コンテンツを正規化します。ポリープ レベルは個別無料ポリープ由来のリン酸の濃度の観点から表されます。
   注: 場合によっては、ポリープ由来リン酸サンプルで現在の量がリン酸標準曲線 (ステップ 6.5) の線形範囲外落ちることがあります。ポリープのレベルが非常に高い場合、ステップ 4.6 から余分なポリープを含む溶出液は希釈 1:10 または 1: 100、必要に応じてすることができ、5 7 からの手順の説明に従って再度測定します。

結果

プロトコルの主な手順は、図 1の単純な形で立てます。

グラム陰性菌、野生型大腸菌にこのプロトコルの使用を示すため MG1655³⁹だった LB (200 rpm) の揺れで 37 ° C で豊富な培地の中間ログ段階に成長して、洗浄し、でさらに 2 時間インキュベートmorpholinopropanesulfonate バッファー (モップ) 最小限中⁴⁰ g L^-1のグルコースと 0.1 ミリメートル K₂HPO₄、ポリープ^14,29の生産を誘導するために知られている状態を含みます。

ディスカッション

ここで説明されているプロトコルは、簡素化、24 サンプル処理に約 1.5 時間を取っての典型的なセットを持つ多様な細菌のポリープ レベルの定量化を加速します。これはサンプルの迅速なスクリーニングと変異ライブラリ解析が可能、簡単に時間をかけてポリープの蓄積を測定の実験。プロトコルが 3 つ門の代表者で効果的に動作することを実現した: フィルミクテス門、プロテオ バクテリアとアクチノ バクテリアは、その弾力性のあるために悪名高いが、細胞壁⁴⁹を分離することは困難。

ScPPX と消化によるポリープの検出はより具体的と、DAPI の蛍光検出より敏感より安くより技術的にポリープの PPK を使用して ATP への変換よりも簡単です。ScPPX は、DNA および RNA の¹²によって阻害される、我々 は以上 6,000 nmol ポリープ mg^-1蛋白質²⁹を含んでいる細菌でさえ完全な消化力を達成するために非常に大過剰の酵素...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
大腸菌 BL21(DE3)	ミリポアシグマ	69450
プラスミド pScPPX2	Addgene	112877	学術機関およびその他の非営利団体に利用可能
LBブロス	フィッシャーサイエンティフィック	BP1427-2	E. coli 増殖培地
アンピシリン	フィッシャー・サイエンティフィック	BP176025
イソプロピル &β;-D-1-チオガラクトピラノシド (IPTG)	ゴールドバイオテクノロジー	I2481C
HEPES緩衝液	ゴールドバイオテクノロジー	H-400-1
水酸化カリウム (KOH)	HEPES緩衝液のpHを調整するための	フィッシャーサイエンティフィ	P250500
塩化ナトリウム(NaCl)	フィッシャーサイエンティフィ	S27110
イミダゾール	フィッシャー科学	O3196500
リゾチーム	フィッシャーサイエンティフィ	AAJ6070106
塩化マグネシウム (MgCl2)	フィッシャーサイエンティフィック	BP214-500
ピアスユニバーサルヌクレアーゼ	フィッシャーサイエンティフィ	PI88700	ベンゾナーゼ (Sigma-Aldrich cat. # E1014) は、許容される代替
モデル 120 ソニック ディスメンブレーター	フィッシャー サイエンティフィックです	FB-120	他の細胞溶解法 (例: French Press) も効果的です
5 mL HiTrap キレート HP カラム	GE Life Sciences	17040901	任意のニッケル アフィニティー クロマトグラフィー カラムまたは樹脂を置換できる
ニッケル (II) 硫酸塩 六水和物	Fisher Scientific	AC415611000	HiTrap カラム
0.8 & マイクロ;m 細孔サイズ 酢酸セルロース シリンジ フィルター	Fisher Scientific	09-302-168
Bradford 試薬	Bio-Rad	5000205
Tris buffer	Fisher Scientific	BP1525
Spectrum Spectra/POR 4 RC透析膜チューブ 12,000 to 14,000 ダルトン MWCO フィ	ッシャーサイエンティフィック	08-667B	MWCO < 30,000 Daの他の透析膜も塩
酸(HCl)	ッシャーサイエンティフィ	A144-212	トリス緩衝液のpHを調整するため
塩化カリウム(KCl)	フィッシャーサイエンティフィ
グリセロール	フィッシャーサイエンティフィック	BP2294
10x MOPS中混合物	Teknova	M2101<	em>大腸菌増殖培地
グルコース	フィッシャーサイエンティフィック	D161
一塩基性リン酸カリウム(KH2PO4)	フィッシャーサイエンティフィック	BP362-500
二塩基性リン酸カリウム(K2HPO4)	フィッシャーサイエンティフィ	BP363-500
脱水酵母エキス	フィッシャーサイエンティフィック	DF0886-17-0
トリプトン	フィッシャーサイエンティフィック	BP1421-500
硫酸マグネシウム七水和物	ッシャーサイエンティフィック	M63-50硫酸
マンガン一水和物	ッシャーサイエンティフィック	M113-500
グアニジンイソチオシアネート	フィッシャーサイエンティフィ	BP221-250
ウシ血清アルブミン(プロテアーゼフリー)	フィッシャーサイエンティフィ	BP9703100
クリアフラットボトム96ウェルプレート	シグマアルドリッチ	M0812-100EA	任意のクリア96ウェルプレートは、
Tecan M1000無限プレートリーダーTecan	、Inc.で動作します。	適用されません	595nmと882nmで吸光度を測定できるプレートリーダーは機能します
エタノール	ッシャーサイエンティフィック	04-355-451
シリカ膜スピンカラム	エポックライフサイエンス	1910-050/250
エチレンジアミン四酢酸 (EDTA)	フィッシャーサイエンティフィ	BP120500
1.5 mL マイクロチューブ	フィッシャーサイエンティフィック	NC9580154
酢酸アンモニウム	フィッシャー・サイエンティフィック	A637-500
酒石酸アンチモンカリウム	フィッシャー・サイエンティフィック	AAA1088922
4 N 硫酸 (H2SO4)	フィッシャー・サイエンティフィ	SA818-500
ヘプタモリブデン酸アンモニウム	フィッシャー・サイエンティフィ	AAA1376630
・アスコルビン酸	ッシャー科学	的なAC401471000