方法論記事

構造と原子間力顕微鏡イメージングによるヌクレオソームのダイナミクスを調べる

DOI：

10.3791/58820

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2019年1月31日

 ,  ,  , 
1Department of Pharmaceutical Sciences, University of Nebraska Medical Center

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ここでは、静的および時間経過の原子間力顕微鏡 (AFM) イメージング技術を使用して単一分子レベルでのヌクレオソーム粒子の特性評価にプロトコルを提案します。説明表面機能化手法により構造のキャプチャとダイナミクスのヌクレオソームのナノスケールで高解像度。

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ヌクレオソームのサブユニットの長い鎖であるクロマチンは、真核細胞の DNA 複製と転写を場所としてこのような重要なプロセスは、動的なシステムです。ヌクレオソームのダイナミクスは、dna 複製と転写の機械によってアクセスが提供し、クロマチン機能発現の分子機構に非常に貢献します。イメージング原子間力顕微鏡 (AFM) など単一分子の研究は、ヌクレオソーム構造とダイナミクスの役割の私達の現在の理解に大きく貢献しています。現在のプロトコルは、ヌクレオソームの構造と動的性質の研究に高分解能 AFM イメージングを有効にする手順を説明します。プロトコルは、H3 ヒストンがその相手の動原体タンパク質 (セントロメア) に置き換えられますセントロメア ヌクレオソームの得られた原子間力顕微鏡データによって示されています。プロトコルは連続希釈法によるモノラル ヌクレオソームのアセンブリに始まります。基板を準備する手順は、説明および説明ヌクレオソームの原子間力顕微鏡可視化修飾とヌクレオソーム イメージングに使用されるアミノプロピル silatrane (APS-雲母) マイカ基板の準備が欠かせません。ヌクレオソーム APS 雲母表面上まずヌクレオソーム人口のスナップショットをキャプチャする静的 AFM を用いたが作成されます。これらの画像解析からラップされたヌクレオソーム DNA のサイズなどのパラメーターを計測でき、このプロセスはまた、詳細な。液体内のプロシージャをイメージング タイムラプス AFM はいくつかのフレームをキャプチャすることができます高速コマ撮り AFM について 1 秒あたりヌクレオソーム ダイナミクスの。最後に、動的過程の定量的な解析を有効にするヌクレオソーム ダイナミクスの解析が説明し、イラストします。

概要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

真核細胞の DNA は高度に凝縮し、染色体に組織です。1染色体内の DNA 組織の最初のレベルは、147 のヌクレオソームのアセンブリ DNA の bp は密ヒストン八量体コアに巻いた。2,3ヌクレオソーム粒子単位で非常に小型の染色体が形成されるまではそれから組織されるクロマチンの配列を形成する長鎖 DNA 分子を組み立てます。4クロマチンの分解は DNA 遺伝子の転写とゲノムの複製など重要な細胞プロセスで必要とされる、クロマチンが非常に動的なシステムを無料へのアクセスを提供します。5,6,7さまざまなクロマチン レベルで DNA の動的プロパティを理解が間違いが細胞死やがんなどの病気の開発につながることができる分子レベルの遺伝的プロセスを解明するため重要です。8重要なクロマチン プロパティはヌクレオソームのダイナミクスです。9,10,11,12これらの粒子の高い安定性が結晶学的手法による構造特性できました。2どのようなこれらの研究不足、ヌクレオソーム DNA のメカニズムなどの動的詳細アンラッピング ヒストン コアから動的な経路は転写および複製の過程で必要です。7,9,13,14,15,16また、因子と呼ばれる特別な蛋白質ヌクレオソーム粒子17の分解を容易にするために示されています。ただし、ヌクレオソームの本質的なダイナ ミックスは全体分解プロセスに貢献するこのプロセスで重要な要因であります。14,16,18,19

単一分子蛍光19,20,21、光学トラップ (ピンセット)13,18,22,23 AFM などの単一分子技術10,14,15,16,24,25,26はヌクレオソームのダイナミクスを理解することに尽力されています。これらの方法のいくつかのユニークで魅力的な機能から原子間力顕微鏡の利点します。原子間力顕微鏡を視覚化しより長い配列27と同様、ヌクレオソームを特徴付けることができます。AFM 像からヌクレオソーム構造 DNA のヒストンのコアの周りをラップの長さなどの重要な特性は、測定10,14,26,28をすることができます。ヌクレオソーム アンラップ ダイナミクスの解析の中核となるパラメーターです。過去の原子間力顕微鏡の研究は非常に動的なシステム、DNA がヒストン コア14から自発的にラップを解除できますヌクレオソームを明らかに。ヌクレオソームから DNA の自発的な開梱は afm イメージングが水溶液14,26,29終わったらタイムラプス モードで動作直接可視化した.

