比増殖速度とロタウイルスのセル結合の能力のための試金

Summary

2 つのプロトコル、比増殖速度と他のプラクの試金と Rt-qpcr を使用してロタウイルスのセル結合の能力を測定するための 1 つをご紹介します。ロタウイルスの表現型の違いを確認するためは、これらのプロトコルがあります。

Abstract

ロタウイルスは、小児の下痢の主な病因の要因です。二本鎖 (ds) RNA ウイルスであり、高い突然変異率のための準種として知られている遺伝的に多様な人口を形作る。ここでは、特定の成長率とその表現型としてロタウイルスのセル結合能を測定する方法をについて説明します。ロタウイルスは、細胞受容体を認識するトリプシン処理され、MA104 細胞培養に接種されます。ウイルスの後代を含む上清が断続的に収集されます。ウイルス力価を確認するプラクの試金を使用 (プラーク形成単位: pfu) 各収集清。比増殖速度を推定するには、修正ゴンペルツ モデルに pfu/mL の経時データをフィッティング.セルの結合の試金、24 ウェル プレートの MA104 細胞をロタウイルスに感染して、細胞の受容体へのロタウイルスの吸着のための 4 ° C で 90 分間インキュベートします。低温では、宿主細胞に侵入からのロタウイルスを抑制します。非連結の粒子を削除する洗浄後 RNA は細胞受容体 cDNA 合成と逆のトランスクリプションの量的な PCR (RT qPCR) の順に接続されているから抽出されます。これらのプロトコルは、ウイルス系統間の表現の違いを調査するために適用できます。

Introduction

RNA ウイルスの突然変異の率、² DNA ベースの有機体のそれよりも高いため準種¹、知られている、遺伝的に多様な人口を形成します。準種の人口構造は、突然変異、淘汰圧、遺伝的浮動など人口の遺伝的要因の影響を受けます。単一の遺伝系統系統は、遺伝的多様性のため異なった表現型を示すかもしれない。たとえば、Rachmadi らは遊離塩素感度がプラーク精製ひずみ S7 PP3³から発信されたマウスノロ ウイルス核酸系統間で異なっていたことを示した。

ロタウイルス (レオウイルス科家族でロタウイルス属) は、準種²を形成 ds のエンベロープを持たない RNA ウイルスです。上記人口遺伝的要因に加えては、ゲノム遺伝子再集合は、このウイルスは、11 のセグメント化されたゲノム⁴ためにロタウイルスの遺伝的多様性を影響します。ロタウイルスは、主に乳児の下痢を引き起こすし、2013 年に乳児の死亡は約 250,000⁵推定しました。2 つのワクチンでいくつかの国で使用されて、ロタウイルス感染の負荷の低減に効果があったが、一部の研究者はワクチン エスケープ変異体^6,7,8,の存在を議論している今⁹. これらの突然変異体の特性はワクチン エスケープ メカニズムを理解することが重要です。

ここでは、固有の成長率と系統/変異体の間で表現の違いを理解するためにロタウイルスのセル結合能を評価するための 2 つの試金のためのプロトコルを提案する.ロタウイルス感染の成長曲線は、以前レポート¹⁰で提示されているが、特定の成長率などの成長パラメーターは通常測定されません。セル結合の試金実施には以前蛍光抗体染色法¹¹が含まれます。定量的表現型ウイルスの違いを話し合うことができるプラクの試金と Rt-qpcr を使用しての簡単な方法を紹介します。これらのメソッドはロタウイルスの表現型の特性のために適切、最終的に複数の遺伝子型の新しいワクチンの建設に貢献するかもしれない。

