ナノのエンドトキシンの検出は、ナノメディシン分野の難問の 1 つを表します。ナノ粒子の潜在的なエンドトキシン汚染を推定する 3 種類のラール フォーマットで構成されるフレームワークを説明する事例を紹介します。
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この記事について
サマリー
要約
グラム陰性細菌の細胞壁コンポーネント内毒素 (リポ多糖とも呼ばれます) は、炎症、発熱、低刺激や高血圧を引き起こすことができ、極端な場合、可能性があります組織・臓器の損傷につながることができます医薬品に存在、する場合致命的になります。したがって、医薬品中のエンドトキシン量は規制厳しく。エンドトキシンの検出と定量に使用できる方法の中でカブトガニ リムラス ライセート (ラル) 試金、世界中に使用されます。一方、医薬品は、ラール アッセイに干渉できる、ナノ処方はその複雑さのための特定の挑戦を表しています。本稿の目的は、ナノ、ナノ粒子配合薬で大原の推定に経験の浅い研究者に実用的なガイドを提供することです。ここで、濁度、発色性を含む 3 つのラール形式やゲル血栓アッセイを行うため実用的な推奨事項を説明します。これらのアッセイは、ナノテクノロジーに基づく医薬品、ワクチン、アジュバントのエンドトキシン汚染を決定する使用できます。
概要
エンドトキシンは、グラム陰性細菌の細胞壁1,2の建物ブロックです。それは非常に免疫細胞をアクティブにすることができます (picogram) 濃度1,2を低します。発熱、低血圧、高血圧、多臓器不全を含むより深刻な健康上の問題のため、エンドトキシンに応答細胞によって生成される炎症性メディエーター (サイトカイン、ロイコトリエン、エイコサノイド等)は、します。1,2,3.、免疫介在性の副作用のエンドトキシンによって引き起こされる重大度エンドトキシンの組成と構造によって決定され、国際エンドトキシン単位 (IUs または EUs)3単位、その効力に依存します。体重の 1 キログラムあたりこれらの単位数を使用して、しきい値発熱性エンドトキシン投与量を設定します。この線量は、医薬品 5 EU/kg 投与による髄腔内のルートがすべてのルートです。髄腔内投与によるルートの製品、放射性医薬品、眼内液ボディ表面の平方メートル当たり投与薬がある 100 EU/m2、0.2 EU/mL、175 EU/V は、異なるしきい値の発熱量 (V は、管理するためのもの製品の容積)、および 0.2 EU/kg、それぞれ4。さまざまな医薬品やデバイス、発熱性しきい値線量の詳細については提供され、他の場所で説明した4,5,6。
動物は、エンドトキシン反応への感度が大きく異なります。人間、非ひと霊長類、ウサギ、大原3に最も敏感の種。患者におけるエンドトキシンを介した副作用を回避し、非臨床毒性評価と有効性の研究の不正確な結論を防ぐため、正確に検出し、両方の臨床および前臨床グレードの製剤でエンドトキシンを定量化することが不可欠です。現在利用可能ないくつかのメソッドは、このタスクを実現できます。それらの 1 つは、カブトガニ リムラス ライセート (ラル) 試金、広く世界中潜在的なエンドトキシン汚染だけでなく細菌感染症7,8,9を検出するため画面バイオメディカル製品に使われています。ライセートは amoebocytes から作製した、カブトガニカブトガニ ポリュフェモスの血液に存在するセル7北アメリカ大陸の東海岸に存在します。興味深いことに、いくつかの異なる種のカブトガニがある (日本のマガキとカブトガニ)アジア10で。日本リムラス ライセート (TAL) は、アジア数カ国でその他に関する史的10で、ラルを使用する方法と同様のエンドトキシンの検出に使用されます。(タル ・ ラル) 溶解液には、活性化プロテアーゼ活性を付与する蛋白質のグループが含まれています。これらの蛋白質、いわゆる係数 C の 1 つは、エンドトキシンとの接触時にアクティブになります。活性化因子 C 切断係数 B は、順番にも、プロテアーゼとなり凝固酵素を生産するプロ凝固酵素を裂きます。この反応の連鎖の結果はサンプル濁度と、発色基質ゲル血栓、濁度、および発色アッセイのための基盤として、色の製品の外観の存在下で増加、ゲルの形成それぞれ。米国食品医薬品局 (FDA) のガイダンスで説明必須のラール形式はありません、ゲル血栓分析5 に基づいて業界ドキュメント、ラルの異なるフォーマット間のテストの結果に相違がある場合決定が行われます.
