方法論記事

ナノ製剤中のエンドトキシン検出カブトガニ リムラス ライセート (ラル) 試金を使用して

DOI：

10.3791/58830

⸱

2019年1月30日

 , 
1Nanotechnology Characterization Lab., Cancer Research Technology Program, Frederick National Laboratory for Cancer Research sponsored by National Cancer Institute

この記事について

サマリー

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ナノのエンドトキシンの検出は、ナノメディシン分野の難問の 1 つを表します。ナノ粒子の潜在的なエンドトキシン汚染を推定する 3 種類のラール フォーマットで構成されるフレームワークを説明する事例を紹介します。

要約

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グラム陰性細菌の細胞壁コンポーネント内毒素 (リポ多糖とも呼ばれます) は、炎症、発熱、低刺激や高血圧を引き起こすことができ、極端な場合、可能性があります組織・臓器の損傷につながることができます医薬品に存在、する場合致命的になります。したがって、医薬品中のエンドトキシン量は規制厳しく。エンドトキシンの検出と定量に使用できる方法の中でカブトガニ リムラス ライセート (ラル) 試金、世界中に使用されます。一方、医薬品は、ラール アッセイに干渉できる、ナノ処方はその複雑さのための特定の挑戦を表しています。本稿の目的は、ナノ、ナノ粒子配合薬で大原の推定に経験の浅い研究者に実用的なガイドを提供することです。ここで、濁度、発色性を含む 3 つのラール形式やゲル血栓アッセイを行うため実用的な推奨事項を説明します。これらのアッセイは、ナノテクノロジーに基づく医薬品、ワクチン、アジュバントのエンドトキシン汚染を決定する使用できます。

概要

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エンドトキシンは、グラム陰性細菌の細胞壁1,2の建物ブロックです。それは非常に免疫細胞をアクティブにすることができます (picogram) 濃度1,2を低します。発熱、低血圧、高血圧、多臓器不全を含むより深刻な健康上の問題のため、エンドトキシンに応答細胞によって生成される炎症性メディエーター (サイトカイン、ロイコトリエン、エイコサノイド等)は、します。1,2,3.、免疫介在性の副作用のエンドトキシンによって引き起こされる重大度エンドトキシンの組成と構造によって決定され、国際エンドトキシン単位 (IUs または EUs)3単位、その効力に依存します。体重の 1 キログラムあたりこれらの単位数を使用して、しきい値発熱性エンドトキシン投与量を設定します。この線量は、医薬品 5 EU/kg 投与による髄腔内のルートがすべてのルートです。髄腔内投与によるルートの製品、放射性医薬品、眼内液ボディ表面の平方メートル当たり投与....

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プロトコル

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1. ナノ粒子サンプルの準備

  1. ラルの研究サンプルのグレードの水を準備します。
  2. サンプルの pH は、6-8 の範囲外は、パイロジェン フリー水酸化ナトリウムや塩酸を用いて pH を調整します。
  3. ラルを使用してグレード水は研究サンプルのいくつかの希釈液を準備します。最高の希釈が最大有効希釈 (MVD) を超えていないことを確認します。MVD 推定の詳細についての議論を参照してください。

2. 試薬ラル フォーマット間共通の準備

  1. 0.1 n. の濃度で作業ソリューションを準備する LAL 試薬水のパイロジェン フリーを使用して希釈濃水酸化ナトリウム素材
  2. LAL 試薬水のパイロジェン フリーを使用して濃塩酸株式を希釈し、0.1 n. の最終的な集中で実用的なソリューションを準備
  3. コントロールの標準的なエンドトキシン (CSE) の準備
    1. メーカーによって供給された分析の証明書によると CSE を再構成します。
      注: は、証明書で提供される情報に関する重要な注意事項の説明を参照してください。材料表カタログ番号とラルの異なる形式で特定の CSE の定式化のアプリケーションの詳細についてを参照してください。
  4. LAL 試薬の調製
    1. 製造元によって提....