高速コマ撮り原子間力顕微鏡 (AFM HS) 計測器の出現は、ミリ秒のタイム スケール14,15,24ヌクレオソーム アンラッピングを可視化を可能にしました。セントロメア特定ヌクレオソームの最近の HS AFM 16,30研究では、標準型に比べヌクレオソームのいくつかの新しい機能を明らかにしました。動原体、染色体分離31の批判的に重要な染色体の一部分のセントロメア ヌクレオソームを構成します。一括クロマチンの正規ヌクレオソームとは異なりは、セントロメア ヌクレオソームのヒストンのコアにはヒストン H332,33ではなくセントロメア ヒストンが含まれています。このヒストン置換結果のセントロメア ヌクレオソーム DNA ラッピングは ~ 120 ~ 147 ではなく bp 正規ヌクレオソーム; の bpセントロメアと正規のヌクレオソームの明瞭な形態をもたらすことができる違いは配列34セントロメア クロマチンを受ける 1 一括に比べ高いダイナミクスを示唆しています。HS AFM16,30研究におけるセントロメア ヌクレオソームで表示される新しいダイナミクス例示の構造と動的特性を直接可視化するこの 1 分子技術によって提供されるユニークな機会ヌクレオソーム。これらの機能の例を簡単に説明し、用紙の端に示されているが。既存のメソッドの変更と同様、ヌクレオソームの AFM イメージングの新しいプロトコルの開発により進歩だった。ここで説明したプロトコルの目的は、単一分子の原子間力顕微鏡のヌクレオソームの研究でこれらの刺激的な進歩のクロマチンの調査でこれらのテクニックを利用したいと思います誰かにアクセスできるようにです。説明されている技法の多くは、ヌクレオソームの研究を超えて問題に適用され他の蛋白質および興味の DNA システムの調査のため使用することができます。出版物35,36,37,38,39,40,41、このようなアプリケーションのいくつかの例を見つけることができます。 42,43,44,45,46,47,48,49と原子間力顕微鏡学の展望様々 な生体分子システムを与えられているレビュー29,50,51,53,54。

