構造と原子間力顕微鏡イメージングによるヌクレオソームのダイナミクスを調べる

Summary

ここでは、静的および時間経過の原子間力顕微鏡 (AFM) イメージング技術を使用して単一分子レベルでのヌクレオソーム粒子の特性評価にプロトコルを提案します。説明表面機能化手法により構造のキャプチャとダイナミクスのヌクレオソームのナノスケールで高解像度。

Abstract

ヌクレオソームのサブユニットの長い鎖であるクロマチンは、真核細胞の DNA 複製と転写を場所としてこのような重要なプロセスは、動的なシステムです。ヌクレオソームのダイナミクスは、dna 複製と転写の機械によってアクセスが提供し、クロマチン機能発現の分子機構に非常に貢献します。イメージング原子間力顕微鏡 (AFM) など単一分子の研究は、ヌクレオソーム構造とダイナミクスの役割の私達の現在の理解に大きく貢献しています。現在のプロトコルは、ヌクレオソームの構造と動的性質の研究に高分解能 AFM イメージングを有効にする手順を説明します。プロトコルは、H3 ヒストンがその相手の動原体タンパク質 (セントロメア) に置き換えられますセントロメア ヌクレオソームの得られた原子間力顕微鏡データによって示されています。プロトコルは連続希釈法によるモノラル ヌクレオソームのアセンブリに始まります。基板を準備する手順は、説明および説明ヌクレオソームの原子間力顕微鏡可視化修飾とヌクレオソーム イメージングに使用されるアミノプロピル silatrane (APS-雲母) マイカ基板の準備が欠かせません。ヌクレオソーム APS 雲母表面上まずヌクレオソーム人口のスナップショットをキャプチャする静的 AFM を用いたが作成されます。これらの画像解析からラップされたヌクレオソーム DNA のサイズなどのパラメーターを計測でき、このプロセスはまた、詳細な。液体内のプロシージャをイメージング タイムラプス AFM はいくつかのフレームをキャプチャすることができます高速コマ撮り AFM について 1 秒あたりヌクレオソーム ダイナミクスの。最後に、動的過程の定量的な解析を有効にするヌクレオソーム ダイナミクスの解析が説明し、イラストします。

Introduction

真核細胞の DNA は高度に凝縮し、染色体に組織です。¹染色体内の DNA 組織の最初のレベルは、147 のヌクレオソームのアセンブリ DNA の bp は密ヒストン八量体コアに巻いた。^2,3ヌクレオソーム粒子単位で非常に小型の染色体が形成されるまではそれから組織されるクロマチンの配列を形成する長鎖 DNA 分子を組み立てます。⁴クロマチンの分解は DNA 遺伝子の転写とゲノムの複製など重要な細胞プロセスで必要とされる、クロマチンが非常に動的なシステムを無料へのアクセスを提供します。^5,6,7さまざまなクロマチン レベルで DNA の動的プロパティを理解が間違いが細胞死やがんなどの病気の開発につながることができる分子レベルの遺伝的プロセスを解明するため重要です。⁸重要なクロマチン プロパティはヌクレオソームのダイナミクスです。^9,10,

Protocol

1. 連続希釈モノラル ヌクレオソームのアセンブリ

1. 生成し、シーケンスを配置オフ中心の Widom 601 ヌクレオソームを含む約 400 bp の DNA 基質を浄化します。⁵⁵
   注: 不要なディ ヌクレオソーム形成を制限する位置決めシーケンスの前後それぞれの '腕' を超えない ~ 150 bp。
   1. 設計されたプライマーと一緒にプラスミド pGEM3Z 601 を使用して PCR を使用して基板の DNA を増幅します。122 と 154 bp アーム長さがここで使用される 423 bp 基板、前方を使用 (5'-CAGTGAATTGTAATACGACTC-3') および逆引き (5'-ACAGCTATGACCATGATTAC-3') プライマー。
   2. 95 ° C に予熱チューブをサーマルサイクラーに反応混合物を含むを追加します。95 ° C、30 秒は、49 ° c の熱処理、72 ° c. で 35 s 延長 95 ° c: 30 の変性で 5 分間初期変性後 33 サイクルの次のプログラムを実行します。72 ° C 10 分 33 サイクル、次で最後の拡張を設定します。
   3. 市販 PCR 精製キットを使用して pcr から DNA を浄化します。PCR クリーンアップ列から DNA を溶出溶出バッファーを提供されるキットの代わりに 10 mM Tris バッファー (pH 7.5) を使用します。....

Results

モノラル ヌクレオソーム最初、afm イメージング実験の連続希釈アセンブリ メソッド (図 1) を使用して作製した.準備のヌクレオソームは、不連続 SDS ページ (図 2) を使用してがチェックされたし。雲母表面は次に、APS は、高分解能観察 (図 3) の滑らかな背景を維持しながら表面のヌクレオソームをキャプチャを使用して官能基化。ヌクレオソームは APS 雲母上に堆積したし、その後静的 AFM イメージングの使用をイメージしました。アセンブリおよび沈着のコントロールとして H3 モノラル ヌクレオソーム調製し、, 静的な原子間力顕微鏡を使ってイメージ化します。H3 のモノラル ヌクレオソーム (図 4 a) のイメージ ヌクレオソーム人口のスナップショットが提供堆積、ヌクレオソームが正常に組み立てられていることを確認する前に瞬間が存在していた。2 nM ヌクレオソーム蒸着表面全体にヌクレオソ.......