一般的に使用される多くの研究所化学薬品 (e.g。、EDTA) 製品 (例えば、ペニシリン) がラールを妨げる知られていた薬剤の試金の11と。干渉は、通常試験材料を含む溶液に濃度既知のスパイク エンドトキシン標準のリカバリを評価することによって識別されます。スパイクの回復が 50% 未満、または 200% 以上、ラルの結果分析の場合特定のテスト材料が阻害や促進、それぞれ4のため正しくありません。ナノテクノロジーに基づく製剤は、しばしば複雑、メカニズム12,13,14のさまざまなラルを妨げます。干渉を克服するために多くの方法を記載されている: サンプル溶解特定のバッファーと界面活性剤で加熱し、加熱し、過剰なサンプルを補うことによって脂質中空材の破壊タンパク質不活性化二価陽イオン5,12,13,14,15。ラル干渉を克服することができない場合の代替方法も記載されている: ELISA、HEK TLR4 レポーター細胞ライン試金および質量16,17,18, 19。
ここで、ゲル血栓、濁度、および発色のラール アッセイを実施の実験プロシージャを示します。これらの試金はプロトコル STE1.2 (濁度ラル)、STE1.3 (ゲル血栓ラル) ナノテクノロジー キャラクタリゼーション ラボ (NCL) ウェブサイト20利用頂けますと STE1.4 (発色ラル)。同じナノ処方を特徴付けるために少なくとも 2 つの異なる形式を実施することをお勧めします。濁度と発色のラルの結果に反対、ゲル血栓結果は5が考慮されます。ラルの 2 つの形式の結果が一致しない場合ラルを確認する単球活性化テスト (マット) またはウサギ発熱性物質試験 (RPT) を用いた研究の結果、その他は21を実施しました。エンドトキシン検出の各メソッドを使用し、pyrogenicity 評価、利点と制限21,22,23,24に注意することが重要です。指定されたナノテクノロジーの定式化を特徴付けるために使用プロシージャの制限を認識しそのナノ定式化に最適のプロシージャの使用のための科学的根拠を得るために不可欠です。
本研究では、ペグ化リポソーム封入ドキソルビシンはモデル ナノ粒子製剤として使用されました。この定式化を 1995 年に米国 FDA に承認されており、癌患者世界25の治療に使用します。
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プロトコル
1. ナノ粒子サンプルの準備
- ラルの研究サンプルのグレードの水を準備します。
- サンプルの pH は、6-8 の範囲外は、パイロジェン フリー水酸化ナトリウムや塩酸を用いて pH を調整します。
- ラルを使用してグレード水は研究サンプルのいくつかの希釈液を準備します。最高の希釈が最大有効希釈 (MVD) を超えていないことを確認します。MVD 推定の詳細についての議論を参照してください。
2. 試薬ラル フォーマット間共通の準備
- 0.1 n. の濃度で作業ソリューションを準備する LAL 試薬水のパイロジェン フリーを使用して希釈濃水酸化ナトリウム素材
- LAL 試薬水のパイロジェン フリーを使用して濃塩酸株式を希釈し、0.1 n. の最終的な集中で実用的なソリューションを準備
- コントロールの標準的なエンドトキシン (CSE) の準備
- メーカーによって供給された分析の証明書によると CSE を再構成します。
注: は、証明書で提供される情報に関する重要な注意事項の説明を参照してください。材料表カタログ番号とラルの異なる形式で特定の CSE の定式化のアプリケーションの詳細についてを参照してください。
- メーカーによって供給された分析の証明書によると CSE を再構成します。
- LAL 試薬の調製
- 製造元によって提供される分析の証明書によると LAL 試薬を再構成します。
注: は LAL 試薬調製に関する重要な詳細についての議論を参照してください。材料表カタログ番号とラルの別の形式で与えられた LAL 試薬製剤の応用の詳細についてを参照してください。
- 製造元によって提供される分析の証明書によると LAL 試薬を再構成します。
3. 濁度ラル アッセイ
- 標準試料の作製
- ラル グレード水量 900 μ L と CSE の 100 μ L を使用すると、0.001 から 1 EU/ml の濃度範囲の標準校正の準備を有効にするために必要な多くの中間希釈を準備します。
- 最初のラベルのチューブ、各チューブにラル グレード水量 900 μ L を追加します。1EU/mL の濃度の校正標準を準備する 10 の EU/mL solutionn の 100 μ L を追加します。
- 3 つの低いキャリブレーション基準を準備する上記のように連続 10 倍希釈を繰り返します。至る 0.001 EU/mL の 1 4 つの校正基準が用意されていることを確認します。