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プロトコル

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. 連続希釈モノラル ヌクレオソームのアセンブリ

  1. 生成し、シーケンスを配置オフ中心の Widom 601 ヌクレオソームを含む約 400 bp の DNA 基質を浄化します。55
    注: 不要なディ ヌクレオソーム形成を制限する位置決めシーケンスの前後それぞれの '腕' を超えない ~ 150 bp。
    1. 設計されたプライマーと一緒にプラスミド pGEM3Z 601 を使用して PCR を使用して基板の DNA を増幅します。122 と 154 bp アーム長さがここで使用される 423 bp 基板、前方を使用 (5'-CAGTGAATTGTAATACGACTC-3') および逆引き (5'-ACAGCTATGACCATGATTAC-3') プライマー。
    2. 95 ° C に予熱チューブをサーマルサイクラーに反応混合物を含むを追加します。95 ° C、30 秒は、49 ° c の熱処理、72 ° c. で 35 s 延長 95 ° c: 30 の変性で 5 分間初期変性後 33 サイクルの次のプログラムを実行します。72 ° C 10 分 33 サイクル、次で最後の拡張を設定します。
    3. 市販 PCR 精製キットを使用して pcr から DNA を浄化します。PCR クリーンアップ列から DNA を溶出溶出バッファーを提供されるキットの代わりに 10 mM Tris バッファー (pH 7.5) を使用します。
      注: ない精製工程間バッファーを転送する余分な注意してください。問題が発生することができます汚染された溶離液下流 DNA 濃度の測定やヌクレオソーム アセンブリ混合物の開始濃度を変更できます。
  2. 260 で浄化された DNA の吸光度を測定することによって DNA 濃度を決定する nm。
    1. 紫外可視分光光度計 10 mM Tris pH 7.5 溶出バッファーのみを使用して空白を収集します。浄化された DNA の測定を収集します。
  3. 濃度決定、0.6 mL および microfuge の管に精製した DNA の分注 25 pmol、真空、遠心分離機で置きます解決策が見えない。通常は 1 時間 30 分です。
    メモ: DNA 基板、ヌクレオソーム アセンブリの準備ができています。プロトコルをここで一時停止することができ、使用するまで-20 ° C で保存されている DNA。
  4. 25 pmol 氷の上の DNA を含むおよび microfuge の管を置き、順序でテーブル 1、ヌクレオソーム アセンブリ構成部品を追加します。すべてのコンポーネントを追加すると、混合物を氷から外し、この部屋の温度 (RT) で 30 分間インキュベートします。
    注: 株価ヒストン バッファーの塩分が 2 M の最終的な集中を達成するために必要な生理食塩水を計算するときと見なされることが重要です。15,56
  5. 連続速度希釈を使用して 200 ミリメートルに混合物の 2 M の塩濃度を減らすことでヌクレオソームを組み立てます。57
    1. 10 mM Tris pH 7.5 を含む希釈バッファーの 100 μ L で注射器を記入し、シリンジ ポンプの上に置きます。
    2. 直接および microfuge の管の帽子の前にパンクした穴から注射器の針は、アセンブリ混合物 (図 1) で作られています連絡先を確保します。
    3. 120 分 0.75 μ L/分の速度で注射器のポンプを実行します。
      注: 結果の 100 μ L ソリューションには、250 nM ヌクレオソームと 200 mM の NaCl が含まれています。
    4. 10 K MWCO 透析ボタンに混合物を転送し、4 ° C で 1 時間 10 mM Tris pH 7.5、0.25 ミリメートルの EDTA および 2.5 mM の NaCl を含む中古冷蔵 (4 ° C) 低い塩バッファーの 200 mL に対して dialyze
  6. ヌクレオソーム アセンブリのヒストンの内容を評価するために分離する 15% と 6% 前述30スタッキング不連続 SDS ページのゲルを準備します。
    1. 割り切れるヌクレオソームの 10-20 μ L および microfuge の管をストックし、1-2 x の作業濃度に塩化物イオン サンプル バッファー x 4 を追加します。58
    2. コントロールとしてヒストン株式の 1-2 μ g の別および microfuge の管でこの準備を繰り返します。95 ° C でサンプルを熱 〜 5 分。
    3. ゲルで互いに隣接する車線のサンプルを読み込みます。でもバンド移行を促進するために未使用の車線にサンプルバッファーを追加します。
    4. スタッキングのゲルを通って移動する色素フロントまで 65 V でゲルを実行します。分離ゲルに達したら、150 V に増加し、染料のフロントが、ゲルから完全に移行するまでを実行します。
    5. 電気泳動装置を解体し、優しく dd H2o. を入れた染色容器にゲルを転送穏やかな攪拌 5 分間座っているゲルをしましょう。新鮮な dd H2O のたびに使用でさらに 2 回繰り返します。
      注: このプロトコルで使用される Coomassie の染色法では、Coomassie の汚れ (材料の表を参照してください) に必要な典型的な固定の手順は必要ありません。別 Coomassie 準備を使用している場合は、必要に応じて固定の手順を調整します。
    6. 最終すすぎから水を除去し、ゲルをカバーするだけの十分な染色を追加します。少なくとも 1 時間のために穏やかな攪拌と座っているゲルをしましょう。
      注: を攪拌、染色のコンテナーはまた液体で覆われているゲルを維持しながらゲルを染色の動きを促進する装置に配置できます。
    7. コンテナーから汚れを削除して dd H2O を置き換える dd H2O でゲルを洗浄 30 分穏やかな動揺のためのゲルを浸します。(ゲル ヒストン バンドの明確な分離に示すような図 2表示する必要があります)。
  7. 使用するまで 4 ° C、ヌクレオソームを格納します。
    注: これらの条件で保存されると、ヌクレオソーム安定して数ヶ月。プロトコルはここで一時停止することができます。