Protocol

1. 培地の準備

1. 細胞培養培地 (血清含有培地) をするためには、500 mL の蒸留水にイーグル MEM 粉末の 4.7 g を追加します。20 分せ部屋の温度中クール 120 ° c のオートクレーブ。ウシ胎児血清を追加 (最終濃度: 10%)、L-グルタミン (2 mM)、ペニシリン ストレプトマイシン (1%)、炭酸水素ナトリウム (1.125 g/L)。1 月に 4 ° C で保存します。
2. 前述の手順 1.1 でなくウシ胎児血清ウイルス伝搬の無血清培地を準備します。1 月に 4 ° C で保存します。
3. プラクの試金のイーグル MEM 培地 (フェノールレッドを非含む) 100 mL をオートクレーブで滅菌します。させる中、室温に冷却し、2% を追加売却、2% ペニシリン ストレプトマイシン、4 mM L-グルタミンと 2.25 g/L NaHCO₃。4 ° C でのストア
4. プラクの試金のためのオートクレーブで 2.5% の agarose のゲル 100 mL を滅菌します。プラクの試金を行った同じ日にゲルを準備します。水お風呂に 47 ° C でゲルを格納します。

2. 細胞培養

1. 液体窒素容器から MA104 細胞を含む cryotube を削除します。細胞の解凍が 37 ° C で水のお風呂に、cryotube を配置します。T75 フラスコで血清含有培地 20 mL に 1 mL の細胞懸濁液を追加します。2 または 3 日間で 37 ° C、5% CO₂インキュベーターでフラスコを孵化させなさい。
   注:懸濁液に最終濃度は約 10⁶セル/mL です。
2. 単層細胞が 80% の confluency に達すれば、上澄みを除去し、ダルベッコ PBS (リン酸緩衝生理食塩水) x 1 の 5 mL で 2 回洗浄を行う。
3. フラスコに 0.05% トリプシン-EDTA の 4 mL を追加し、フラスコから細胞をデタッチする 5 分の 37 ° C で孵化させなさい。15 mL チューブ 190 x g で 5 分間遠心し、細胞懸濁液を転送します。
4. 上澄みを廃棄し、血清を含む培地で準備 1.1 の 1 mL の播種細胞 (10⁶細胞) を再懸濁します。再懸濁細胞を 100 倍希釈培地とします。
5. 6 ウェル用プラクの試金) または (の細胞接着アッセイ) 24 ウェル プレートの各ウェルに希釈した細胞懸濁液 3 mL をそれぞれ追加します。2 または 3 日間飽和蒸気下で CO₂を 37 ° C、5% でインキュベーターの版を孵化させなさい。
   注:T75 フラスコ培養上清中容量 (30 mL) と比較して上清 (1 mL) のサンプル ボリュームを無視できますので時間コース サンプルの収集に適しています。一方、それぞれの上清にウイルスの感染力価は 6 ウェル プレートは通常行なわれるプラクの試金によって測定されます。24 ウェル プレートは、セル結合の試金に利用されます。

3 ロタウイルスの特定の成長率

注:アカゲザルのロタウイルス (RRV、遺伝子型: RRV 迅速かつ容易に MA104 細胞とプラークを形成できますので、G3P[3]) はこのプロトコルに利用されています。