- 品質管理の準備
- ラル グレード水 950 μ L で 1 EU/mL CSE 溶液 50 μ L を組み合わせることにより 0.05 EU/mL 品質管理を準備します。
注: は、コントロールの準備の詳細について議論を参照してください。
- ラル グレード水 950 μ L で 1 EU/mL CSE 溶液 50 μ L を組み合わせることにより 0.05 EU/mL 品質管理を準備します。
- コントロールの抑制/強化 (IEC) の準備
- 1 EU/mL CSE ソリューションを 25 μ l 添加し、指定された希釈テスト ナノマテリアルの 475 μ L を組み合わせることにより 0.05 EU/mL の濃度と IEC を準備します。
メモ: 追加の詳細についての説明を参照します。
- 1 EU/mL CSE ソリューションを 25 μ l 添加し、指定された希釈テスト ナノマテリアルの 475 μ L を組み合わせることにより 0.05 EU/mL の濃度と IEC を準備します。
- 実験手順
- 事前に約 30 分のそれを回すことによってウォーム アップする楽器を許可します。セットアップ検出波長 660 にこの nm は、ラール濁度の適切な。
- ユーザー名とパスワードを入力してサインインします。
- コンピューターの画面上の対応するアイコンをクリックしてソフトウェア (材料のテーブル) を開きます。
- ソフトウェア ホーム画面にデータを収集を選択します。ホーム画面で[全般] タブでの対応する領域にテスト ID とデータのグループ情報を入力します。
- ハードウェアタブをクリックしてドロップ ダウン メニューから計測器のタイプを選択します。
- 設定、検出波長 660 nm、適した chosing によって混濁ラル ラル混濁法。
- シリアル番号、システム ID とシリアル ポートに関する情報が画面に表示されることを確認します。[Ok]をクリックします。確認するもう一度OKをクリックします。
- サンプルをテストする順序と同じ順序でサンプル ID を入力します。既定のボタンを使用すると、ネガティブ コントロール、標準曲線とテスト サンプルを入力します。
- 各サンプルの重複するチューブを用意し、あらかじめラベル付きのガラス管に 200 μ L (テスト比 4:1) またはネガティブ コントロール (水)、校正規格、品質管理、テストは IEC およびナノ粒子の 100 μ L (テスト比 1:1) を追加します。
- 最初テスト バイアル、渦それは簡潔とテストに挿入楽器カルーセルのスロットに 50 μ L (テスト比 4:1) または LAL 試薬を 100 μ l 添加 (テスト比 1:1) を追加します。1:1 の比率を使用している場合、LAL 試薬の量は 100 μ L です。
- 他のサンプルについて上記の手順を繰り返します。プロセスは、一度に 1 つずつをサンプリングします。
注: は、詳細については、ディスカッションを参照してください。
4. 発色ラル
- 標準試料の作製
- ラル グレード水量 900 μ L と CSE の 100 μ L を使って、1 EU/mL の濃度校正基準の準備を有効にするために必要な多くの中間希釈を準備します。
- 900 μ L ラル グレードの水と 1 の EU/mL 校正基準の 100 μ L を使用して、0.1 EU/mL の濃度で 2 番目の校正標準を準備します。
- 2 つの低いキャリブレーション基準を準備する上記のように連続 10 倍希釈を繰り返します。至る 0.001 EU/mL の 1 4 つの校正基準が用意されていることを確認します。
- 品質管理の準備。
- ラル グレード水 950 μ L で 1 EU/mL CSE 溶液 50 μ L を組み合わせることにより 0.05 EU/mL 品質管理を準備します。
注: は、コントロールの準備の詳細について議論を参照してください。
- ラル グレード水 950 μ L で 1 EU/mL CSE 溶液 50 μ L を組み合わせることにより 0.05 EU/mL 品質管理を準備します。
- コントロールの抑制/強化 (IEC) の準備
- 1 EU/mL CSE ソリューションの 25 μ L を組み合わせてテスト ナノマテリアルの 475 μ 0.05 EU/mL を準備します。
メモ: 追加の詳細についての説明を参照します。
- 1 EU/mL CSE ソリューションの 25 μ L を組み合わせてテスト ナノマテリアルの 475 μ 0.05 EU/mL を準備します。
- 実験手順
- 事前に約 30 分のそれを回すことによってウォーム アップする楽器を許可します。セットアップ検出波長 405 にこの nm は、ラール濁度の適切な。