2. ヌクレオソームの静的 AFM イメージング用マイカ表面の機能化

  1. 前述の脱イオン水 50 mM 1-(3-Aminopropyl) silatrane APS ストック溶液を調製します。このソリューションで使用するまで 4 ° C の30店 1 mL 因数。
    注意: 因数が 4 ° C で 1 年以上の保存することができます。59
  2. 15 mL dd H2o. の 50 ミリメートルの APS 株式の 50 μ L を溶解することにより雲母の変更作業 AP 1: 300 ソリューションを準備します。
    注: この実用的なソリューションは、数日間室温で保存することができます。
  3. 雲母 (マイカはここで使用される材料表参照) 高品質雲母シートの 1 x 3 cm のストリップをカットします。
    1. キュベットに斜めに置かれたときに作品が収まることを確認してください。両方の側面がたてに切断され、作品は肉厚 ~0.1 mm (図 3 a) まで、雲母の層を切断するのに鋭いピンセット、かみそりの刃、セロハン テープなどのヒントを使用します。すぐに AP いっぱいキュベットに雲母片を配置し、(図 3 b) で 30 分間インキュベートします。
  4. Dd H2O および 30 のソーク満ちてキュベットに雲母片を転送 s (図 3)。アルゴン流動下で APS 雲母ストリップの両側を完全に乾燥させます。
    注: 不織セルロースとポリエステル クリーン ワイプ (材料の詳細な推奨ワイプ) 乾燥するとき、マイカの端から水を吸湿発散性で支援するために使用できます。
  5. 使用乾燥雲母ストリップは今サンプル準備です。そうでなければ、きれいな、乾燥のキュベット (図 3 D) に作品を保存します。
    注: 環境は湿度が高い場合は、1-2 時間のための真空でストレージを追加を勧めします。プロトコルはここで一時停止することができます。

3. 静的 AFM イメージングのための APS 雲母ヌクレオソーム試料の調製

  1. いくつかの磁気 pucks に両面粘着テープを適用し、側に配置します。
  2. 目的のサイズ (ここで使用される MM AFM 計測器の 1 × 1 cm の正方形) に APS マイカ基板をカットします。きれいなペトリ皿にこれらの作品を配置してカバー。
  3. 準備 3 希釈組み立てヌクレオソーム (最終ヌクレオソーム濃度 0.5、1.0 と 2.0 nM) のバッファー含む 10 mM HEPES pH 7.5 と 4 mM MgCl20.22 μ m を使用してフィルター処理されました。
    注: 低最終濃度ヌクレオソームの損失を制限するには、希釈されるべきである APS 雲母の蒸着の直前に一度に 1 つずつ。
  4. 預金 APS 雲母片の中央にサンプルし、希薄化後のヌクレオソームの 5-10 μ L 2 分間インキュベートします。Dd H2O バッファーのすべてのコンポーネントを削除する 2 〜 3 mL のサンプルを優しくすすいでください。各 dd H2O 使用 ~0.5 mL 後余分なすすぎ水を削除する雲母を軽く振る。
    注: この手順で洗浄には、使い捨て注射器の使用をお勧めします。
  5. きれいなアルゴンのガスの光の流れの下で堆積したサンプルを乾燥させます。
    注: サンプル イメージを作成する準備が整いましたか真空キャビネットに格納することができますまたはデシケータ充填アルゴン.サンプル調製し、保存され前述は、1 年次のない品質の損失と準備イメージが作成されました。プロトコルはここで一時停止することができます。