1. 解凍する場所 37 ° c の水浴中-80 ° C で保存無血清培地でウイルスの懸濁液 (10⁷ pfu/mL) の 1 mL を含むチューブ。ブタ膵臓由来ウイルスの懸濁液 (最終的なトリプシン濃度は 4 μ G/ml) し渦の 1 mL に 1 μ g/μ L トリプシンを追加します。30 分間飽和蒸気下で CO₂を 37 ° C および 5% のウイルス懸濁液を孵化させなさい。
   注:他のソースからトリプシンを使用できますが、ロタウイルス感染に及ぼす影響を事前にテストする必要があります。
2. 活性化ウイルス懸濁液 0.1 pfu/細胞への感染 (MOI) の多様性を調整する無血清培地を希釈します。
3. (2.1) をめっきセル後 3 日 T75 フラスコの MA104 細胞 (80% 合流) に希釈ウイルスの懸濁液の 1 mL を追加、37 ° C 1 時間インキュベート、フラスコ 15 分毎を軽く振る。
4. フラスコにブタ膵臓由来トリプシンの 0.13 μ g/mL を含む無血清培地 30 mL を加えます。飽和蒸気下で CO₂を 37 ° C、5% でフラスコを孵化させなさい。
5. 0、6、12、18、24 でフラスコの上清 1 mL と 36 (または 48) h 後感染 (hpi) を収集し、ピペットを使用して 1.5 mL チューブに上清を置き換えます。
6. 凍結 (-80 ° C) を行い、3 回 37 ° C サイクルで湯せんで溶かします。4 ° C で 10 分間 12,600 x gでチューブを遠心分離します。上清を収集します。
7. 細胞画分を除去する蒸留水 0.2 μ m フィルターで上清をフィルター処理します。ウイルス力価を測定のプラクの試金に適用するまで冷蔵庫に保管して上澄み-80 ° C。
8. 37 ° C の水浴中で収集した上清 (ステップ 3.5) を含むチューブを配置します。10 倍希釈試料 1 mL に 4 μ g/mL のトリプシンを追加し、37 ° C、30 分インキュベートします。
9. 3.8、30 分インキュベーション中に開始時間コース サンプル (ステップ 3.5) から得られたウイルスの力価を測定のプラクの試金を洗って 6 ウェル プレート 2 ml の 1x PBS で 2 回 MA104 細胞血清含有培地を削除した後。
10. 直列無血清培地で培養サンプルを希釈し、各ウェルに希釈試料 1 mL を接種します。37 ° C および 5% CO₂飽和蒸気下で 90 分間プレートをインキュベートし、プレート 15 分毎を軽く振る。
11. インキュベーション後、接種を 6 ウェル プレートから取り外します。(手順 1.3) で調製した培地に 4 μ g/mL のトリプシンを追加します。優しく、即座に各ウェルに agarose のゲル (比率は 1:1) 混合培地 3 mL を追加します。
12. (Agarose のゲルは固体になる) まで 10 分以上室温でプレートを維持し、飽和蒸気下で CO₂を 37 ° C、5% で 2 日間インキュベートします。
    注:井戸の端から寒天培地と混合媒体を注ぐ。
13. 各ウェルに 1x PBS で希釈した 0.015% 中性赤溶液の 1 mL を追加し、飽和蒸気下で CO₂を 37 ° C、5% で孵化させなさい。3 h 後染料を削除し、飽和蒸気下で CO₂を 37 ° C、5% で 1 日間インキュベートします。
14. 次の日は、各ウェルに斑の数をカウントし、pfu/mL を計算します。プラークの数を確保するためにプラクの試金する前にセルの合流を入念にチェックします。

4 セル結合の試金

注:このプロトコルは、Gilling のレポート¹³に基づいています。

1. (2.1 と同じ方法) にブタ膵臓由来ウイルスの懸濁液 (最終的なトリプシン濃度は 4 μ G/ml) し渦の 1 mL に 1 μ g/μ L トリプシンを追加します。1 pfu/セルの MOI を調整する無血清培地にウイルス懸濁液を希釈します。
2. 24 ウェル プレート トリス緩衝生理食塩水 1 ml を 2 回 MA104 細胞を洗い流し (TBS; 2.53 g/L トリス基地、6.54 g/L の NaCl、KCl、0.3 g/L 0.046 g/l の Na₂HPO₄蒸留水 1 L に到達する)。
3. セル、24 ウェル プレートの各ウェルに希釈したウイルスを懸濁液 100 μ L を接種して, 穏やかな振動 15 分毎との 90 分のための 4 ° C で。
4. ウイルスの接種材料を削除し、TBS の 1 mL で 2 回洗浄を行う二本鎖 (ds) RNA のロタウイルスを抽出する 140 μ L の PBS x 1 と 560 μ L の RNA 抽出バッファーを追加 (材料の表を参照) を各ウェル。ピペット (10 x について、またはヘイズやバッファー内セルの汚染物質は発生しませんまで) で十分に混ぜます。
5. 製造元のプロトコルに従って二重鎖 RNA (dsRNA) を回復した後、dsRNA を変化させなさいすぐに氷の上にチューブを配置し、2 以上インキュベートに 5 分間、95 ° C で熱ブロックの dsRNA の抽出物を含む 1.5 mL チューブを配置します。分。
6. 逆のトランスクリプションを使用して cDNA を合成キット (材料の表を参照してください)。変性のウイルス RNA 溶液の 4 μ L を加える混合物 (表 1) の 16 μ l を含む PCR チューブと泡を生成しないようにピペット慎重に混ぜます。スピン ・ ダウン チューブ。
7. 表 2に示す条件下でサーマルサイクラーと逆のトランスクリプションを実行します。CDNA をすぐに使用しない場合は、最長 1 年間、-20 ° C で cDNA を含む PCR チューブを格納します。
8. 量的な PCR のプライマーを使用 (前方 5'-ACCATCTACACATGACCCTC-3'、逆; 5'-GGTCACATAACGCCCC-3')¹⁴と逆を挿入するプローブ (qPCR プローブ; 5'-/ファム/ATGAGCACA/クェンチャー/ATAGTTAAAAGCTAACACTGTCAA/タムラ/3 ')、ターゲット、963-ロタウイルスの NSP3 ゲノム セグメントの 1049 領域 (GenBank ST3 株: X81436)。
   注: クェンチャーが曽ら¹⁴によって設計されたプローブ挿入します。
9. 標準プラスミドを連続的に希釈 (10¹ 10⁶コピー/ml) PCR とグレードの qPCR の混合物 (表 3) に水と qPCR 次の表 4のマスター ミックス (20 μ L/サンプル) を作る。
10. 96 ウェル PCR プレートのほかにマスター ミックスの 20 μ L を追加し、10 回のピペッティングにより cDNA サンプルの 5 μ L、5 μ L 標準プラスミドをミックスします。表 4に示す条件によると qPCR システムの反応を開始します。
11. MA104 細胞表面にバインドされているロタウイルス ゲノムを計算するには、標準的なプラスミッドの既知ゲノム全塩基数の Ct 値と線形回帰を行いサンプルのゲノム数を見積もる。初期接種 (G₀)、細胞 (G_t) にウイルス粒子番号バインディングの比率を計算します。