- コンピューターの画面上の対応するアイコンをクリックしてソフトウェアを開きます。ユーザー名とパスワードを入力してサインインします。
- ソフトウェア ホーム画面にデータを収集を選択します。ホーム画面で[全般] タブでの対応する領域にテスト ID とデータ グループの情報を入力します。
- ハードウェアタブをクリックしてドロップ ダウン メニューから計測器のタイプを選択します。計測器を選択します。
- シリアル番号、システム ID とシリアル ポートに関する情報が画面に表示されることを確認します。[Ok]をクリックします。確認するもう一度OKをクリックします。
- サンプルをテストする順序と同じ順序でサンプル ID を入力します。否定的なコントロールを入力する既定のボタンを使用して標準曲線とテスト サンプル。
- 各サンプルの重複するチューブを用意し、あらかじめラベル付きのガラス管に 200 μ L (テスト比 4:1) またはネガティブ コントロール (水)、校正規格、品質管理、テストは IEC およびナノ粒子の 100 μ L (テスト比 1:1) を追加します。
- 最初テスト バイアル、渦それは簡潔とテストに挿入楽器カルーセルのスロットに 50 μ L (テスト比 4:1) または LAL 試薬を 100 μ l 添加 (テスト比 1:1) を追加します。1:1 の比率を使用している場合、LAL 試薬の量は 100 μ L です。
- 他のサンプルについて上記の手順を繰り返します。プロセスは、一度に 1 つずつをサンプリングします。
5. ゲル血栓ラル
注: このアッセイは、目視と反応管の血栓の検出に基づくサンプルのエンドトキシンの存在を識別します。実験の手順は次のとおりです。ベンチ シートを使用して、結果を記録します。このベンチ シートは必須ではありません、測定結果を記録する他の方法も許容できます。このようなベンチ シートの例は、読者の便宜のための補足資料で提供されます。ラムダ (l) ゲル血栓アッセイの感度、0.03 EU/mL。
- 分析試験サンプルの数に合わせて必要に応じてできるだけ多くの反応管にラベルを付けます。ベンチ シート ステップ 1、ステップ 2 およびステップ 3 の試金で使用される複製の数の詳細についてを参照してください。
- チューブごとに水、コントロールまたはテスト サンプルの分注 100 μ L。
- 最終濃度が 4λ に等しいようなカスタム検索エンジンを準備します。
- 上記 2λ の CSE の最終的な集中を達成するために水やテスト サンプルの 100 μ L の標準の 100 μ L を組み合わせます。ラムダと半分ラムダとラムダの四分の一を達成するために 3 回繰り返します。
- 風呂の水の温度が 37 ° C であることを確認してください。
- 試験管、渦を簡潔にあたりライセートの 100 μ L を追加し、1 時間風呂の水に管だらけでラックを配置します。
- 滑らかな動きとチューブを反転します。
- 「+」(しっかりした血栓) を使用して手動でレコードの結果または「-」(血栓または緩い血栓) ベンチ シート。
- USP ベット 854によると分析を続行; ベンチ シートを使用して、マテリアルのサポートとして
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結果
ラルの試金でこの定式化をテストした後に生成されるデータの例は表 1に示します。希釈 5 で発色のラルとペグ化リポソーム封入ドキソルビシンの干渉。ただし、この干渉は、大きい希薄によって克服されました。この製剤は希釈 50 と濁度と発色ラル、500 および濁度ラルで希釈 5 テストされたとき、スパイク回復は 50 と 200% の間だった。希釈倍率によって調整の結果は両方のアッセイの希薄の間の一貫性。また、結果は 3 アッセイ フォーマット間で一貫してあった。
...| テストのサンプル | 濁度ラル、EU/mg (スパイク回復、%) | 発色ラル、EU/mg (スパイク回復、%) |
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ディスカッション
このプロトコルで提供される情報は15,26の前に記述され、米国食品医薬品局 (US FDA または FDA) や米国薬局方 (USP)4刊規制のいくつかの文書に依存しています。,5,6,27、プロトコル STE1.2 (濁度ラル)、STE1.3 (ゲル血栓ラル) の NCL のウェブサイト20もありと、STE1.4 (発色ラル)。
テスト ナノ材料は、LAL 試薬水または無菌、パイロジェン フリーの PBS のいずれかを用意しています。研究サンプルの pH は、低 (< 6) および高い (> 8) pH ライセートの最適なパフォーマンスを妨げるために重要です。テス...