4. ヌクレオソームの静的 AFM イメージング

  1. チップ ホルダーの AFM チップをマウントします。~ 40 N/m と 300 と 340 kHz の間の共振周波数のばね定数は、ヒントを使用して、(ここで使用するカンチレバーの材料表を参照してください)。
  2. 第 3 節で試料表面に連絡しないように注意して原子間力顕微鏡ステージ上調製した試料をマウントします。
  3. までの合計は最大でカンチレバー上レーザー、ゼロの近くに縦方向と横方向のたわみの値を調整します。
  4. その共振周波数を検索し、ドライブ振幅を調整 100 × 100 にイメージのサイズを設定する AFM プローブを調整 nm。アプローチを開始する従事するボタンをクリックします。
  5. 試料の表面が明らかに見られるまでに近づくと、一度徐々 に振幅 Setpoint を最適化します。1 x 1 μ m スキャン サイズと 512 × 512 ピクセルに解像度を増加します。画像集録を開始する従事するボタンに続いてキャプチャ ボタンをクリックします。
    注:図 4の画像は、イメージングのこれらのサンプルを期待できる滑らかな背景を表示します。
  6. ヌクレオソームのサンプルを分析するには、AFM 計測器解析ソフトウェアを使用して撮影した画像を開きます。
    1. 多項式線減算または同様の機能を使用してイメージを平らにします。
    2. 最小値の最小値と最大値の最高値を反映するようにカラー テーブルを設定します。各画像のこれらの値のレコードをままに後の手順で必要になります。
      注: これらの値を使用しない場合の高さデータ不正確になります後におけるヌクレオソーム コアの断面積が等しいではなく、さまざまな高さの台地として表示されます。
    3. オリジナル サイズの .tiff イメージとしてイメージをエクスポートします。罫線またはスケール バーで画像を保存する任意のオプションを選択解除します。
    4. 輪郭線長測定解析ソフトウェアでイメージを開きます。
    5. X、y および z を設定イメージに合わせてスケールします。
    6. 内部の長さ校正として測定し、1 つの端から他に自由な DNA の輪郭の長さを記録します。このキャリブレーション係数のヒストグラムを生成し、正規 (ガウス) 分布に適合する測定値を使用します。ピーク中心を分割 (c) x 塩基対の基板の長さによって。
      注: この値は、イメージ特定する変換係数ナノメートルから DNA の基本ペアです。
    7. 測定し、(図 5 a) 一貫性を保つのため、コアの中心に腕の自由端から各ヌクレオソームの両方の腕の輪郭の長さを記録します。
    8. 2 つのコアの垂直ペアから半分の最大 (半値幅) 値で幅完全収集各ヌクレオソーム コア断面積測定 (図 5 b 2 つの半値幅測定の平均し、各ヌクレオソーム腕から結果値の 2 分の 1 を減算コアの中心に出入 DNA から測定の長さのために正しいことがないです腕の長さの一部
    9. 各アーム長さ DNA 塩基対のアームの長さを取得する計算されたキャリブレーション係数 (手順 4.5.6) で割ります。
    10. アンラップされた基板の総塩基対の長さからヌクレオソームの腕の合計を差し引くことによって DNA のエクステントを計算します。ヒストグラムとしてこれらの値をプロットし、平均のラップされた塩基対の DNA のヌクレオソームの人口を取得する正規 (ガウス) 分布のピークを合わせてください。
    11. 測定断面から平均ヌクレオソームの高さを計算します。これをヒストグラムとしてプロットし、ヌクレオソーム人口の高さを取得する正規 (ガウス) 分布のピークを合わせてください。

5 ヌクレオソーム ダイナミクスのコマの AFM イメージング

  1. チップ ホルダーの原子間力顕微鏡の先端をマウントします。プローブ約 0.1 N/m のバネ定数と 7-10 kHz の共振周波数を使用することができます (ここで使用される片の材料のリストを参照してください)。
  2. 両面テープを使用して磁気パックに APS 雲母の 1 × 1 cm 部分を接続し、AFM 計測器のパックをマウントします。
  3. 1 nM 濃度 10 mM HEPES pH 7.5 と 4 mM MgCl2を含む 0.22 μ m フィルター画像バッファーにヌクレオソームを希釈します。
  4. 預金希薄のヌクレオソームの 5-10 μ L 2 分リンスの雲母片の中央に蒸着サンプル画像バッファーの 20µL を 2 回。2 回目のすすぎ後表面上のバッファーをイメージングの液滴を維持します。
  5. 先端が 100 ~ 500 まで先端と表面へのアプローチを手動で検索する最上位のビューのカメラを使用して表面から μ m。
  6. 先端と表面との間のギャップを埋めるための追加画像バッファーを追加します。この例では、約 50 μ L 画像バッファーのギャップを埋めるために十分です。先端の共振ピークを見つけます。
  7. 表面にコンピューター制御アプローチを始めます。近づくと、興味の ~ 500 nm 領域を選択する 1-2 μ m 領域イメージングを開始します。選択したこのエリア、512 × 512 ピクセルにデータ集録の密度を調整します。
  8. セット ポイントの電圧を調整して画像の品質を改善するために振幅のパラメーターをドライブします。無料振幅 10 nm 以下 〜 2 Hz のスキャン速度は、品質の画像をキャプチャする使用ことができます。タイムラプス原子間力顕微鏡を使用してキャプチャ ヌクレオソーム ダイナミクスの例は図 6に示します。