Results

それぞれ図 1 a 2 aに特定の成長率やプラーク精製 RRV 株の細胞結合の試金のための 2 つのプロトコルの概要を示します。

比増殖速度の測定、最終的なウイルス力価に達する以上 10⁷ pfu/mL T75 フラスコに伝達するとき。最大濃度が 10⁷ pfu/mL 未満の場合 MA104 細胞なる合流がないか RRV トリプシンによってよくアクティブではなかった。感染単位のデータを使用して特定の成長率を推定するためいくつかの成長モデルがあります。このプロトコルの修正ゴンペルツ モデル¹²例として採用されています。

どこ N₀ 10⁴ pfu/mL 本研究では、N_t (10⁴ 10⁸ pfu/mL) が 0 と t ウイルス感染価 (pfu/mL) (例: 0、6、12、18、24、36) hpi、漸近値はそれぞれ、[ログ (N_∞/N₀)」(例: 3 に 4)、μ は比増殖速度 [1/h]、e はネイピアの定数、λ は遅れ期間 [h]。観測とモデルの値の差の平方和を最小化する解析ソフトウェアのソルバー関数モデルのパラメーターが得られました。図 1 bの例では、特定の成長率 (μ)、0.197 [1/h] と推定される、遅延期間 (λ) 6.61 [h] 初期価 (静止した段階で修正ゴンペルツ モデルと相対ウイルス力価に最小二乗法を適用ログ ・ スケール) (A) は 3.15 [ログ (N_∞/N₀)]。我々 は、合計で 6 ロタウイルス クローンをテストしているし、〜 0.27 [1/h] 0.19 比増殖速度の推定値。これらの推定値は、モデル当てはめの定量値の係数が 0.98 を超える信頼性の高い。

RRV ウイルス粒子が細胞表面に結合した約 10³コピー/ml (バインドの効率は約 1%) のセル結合の試金 (図 2 b) 24 ウェル プレートを使用する場合。アッセイは通常すべてのサンプルのための 3 回を実施し、トリプシンによる RRV の過剰洗浄と十分な活性化などいくつかの問題が発生するサンプルのコピー数に大きな差が見られる場合。約 36.0 を超える qPCR の Ct 値は望ましくないと私たちの qPCR の状態で検出限界以下にみなされています。