Discussion

上記で説明したプロトコルはむしろ簡単で、再現性の高い結果を提供しますが、いくつかの重要な問題を強調することができます。官能 AP 雲母は、信頼性と再現性のある結果を得るためキー基板です。APS マイカの高安定性は、画像処理基板を準備されている後少なくとも 2 週間使用できます使用を事前に準備することができますこの基板の重要な機能の 1 つです。^59,61ただし、表面が破損するおそれ接着剤の蒸気で雲母金属パックのマウントに使用されます。したがって、プロトコル (セクション 2) で説明されているようにマウント雲母の両面テープタイプを使用することをお勧めします。場合接着剤の使用が必要な場合たとえば、液体の投射のための金属ディスクの雲母の取り付け用接着剤を使用しているユーザー セクション 6.1.3 HS AFM イメージングのサンプル準備のために記述されているものから変更する次の手順をお勧め.雲母は金属のディスクまたは他の固体材料に接着し、接着剤が固化した後に切断されます。接着剤の潜在的な蒸気を削除するアルゴンと雲母を爆破し.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
プラスミド pGEM3Z-601	Addgene, Cambridge, MA	26656
PCR Primers	IDT, Coralville, IA	カスタムオーダー	(FP) 5'- CAGTGAATTGTAATACGACTC-3' (RP) 5'-ACAGCTATGACCATGATTAC-3'DreamTaq
ポリメラーゼ	ThermoFischer Scientific, Waltham, MA	EP0701	200ユニットのカタログ番号
精製キット	Qiagen, Hilden, Germany	28104	50ユニットのカタログ番号
Tris base	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	10708976001	250 g
EDTA の	ThermoFischer Scientific, Waltham, MA	15576028	500 g
(CENP-A/H4)2, recombinant human	EpiCypher, Durham, NC	16-0010	50 ug
H2A/H2B, recombinant human	EpiCypher, Durham,NC	15-0311	50 ug
H3 Octamer, recombinant human	EpiCypher, Durham, NC	16-0001	番号 50 ug
Slide-A-Lyzer MINI Dialysis Device Kit, 10K MWCO, 0.1 mL	ThermoFischer Scientific, Waltham, MA	69574	10 デバイスのカタログ番号
塩化ナトリウム	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	S9888-500G	500 mg
のカタログ番号アミコンウルトラ-0.5 mL遠心フィルター	Millipore-sigma, Burlington, MO	UFC501008	8 デバイスのカタログ番号
HCl	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	258148-25ML	25 mL
Tricine	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	T0377-25G	25 g
SDS	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	の	11667289001 1 kg
過硫酸アンモニウム (AmmPS) のカタログ番号	Bio-Rad, Hercules, CA	1610700	番号 10 g
30% アクリルアミド/Bis 溶液、37.5:1	Bio-Rad, Hercules, CA	1610158	500 mL
カタログ番号 TEMED	Bio-Rad, Hercules, CA	1610800	番号 5 mL
4x Laemmli タンパク質サンプルバッファー SDS-PAGE	Bio-Rad, Hercules, CA	用 カタログ番号 1610747	10 mL
2-ME	カタログ番号Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	M6250-10ML	番号 10 mL
ageRuler Prestained Protein Ladder 用	ThermoFischer Scientific, Waltham, MA	26616	カタログ番号 for 500 uL
Bio-Safe™Coomassie Stain	Bio-Rad, Hercules, CA	1610786	1 L
不織布クリーンルーム用ワイプのカタログ番号: TX604 TechniCloth	TexWipe、Kernersvile、NC	TX604
Muscovite Block Mica	AshevilleMica、ニューポートニューズ、バージニア	州グレード1
アミノプロピルシラトラーン(APS)	に記載されているように合成 22
HEPES	Sigma-Aldrich、セントルイス、ミズーリ	H4034-25G	25 g 25 g
Scotch Tape	Scotch-3M、セントポール、ミネソタ
州TESPA-V2 AFMプローブ(静止画像用)	Bruker AFM Probes, Camarillo, CA
MSNL-10 AFMプローブ(標準タイムラプスイメージング用)	Bruker AFM Probes, Camarillo, CA
Aron Alpha Industrial Krazy Glue	Toagosei America, West Jefferson, OH	AA480	2 gチューブ用カタログ番号
MgCl2	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	M8266-100G	カタログ番号100 g
Millex-GPフィルター、0.22 &マイクロ;m	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	SLGP05010	カタログ番号 10台用
BL-AC10DS-A2 AFMプローブ(HS-AFM用)	オリンパス
Compound FG-3020C-20	フロロテクノロジー株式会社、Kagiya、Kagungai、Kajugai、Japan
コンパウンド FS-1010S135-0.5	フロロテクノロジー株式会社、Kagiya、Kagungai、Kajugai、Japan
MultiMode Atomic Force Microscope	Bruker-Nano/Veeco, Santa Barbara, CA
High-Speed Time-Lapse Atomic Force Microsocopy	Toshio Ando, Nano-Life Science Institute, Kanazawa University, Kakuma-machi, Kanazawa, Japan