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開示事項
著者が明らかに何もありません。
謝辞
調査は国立がん研究所から連邦政府の資金によってサポートされた国立衛生研究所、契約 HHSN261200800001E の下で。この文書のコンテンツ ビューまたは政策の保健社会福祉省、必ずしも反映しないも言及されている商号、商品、または組織は、米国政府によって裏書を意味します。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 濁度LALアッセイ | |||
| 水酸化ナトリウム | シグマ | S2770 | 必要に応じて、サンプルのpHを6〜8 塩 |
| 酸 | シグマ | H9892 | 必要に応じて、サンプルのpHを6〜8 |
| LAL試薬 | アソシエイトのケープコッド | T0051 | 試薬は濁度で使用できますアッセイのみ |
| E0005 | エンドトキシン標準 | アソシエイト | この試薬は、濁度およびゲル凝固アッセイと使用することができます |
| LALグレードの水 | WP0501 | のアソシエイト | この試薬は、任意のLALフォーマットの |
| Glucashield | アソシエイトと使用することができます ケープコッド | GB051-25 | ベータグルカン |
| からの偽陽性応答を防ぐために使用使い捨てエンドトキシンフリーガラス希釈チューブ 12 x 75 mm | ケープコッド | TB240 | これらのチューブは、3つのアッセイすべてで使用できます |
| 使い捨てエンドトキシンフリーガラス反応チューブ 8 x 75 mm | ケープコッド | TK100 | これらのチューブは、濁度および発色アッセイで使用することができる |
| パイロジェンフリーチップ 容量0.25および1.0mL | RAININ | PPT25、 PPT10 | とピペットは、エンドトキシンを吸着し、LALアッセイを妨げる浸出物を放出する可能性があります。これらのレイニンチップは、LALアッセイでの最適な性能が検証され、確認されたため |
| 、使用されます パイロジェンフリーの微量遠心チューブ、2.0mL | ッペンドルフ | 22600044 | 他の同等の供給品が使用可能 |
| パイロジェンフィーコンビチップ、5mL | ッペンドルフ | 30089669 | 他の同等の供給品が使用可能 |
| ピペッター | エッペンドルフ | 4982000020 | を繰り返す 他の同等の供給品が使用可能 |
| Microcetrifuge | 任意のブランド | が使用可能 | |
| 冷蔵庫、2-8 C | 任意のブランド | 任意のブランドが使用可能 | |
| Vortex | 任意のブランド | 使用可能 | |
| Freezer、-20 C | 任意のブランド | 任意のブランドが使用可能 | |
| Pyros KinetixまたはPyros Kinetix Flex reader | コッドPKF96 | の仲間他の機器も使用できます。ただし、このアッセイで使用されるLAL試薬とエンドトキシン標準は最適化が必要な場合があります。他の器械使用時は、指示のための器械およびLALのキットの製造業者を参照して下さい | |
| Chromogenic LALのAssay | |||
| Pyrochrome LALの試薬 | の仲間 ケープコッド | CG1500-5 | この試薬は、 |
| ケープコッド | EC010 | 制御エンドトキシン標準 | この規格は、濁度およびゲル凝固LALに使用されるものとは異なります。それは発色学の研修 |
| ナトリウム | シグマ | S2770 | 必要ならば、それは6-8 |
| 酸 | シグマ | H9892 | 使用されている 必要なとき、それは6-8 LALの等級水間にあるようにサンプルpHを調節するのに使用されている |
| ケープコッド | WP0501 | この試薬はあらゆるLALフォーマット | |
| Glucashield緩衝液と使用することができる | ケープコッド | GB051-25 | ベータグルカンからの偽陽性反応を防ぐために使用 |
| 使い捨てエンドトキシンフリーガラス希釈チューブ 12 x 75 mm | ケープコッド | TB240 | これらのチューブは、3つのアッセイすべてで使用することができます |