	ボリューム/1 反応
PrimeScript バッファー x 5	4.0 Μ L
PrimeScript RT 酵素ミックス私	1.0 Μ L
Oligo dT プライマー	1.0 Μ L
ランダム 6 mers	4.0 Μ L
脱イオン蒸留水	6.0 Μ
宿主のサンプル	4.0 Μ L
合計	20.0 Μ L

表 1: マスター ミックス ロタウイルス ゲノムの cDNA 合成用組成物。

温度 [° C]	時間
37	15 分
42	15 分
85	5 s
4	∞

表 2: ロタウイルス ゲノムの cDNA を合成する反応条件。

	ボリューム/1 反応
プレミックス Taq	12.5 Μ L
前方プライマー (10 μ M)	0.5 Μ L
逆プライマー (10 μ M)	0.5 Μ L
プローブ (10 μ M)	0.5 Μ L
染料 II を参照します。	0.5 Μ L
脱イオン蒸留水	5.5 Μ L
cDNA サンプル	5.0 Μ L
合計	25 Μ L

表 3: マスターは、ロタウイルス ゲノムの量的な PCR のコンポジションをミックスします。

温度 [° C]	時間
95	5 分
94	20 s	45 サイクル
60	1 分
72	5 分

表 4: ロタウイルス ゲノムの量的な PCR 反応条件。

図 1: ロタウイルス成長の推定とロタウイルスの成長曲線の図式的な概観します。ロタウイルスの感染単位 (A) はプラクの試金で測定します。(B) 曲線 (青線) は、当研究室 (白丸) で観測されたデータに基づく修正ゴンペルツ モデルによって近似化されました。特定の成長率 [μ];0.197 [h^-1] 遅れ期間 (λ);6.61 [h]、初期の力価 (対数目盛) に固定相で相対的なウイルス価 (、);3.15 [ログ (N_∞/N₀)]。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

図 2: 概要と当研究室における斑から精製した 5 の RRV 株の細胞結合の試金の代表的な結果。ロタウイルスを接種した A (A) 細胞培養プレートは細胞にウイルスの侵入を抑制するための 4 ° C で培養しました。培養細胞非連結のウイルス粒子の取り外し後 RT qPCR で細胞表面にバインドされたウイルス粒子由来のゲノムの数を定量化します。(B) セルの結合の結果分析された接種で出席者にバインドされたウイルス粒子の比率だった効率 (%) をバインドとして表示されます。大胆なバー: ボックスの中央値、末尾: 四分位数偏差、行の末尾: 最大値と最小値。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

Discussion

比増殖速度を測定するためのプロトコルは以前のものよりも簡単に、その細胞培養系が確立されていない限り、その他のウイルスについて、適合できます。本研究で我々 は RRV を使用 (G3P[3]) このひずみことができますを形成するため斑ヒトロタより MA104 細胞株を使用する場合。いくつかの人間のロタウイルスは、この細胞のプラークを形成できません。したがって、プラクの試金ではなくフォーカス ユニット (FFU) アッセイ¹⁵または中央組織培養感染量 (TCID50) を形成アッセイを適用できます多くのロタウイルス株¹⁶。特定の成長率を求める提案するプロトコルは他のウイルスの種類使用できますが、確立された細胞培養系が確立されていないウイルスには適していません。比増殖速度の実験を開始する前にそれはウイルス感染価が増加を開始すると事前に知っている方は、予備テストで静止した段階に達した。あまりにも多くの斑が存在する場合、ウイルス サンプルの希釈率を変更した後もう一度プラクの試金を実施しなければなりません。サンプルを収集する時間後感染 (hpi) は、静止した段階に到達するための適切な時間ポイントを逃した場合、指数関数的成長段階の斜面が過小評価可能性があるためにも重要です。修正ゴンペルツ モデルによって近似における決定係数常に計算してチェックします。修正ゴンペルツ モデルの適合性が低い場合、変更されたロジスティック ・ モデル¹²などの他の成長モデルは望ましいかもしれません。