6 ヌクレオソーム ダイナミクスの高速コマ撮り AFM イメージング

注: 以下のプロトコルは、安藤グループ (金沢県金沢大学) によって開発された HS AFM 計測器に提供されます。60

  1. 液体用 APS 雲母を準備します。
    1. ガラス棒をガラス棒 - スキャナーの接着剤を用いた AFM スキャナー ステージにアタッチ (材料の表を参照してください)。10 分以上のこのドライをしましょう。
    2. 大きな雲母シートからそれらを打つことによって ~0.1 mm 直径 1.5 mm の雲母の厚い円形部分を作る。HS AFM 雲母ガラス棒の接着剤を使用 (材料の表を参照) HS AFM とドライ、10 分以上そのままにガラス棒にこの雲母片を付ける。粘着テープを使用してテープにも劈開層が見られるまでの層を切断します。
    3. 99 μ dd H2O 500 μ M APS ソリューションにするために 50 ミリメートル APS 株式の 1 μ L を希釈します。新たに裂かれた雲母の表面にこのソリューションの 2.5 μ L を入金させ 30 分に匹敵します。
      注: 機能付与、表面の乾燥を防ぐため、50 mL の円錐形遠心チューブのキャップ フィルター紙の湿った部分でフィットでき、スキャナーの上に配置。APS 株式が希釈される原子間力顕微鏡で観察することができますレートのダイナミクスを制御する静的な画像よりも液体用 3 倍未満。
    4. いくつか 〜 3 μ L 洗口液を適用することによって dd H2O の 20 μ L で雲母をすすいでください。不織布ワイプ、雲母の端に配置することによって完全に次の各リンス水を削除します。最終すすぎの後表面に dd H2O の 〜 3 μ L を配置し、任意特異的バインドされた AP を削除する 5 分以上座らせてください。
  2. HS AFM ホルダーにプローブを配置し、上向きの先端と原子間力顕微鏡ステージ上ホルダーを配置します。Dd H ~ 100 μ L を使用してホルダー2O は、0.22 μ m フィルター ヌクレオソーム イメージングの 2 ~ 100 μ L リンス続いてバッファーをリンスには、10 mM HEPES pH 7.5 と 4 mM MgCl2が含まれています。
  3. 行われるリンス、バッファー、先端を水没をイメージング ヌクレオソームの ~ 100 μ L で商工会議所を埋めます。レーザーでヒットまでは、カンチレバーの位置を調整します。AP-マイカ バッファーをイメージング フィルターのヌクレオソームの 20 μ L でリンスあたり ~ 4 μ L を使用してすすいでください。
  4. 1 の最終ヌクレオソーム濃度のバッファーをイメージング フィルターのヌクレオソームの 250 μ L にヌクレオソーム アセンブリ株式の 1 μ L を希釈 nM。表面にこの希釈の 2.5 μ L を預金し、2 分で表面を洗うを座らせて 〜 ヌクレオソーム イメージングのバッファー 2 倍の 4 μ L。最終すすぎの後、バッファーをイメージングで覆われた表面を残します。
    注: 場合、表面はヌクレオソーム サンプルを入金後リンスではなく、表面が急速に混雑するように。
  5. サンプルがダウン顔、スキャナーとチップ ホルダーの上にサンプルを設定します。アプローチを開始するには、セット ポイントの振幅、自由振動の振幅は0に近いs自動アプローチ関数を使用します。
    注: 理想的には、s = 0.95 注意場合0、ただし、0の 82% で動作が十分に働くでしょう。
  6. 表面がよく追跡されているまでは、セット ポイントを調整します。
    注: ヌクレオソームのサンプルの原子間力顕微鏡の先端からエネルギーの伝達を最小限に抑えるためにカンチレバーの振幅小さく保たれるべき、振幅 1 の低最適な nm。
  7. 画像領域約 150 × 150 を設定 200 x 200 nm 〜 300 ms イメージング フレームごとのデータ集録レートと nm。
    注: このイメージのサイズは通常いくつかのヌクレオソームのダイナミクスを同時にキャプチャするための十分です。人口の少ない表面は、これらのパラメーターに対する変更を呼び出すことができます。推奨されるフレーム レートは、スライディングなど他 (代表結果以下のセクションを参照) の中で開梱をループ、ヌクレオソーム ダイナミクスをキャプチャするのに十分です。