| 使い捨てエンドトキシンフリーガラス反応チューブ 8 x 75 mm | ケープコッド | TK100 | これらのチューブは、濁度および発色アッセイ |
| と使用することができますパイロジェンフリーチップ(容量0.25mlおよび1.0ml | レイニン | PPT25、PPT10 | とピペットは、エンドトキシンを吸着し、LALアッセイを妨げる浸出物を放出する可能性があります。これらのレイニンチップは、LALアッセイでの最適な性能が検証され、確認されたため |
| 、使用されます パイロジェンフリーの微量遠心チューブ、2.0mL | ッペンドルフ | 22600044 | 他の同等の供給品が使用可能 |
| パイロジェンフィーコンビチップ、5mL | ッペンドルフ | 30089669 | 他の同等の供給品が使用可能 |
| ピペッター | エッペンドルフ | 4982000020 | を繰り返す 他の同等の供給品が使用可能 |
| Microcetrifuge | 任意のブランド | が使用可能 | |
| 冷蔵庫、2-8 C | 任意のブランド | 任意のブランドが使用可能 | |
| Vortex | 任意のブランド | 使用可能 | |
| Freezer、-20 C | 任意のブランド | 任意のブランドが使用可能 | |
| Pyros KinetixまたはPyros Kinetix Flex reader | コッドPKF96 | の仲間他の機器も使用できます。ただし、このアッセイで使用されるLAL試薬とエンドトキシン標準は最適化が必要な場合があります。他の器械使用場合は、指示のための器械およびLALのキットの製造業者を参照して下さい | |
| Gel-Clot LALのAssay | |||
| LALの試薬 | の仲間 ケープコッド | G5003 | この試薬はゲル血栓の試金に特有である |
| コッド | E0005 | 制御エンドトキシン標準的な | この試薬は濁度およびゲル血餅の試金と使用することができます |
| 水酸化ナトリウム | シグマ | S2770 | 必要に応じて、サンプルのpHを6-8 |
| 塩酸 | シグマ | H9892 | 必要に応じて、サンプルのpHを6-8 |
| LALグレードの水 | ケープコッド | WP0501 | この試薬は、 |
| ケープコッド | GB051-25 | Glucashieldバッファー | ベータグルカンからの偽陽性反応を防ぐために使用 |
| 使い捨てエンドトキシンフリーガラス希釈チューブ 12 x 75 mm | ケープコッド | TB240 | これらのチューブは、3つのアッセイすべてと一緒に使用することができます |
| 使い捨てエンドトキシンフリーガラス反応チューブ 10 x 75 mm | ケープコッド | TS050 | これらのチューブは、 |
| 容量0.25および1mL | ニン | PPT25、PPT10 | チップとピペットは、エンドトキシンを吸着し、LALアッセイを妨げる浸出物を放出する可能性があります。これらのレイニンチップは、LALアッセイでの最適な性能が検証され、確認されたため |
| 、使用されます パイロジェンフリーの微量遠心チューブ、2.0mL | ッペンドルフ | 22600044 | 他の同等の供給品が使用可能 |
| パイロジェンフィーコンビチップ、5mL | ッペンドルフ | 30089669 | 他の同等の供給品が使用可能 |
| ピペッター | エッペンドルフ | 4982000020 | を繰り返す 他の同等の供給品が使用可能 |
| Microcetrifuge | 任意のブランド | が使用可能 | |
| 冷蔵庫、2-8 C | 任意のブランド | 任意のブランドが使用可能 任意のブランドが使用可能 | |
| 任意の | ブランドが使用可能 | ||
| フリーザー、-20 C | 任意のブランド | が使用可能 任意のブランドが使用可能 | |
| ウォーターバス、37 C | 任意のブランド | どのブランドでも使用できますが、水の流れが血栓形成に影響を与え、偽陰性の結果につながるため、水循環をオフにするか、非循環型ウォーターバスを使用することが重要です |
参考文献
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