プラクの試金のための洗濯または agarose のゲルのため PBS 中またはウイルスの接種材料を削除するとき、細胞の取扱いにそれぞれに速やかに追加する必要がある乾燥から細胞を防ぐために細胞培養プレートのも。同時に、PBS またはセルに agarose の井戸から外れない優しく注ぐ必要があります。この手順は、両方の試金 (3.9 と 3.11 のステップ) で最も重要です。プラクの試金にあまりにも多くのサンプルがある場合お勧めしますいくつかの培地瓶に agarose のゲル (100 mL 各最大を推奨) を分割して部屋で約 10 分以内 agarose を使用直前にゲルが固化するまでボトルの保温温度。トリプシンは高温¹⁷に脆弱であるため、媒体と十分に冷却後プラクの試金のための agarose にトリプシン溶液を追加する必要があります。

セル結合の試金の細胞の侵入を防ぐために 4 ° C で細胞へのウイルスのバインディングの培養を行う必要があります。Gilling の方法¹³によると細胞がので、穏やかな揺れが必要 15 分毎孵卵中における低温乾燥になりやすい。その他のキットを活用する RNA 抽出キットを置き換えることができます。RT qPCR の標準曲線の傾きは、約 3.3 をする必要があります、決定係数が 0.98 以上にする必要があります。細胞におけるウイルスの局在を可視化する蛍光顕微鏡と比較して、アッセイより迅速かつウイルスへの蛍光物質の結合は必要ないので使いやすい。

最近では、同様の細胞構成と機能を示すひと腸 enteroid (HIE) ひと消化管上皮としてロタウイルスの伝播の¹⁸利用可能になりました。日枝の使用が可能となり特定の成長率とロタウイルスの培養株の細胞結合の能力を評価します。また、ここで説明した両方の実験両方の表現型¹⁹に対する薬剤の効果の評価に適用できます。ここで紹介するプロトコルは、定量的議論する様々 な条件下でのロタウイルス株の表現型のパラメーターの値を変更することが可能。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
7500 リアルタイムPCRシステム	Applied Biosystems		qPCR
Agar-EPI	Nakalai Tesque, Inc	01101-34	プラークアッセイ
リン酸水素二ナトリウム	和光純薬工業株式会社	194-02875	細胞結合アッセイ
Eagle's MEM "Nissui"	ニッスイ製薬株式会社	_05900	細胞培養
イーグルのMEM「ニッスイ」	ニッスイ製薬株式会社	_05901	プラークアッセイ
EasYFlask 75 cm2	サーモサイエンティフィック	156499	細胞培養
ウシ胎児 セリム、認定、USDA承認地域	Gibco	10437028	細胞培養・プラークアッセイ
フォワード/リバースプライマー	ユーロフィン ゲノミクス		qPCR
L-グルタミン・200 mM ソリューション	ギブコ	2530081	細胞培養・プラークアッセイ
中性赤	和光純薬	140-00932	プラークアッセイ
PBS (-) 「ニッスイ」	ニッスイ薬品工業株式会社	_05913	細胞培養・プラークアッセイ
ペニシリン・ストレプトマイシン Liguid	Gibco	15140122	細胞培養・プラークアッセイ
塩化カリウム	和光純薬	163-03545	細胞結合アッセイ
Premix ExTaq (Perfect Real Time)	タカラバイオ	RR039A	qPCR
PrimeScriptTN RT試薬キット(パーフェクトリアルタイム)	タカラバイオ株式会社	RR037A	cDNA合成
PrimeTime qPCR Probes	Medical and Biological Laboratories Co., Ltd.		qPCR
QIAamp Viral RNA Mini Kit	QIAGEN	52904	RNA抽出
重炭酸ナトリウム	和光純薬	199-05985	細胞培養・プラークアッセイ
塩化ナトリウム	和光純薬	198-01675	細胞結合アッセイ
組織培養プレート 24ウェルプレート	TPP	92024	細胞結合アッセイ
組織培養プレート	TPP	92006	プラークアッセイ
トリズマベース	SIGMA-ALDRICH	T1503	細胞結合アッセイ
ブタ膵臓由来トリプシン	SIGMA-ALDRICH	T0303-1G	ロタウイルス
トリプシンEDTA(0.05%)、フェノールレッド	Gibco	25300054	細胞培養
垂直型96ウェルサーマルサイクラー	Applied Biosystems		cDNA合成