7 時間経過原子間力顕微鏡を使用してキャプチャ ヌクレオソーム ダイナミクスの解析

  1. HS 原子間力顕微鏡データ型 (.asd) から .tiff 画像に画像を変換します。
    1. 背景がある均一なコントラストまで平面または行のいずれかの関数を使用して原子間力顕微鏡システムの解析ソフトウェアを使用して画像を平らにします。
    2. 画像のコントラスト (カラー スケール) を自動に設定します。
      注: コントラストは、プレゼンテーションの目的ではなく分析、手動で調整することができます。これにより、変換後のイメージで失われる高さ詳細。
    3. .Mov ファイルとして画像の選択範囲を保存します。スケール バーを選択解除し、保存する前にオプションの国境します。
      ノート: フレームに縮尺記号を持つ画像の分析を行わないでください。これらは、イメージのサイズを変更、虚偽の測定になります。
    4. .Mov ファイルを適切なソフトウェアを使用して tiff 画像に変換 (材料の表を参照してください)。.Mov ファイルを作成するときに使用したのと同じフレーム レートを変換に使用します。
  2. 腕の長さの輪郭測定のこの測定のできる測定ソフトウェアで画像を開いて (材料の表を参照) を入力します。
    1. それがキャプチャされた、それらを一致するように画像のサイズを設定します。
    2. ヌクレオソーム コアの中心に、アームの先端から各ヌクレオソーム腕の輪郭の長さを測定し、スプレッドシート (図 4 a) で測定を記録します。
    3. ヌクレオソームのラップを解除した後は、フレームにラップされていない DNA 基板の長さを測定します。ヌクレオソームの計算を包むために使用される nm/bp 比の映画の特定の校正の使用します。
    4. ヌクレオソームのコア 2 つの断面プロファイルと裸の DNA (図 4 b) の 2 つを収集します。
    5. 断面プロファイルを表計算ソフトにインポート、プロファイルのすべてのポイントから最小 z 値を減算することによってプロットを正規化します。
    6. 半値 (半値幅) 各断面の幅と高さを計算し、各フレームの 2 つのプロファイルの値を平均します。
  3. 半分を引く各ヌクレオソームの半値幅値の腕はプロットと共に腕の合計散布。
    1. フレーム内の DNA は、ヌクレオソームにラップ解除後 DNA の測定から平均輪郭線長を計算します。
    2. DNA 基板の塩基対の長さによって自由な DNA の平均コンターの長さで割って nm/bp キャリブレーション係数を決定します。5.12 のセクションで説明したようこの値を使用して各フレームのヌクレオソームの折り返しを計算します。

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結果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

モノラル ヌクレオソーム最初、afm イメージング実験の連続希釈アセンブリ メソッド (図 1) を使用して作製した.準備のヌクレオソームは、不連続 SDS ページ (図 2) を使用してがチェックされたし。雲母表面は次に、APS は、高分解能観察 (図 3) の滑らかな背景を維持しながら表面のヌクレオソームをキャプチャを使用して官能基化。ヌクレオソームは APS 雲母上に堆積したし、その後静的 AFM イメージングの使用をイメージしました。アセンブリおよび沈着のコントロールとして H3 モノラル ヌクレオソーム調製し、, 静的な原子間力顕微鏡を使ってイメージ化します。H3 のモノラル ヌクレオソーム (図 4 a) のイメージ ヌクレオソーム人口のスナップショットが提供堆積、ヌクレオソームが正常に組み立てられていることを確認する前に瞬間が存在していた。2 nM ヌクレオソーム蒸着表面全体にヌクレオソ...

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ディスカッション

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上記で説明したプロトコルはむしろ簡単で、再現性の高い結果を提供しますが、いくつかの重要な問題を強調することができます。官能 AP 雲母は、信頼性と再現性のある結果を得るためキー基板です。APS マイカの高安定性は、画像処理基板を準備されている後少なくとも 2 週間使用できます使用を事前に準備することができますこの基板の重要な機能の 1 つです。59,61ただし、表面が破損するおそれ接着剤の蒸気で雲母金属パックのマウントに使用されます。したがって、プロトコル (セクション 2) で説明されているようにマウント雲母の両面テープタイプを使用することをお勧めします。場合接着剤の使用が必要な場合たとえば、液体の投射のための金属ディスクの雲母の取り付け用接着剤を使用しているユーザー セクション 6.1.3 HS AFM イメージングのサンプル準備のために記述されているものから変更する次の手順をお勧め.雲母は金属のディスクまたは他の固体材料に接着し、接着剤が固化した後に切断されます。接着剤の潜在的な蒸気を削除するアルゴンと雲母を爆破し...