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結果

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ラルの試金でこの定式化をテストした後に生成されるデータの例は表 1に示します。希釈 5 で発色のラルとペグ化リポソーム封入ドキソルビシンの干渉。ただし、この干渉は、大きい希薄によって克服されました。この製剤は希釈 50 と濁度と発色ラル、500 および濁度ラルで希釈 5 テストされたとき、スパイク回復は 50 と 200% の間だった。希釈倍率によって調整の結果は両方のアッセイの希薄の間の一貫性。また、結果は 3 アッセイ フォーマット間で一貫してあった。

.......
テストのサンプル濁度ラル、EU/mg (スパイク回復、%)発色ラル、EU/mg (スパイク回復、%)

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ディスカッション

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このプロトコルで提供される情報は15,26の前に記述され、米国食品医薬品局 (US FDA または FDA) や米国薬局方 (USP)4刊規制のいくつかの文書に依存しています。,5,6,27、プロトコル STE1.2 (濁度ラル)、STE1.3 (ゲル血栓ラル) の NCL のウェブサイト20もありと、STE1.4 (発色ラル)。

テスト ナノ材料は、LAL 試薬水または無菌、パイロジェン フリーの PBS のいずれかを用意しています。研究サンプルの pH は、低 (< 6) および高い (> 8) pH ライセートの最適なパフォーマンスを妨げるために重要です。テス.......