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開示事項

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著者は、彼らは競合する金銭的な利益があることを宣言します。

謝辞

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著者の貢献: YLL と MSD 設計プロジェクトMSD は、ヌクレオソームを組み立てられます。MSD と ZS は、AFM 実験とデータ解析を実行しました。すべての著者を書いて、原稿を編集します。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
プラスミド pGEM3Z-601Addgene, Cambridge, MA26656
PCR PrimersIDT, Coralville, IAカスタムオーダー(FP) 5'- CAGTGAATTGTAATACGACTC-3' (RP) 5'-ACAGCTATGACCATGATTAC-3'DreamTaq
ポリメラーゼThermoFischer Scientific, Waltham, MAEP0701200ユニットのカタログ番号
精製キットQiagen, Hilden, Germany 2810450ユニットのカタログ番号
Tris baseSigma-Aldrich, St. Louis, MO10708976001250 g
EDTA のThermoFischer Scientific, Waltham, MA15576028500 g
(CENP-A/H4)2, recombinant humanEpiCypher, Durham, NC16-001050 ug
H2A/H2B, recombinant humanEpiCypher, Durham,NC15-031150 ug
H3 Octamer, recombinant humanEpiCypher, Durham, NC16-0001番号 50 ug
Slide-A-Lyzer MINI Dialysis Device Kit, 10K MWCO, 0.1 mLThermoFischer Scientific, Waltham, MA6957410 デバイスのカタログ番号
塩化ナトリウムSigma-Aldrich, St. Louis, MOS9888-500G500 mg
のカタログ番号アミコンウルトラ-0.5 mL遠心フィルター Millipore-sigma, Burlington, MOUFC5010088 デバイスのカタログ番号
HClSigma-Aldrich, St. Louis, MO258148-25ML25 mL
TricineSigma-Aldrich, St. Louis, MOT0377-25G25 g
SDSSigma-Aldrich, St. Louis, MOの11667289001 1 kg
過硫酸アンモニウム (AmmPS) のカタログ番号 Bio-Rad, Hercules, CA1610700番号 10 g
30% アクリルアミド/Bis 溶液、37.5:1Bio-Rad, Hercules, CA1610158500 mL
カタログ番号 TEMEDBio-Rad, Hercules, CA1610800番号 5 mL
4x Laemmli タンパク質サンプルバッファー SDS-PAGEBio-Rad, Hercules, CA用 カタログ番号 161074710 mL
2-MEカタログ番号Sigma-Aldrich, St. Louis, MOM6250-10ML番号 10 mL
ageRuler Prestained Protein Ladder 用 ThermoFischer Scientific, Waltham, MA26616カタログ番号 for 500 uL
Bio-Safe™Coomassie StainBio-Rad, Hercules, CA16107861 L
不織布クリーンルーム用ワイプのカタログ番号: TX604 TechniCloth TexWipe、Kernersvile、NCTX604
Muscovite Block MicaAshevilleMica、ニューポートニューズ、バージニア州グレード1
アミノプロピルシラトラーン(APS)に記載されているように合成 22
HEPESSigma-Aldrich、セントルイス、ミズーリH4034-25G25 g 25 g
Scotch TapeScotch-3M、セントポール、ミネソタ
州TESPA-V2 AFMプローブ(静止画像用)Bruker AFM Probes, Camarillo, CA
MSNL-10 AFMプローブ(標準タイムラプスイメージング用)Bruker AFM Probes, Camarillo, CA
Aron Alpha Industrial Krazy GlueToagosei America, West Jefferson, OHAA4802 gチューブ用カタログ番号
MgCl2Sigma-Aldrich, St. Louis, MOM8266-100Gカタログ番号100 g
Millex-GPフィルター、0.22 &マイクロ;mSigma-Aldrich, St. Louis, MOSLGP05010カタログ番号 10台用
BL-AC10DS-A2 AFMプローブ(HS-AFM用)オリンパス
Compound FG-3020C-20 フロロテクノロジー株式会社、Kagiya、Kagungai、Kajugai、Japan 
コンパウンド FS-1010S135-0.5 フロロテクノロジー株式会社、Kagiya、Kagungai、Kajugai、Japan 
MultiMode Atomic Force MicroscopeBruker-Nano/Veeco, Santa Barbara, CA
High-Speed Time-Lapse Atomic Force MicrosocopyToshio Ando, Nano-Life Science Institute, Kanazawa University, Kakuma-machi, Kanazawa, Japan
PCRカタログ番号 カタログカタログ番号 カタログ カタログ カタログ州

参考文献

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