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開示事項

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著者が明らかに何もありません。

謝辞

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調査は国立がん研究所から連邦政府の資金によってサポートされた国立衛生研究所、契約 HHSN261200800001E の下で。この文書のコンテンツ ビューまたは政策の保健社会福祉省、必ずしも反映しないも言及されている商号、商品、または組織は、米国政府によって裏書を意味します。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
濁度LALアッセイ
水酸化ナトリウムシグマS2770必要に応じて、サンプルのpHを6〜8 塩
酸シグマH9892必要に応じて、サンプルのpHを6〜8
LAL試薬アソシエイトのケープコッドT0051試薬は濁度で使用できますアッセイのみ
E0005エンドトキシン標準アソシエイトこの試薬は、濁度およびゲル凝固アッセイと使用することができます
LALグレードの水WP0501のアソシエイトこの試薬は、任意のLALフォーマットの
Glucashieldアソシエイトと使用することができます ケープコッドGB051-25ベータグルカン
からの偽陽性応答を防ぐために使用使い捨てエンドトキシンフリーガラス希釈チューブ 12 x 75 mmケープコッドTB240これらのチューブは、3つのアッセイすべてで使用できます
使い捨てエンドトキシンフリーガラス反応チューブ 8 x 75 mmケープコッドTK100これらのチューブは、濁度および発色アッセイで使用することができる
パイロジェンフリーチップ 容量0.25および1.0mLRAININPPT25、 PPT10とピペットは、エンドトキシンを吸着し、LALアッセイを妨げる浸出物を放出する可能性があります。これらのレイニンチップは、LALアッセイでの最適な性能が検証され、確認されたため
、使用されます パイロジェンフリーの微量遠心チューブ、2.0mLッペンドルフ22600044他の同等の供給品が使用可能
パイロジェンフィーコンビチップ、5mLッペンドルフ30089669他の同等の供給品が使用可能
ピペッターエッペンドルフ4982000020を繰り返す 他の同等の供給品が使用可能
Microcetrifuge任意のブランドが使用可能
冷蔵庫、2-8 C任意のブランド任意のブランドが使用可能
Vortex任意のブランド使用可能
Freezer、-20 C任意のブランド任意のブランドが使用可能
Pyros KinetixまたはPyros Kinetix Flex readerコッドPKF96の仲間他の機器も使用できます。ただし、このアッセイで使用されるLAL試薬とエンドトキシン標準は最適化が必要な場合があります。他の器械使用時は、指示のための器械およびLALのキットの製造業者を参照して下さい
Chromogenic LALのAssay
Pyrochrome LALの試薬の仲間 ケープコッドCG1500-5この試薬は、
ケープコッドEC010制御エンドトキシン標準この規格は、濁度およびゲル凝固LALに使用されるものとは異なります。それは発色学の研修
ナトリウムシグマS2770必要ならば、それは6-8
酸シグマH9892使用されている 必要なとき、それは6-8 LALの等級水間にあるようにサンプルpHを調節するのに使用されている
ケープコッドWP0501この試薬はあらゆるLALフォーマット
Glucashield緩衝液と使用することができるケープコッドGB051-25ベータグルカンからの偽陽性反応を防ぐために使用
使い捨てエンドトキシンフリーガラス希釈チューブ 12 x 75 mmケープコッドTB240これらのチューブは、3つのアッセイすべてで使用することができます
使い捨てエンドトキシンフリーガラス反応チューブ 8 x 75 mmケープコッドTK100これらのチューブは、濁度および発色アッセイ
と使用することができますパイロジェンフリーチップ(容量0.25mlおよび1.0mlレイニンPPT25、PPT10とピペットは、エンドトキシンを吸着し、LALアッセイを妨げる浸出物を放出する可能性があります。これらのレイニンチップは、LALアッセイでの最適な性能が検証され、確認されたため
、使用されます パイロジェンフリーの微量遠心チューブ、2.0mLッペンドルフ22600044他の同等の供給品が使用可能
パイロジェンフィーコンビチップ、5mLッペンドルフ30089669他の同等の供給品が使用可能
ピペッターエッペンドルフ4982000020を繰り返す 他の同等の供給品が使用可能
Microcetrifuge任意のブランドが使用可能
冷蔵庫、2-8 C任意のブランド任意のブランドが使用可能
Vortex任意のブランド使用可能
Freezer、-20 C任意のブランド任意のブランドが使用可能
Pyros KinetixまたはPyros Kinetix Flex readerコッドPKF96の仲間他の機器も使用できます。ただし、このアッセイで使用されるLAL試薬とエンドトキシン標準は最適化が必要な場合があります。他の器械使用場合は、指示のための器械およびLALのキットの製造業者を参照して下さい
Gel-Clot LALのAssay
LALの試薬の仲間 ケープコッドG5003この試薬はゲル血栓の試金に特有である
コッドE0005制御エンドトキシン標準的なこの試薬は濁度およびゲル血餅の試金と使用することができます
水酸化ナトリウムシグマS2770必要に応じて、サンプルのpHを6-8
塩酸シグマH9892必要に応じて、サンプルのpHを6-8
LALグレードの水ケープコッドWP0501この試薬は、
ケープコッドGB051-25Glucashieldバッファーベータグルカンからの偽陽性反応を防ぐために使用
使い捨てエンドトキシンフリーガラス希釈チューブ 12 x 75 mmケープコッドTB240これらのチューブは、3つのアッセイすべてと一緒に使用することができます
使い捨てエンドトキシンフリーガラス反応チューブ 10 x 75 mmケープコッドTS050これらのチューブは、
容量0.25および1mLニンPPT25、PPT10チップとピペットは、エンドトキシンを吸着し、LALアッセイを妨げる浸出物を放出する可能性があります。これらのレイニンチップは、LALアッセイでの最適な性能が検証され、確認されたため
、使用されます パイロジェンフリーの微量遠心チューブ、2.0mLッペンドルフ22600044他の同等の供給品が使用可能
パイロジェンフィーコンビチップ、5mLッペンドルフ30089669他の同等の供給品が使用可能
ピペッターエッペンドルフ4982000020を繰り返す 他の同等の供給品が使用可能
Microcetrifuge任意のブランドが使用可能
冷蔵庫、2-8 C任意のブランド任意のブランドが使用可能 任意のブランドが使用可能
任意のブランドが使用可能
フリーザー、-20 C任意のブランドが使用可能 任意のブランドが使用可能
ウォーターバス、37 C任意のブランドどのブランドでも使用できますが、水の流れが血栓形成に影響を与え、偽陰性の結果につながるため、水循環をオフにするか、非循環型ウォーターバスを使用することが重要です
の間に調整するために使用されます の間に調整するために使用されます このケープコッドのを制御する ケープコッドバッファーの仲間 の仲間 の仲間 チップエエが ケープの発色性アッセイ協会に特有です水酸化の最適性能のために最大限に活用される 塩の間にあるようにサンプルpHを調節するのにの仲間 の仲間 の仲間 の仲間 チップエエが ケープの ケープの仲間 の間に調整するために使用されます の間に調整するために使用されます の仲間 の任意のLAL形式の仲間と一緒に使用できますの仲間 の仲間 のゲル凝固アッセイパイロジェンフリーチップで使用するためのものです レイエエ

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Perkins, D. J., Patel, M. C., Blanco, J. C., Vogel, S. N. Epigenetic Mechanisms Governing Innate Inflammatory Responses. Journal of Interferon & Cytokine Research. 36 (7), 454-461 (2016).
  2. Vogel, S. N., Awomoyi, A. A., Rallabhandi, P., Medvedev, A. E.

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