ここで説明は、(1) たてそのまま脳血管内皮「チューブ」と内皮細胞のカルシウムと膜内皮由来過分極電位 (2) 同時計測を隔離するためのプロトコルです。さらに、これらのメソッド内皮細胞カルシウムと個々 またはインタラクティブな実験変数として電気シグナリングの薬理学的チューニングを可能にします。
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この記事について
サマリー
要約
脳動脈および彼らのそれぞれの微小循環血流調節を介して脳に酸素と栄養を提供します。神経細胞の代謝需要を満たすために必要に応じて血管内皮細胞の血管と血管径に変更するコマンドのルーメンを行します。過分極膜電位 (Vm) と窒素酸化物の主な内皮依存性シグナル経路は、通常血管拡張反応を仲介し、それにより血流を増加する並列で動作します。血管の長さ数ミリの血管拡張反応の調整には不可欠な内皮由来過分極 (EDH) のコンポーネントされている歴史的に測定することは困難。EDH のこれらのコンポーネントは細胞内 Ca2 + [Ca2 +]私が増加との小規模でその後活性化を伴うし、中間コンダクタンス Ca2 +-K+を活性化 (SKCa/IKCa) チャンネル。
ここでは、提案するマウス脳動脈から新鮮な内皮細胞の分離の簡略図内皮 [Ca2 +]私と Vmそれぞれ Fura 2 測光と細胞内の鋭い電極を使用しての同時測定塩水濃度および生理学的な条件 (pH 7.4 では、37 ° C) の下で薬剤の継続的なスパーフュー ジョン法。ウィリス動脈輪から後大脳動脈が削除されます, 通信と脳底動脈の無料。洗浄後大脳動脈セグメントとその後製粉の酵素の消化力は、外膜、血管周囲神経や平滑筋細胞の除去を促進します。結果後大脳動脈内皮「チューブ」は、顕微鏡下では、保護し、カメラ、光電子増倍管、連続スパーフュー ジョン法を受けながら、1 〜 2 electrometers を用いています。総称して、このメソッドことができますと同時に測定内皮 [Ca2 +]私の変化に沿ってそのまま距離をミリ波までのギャップ結合を介した EDH の広がりに加え、離れた細胞場所で Vm血管内皮細胞。このメソッドは、高スループット分析の正常および病的脳血流調節機構の基礎となる脳の血管内皮機能をもたらすと予想されます。
概要
脳全体の血流は、中大脳動脈と細動脈血管ネットワーク1で血管拡張反応の調整によって規制されています。血管内皮細胞は、脳の抵抗動脈ニューロン1,2,3の代謝需要を満たすために必要に応じて血管径に変更するコマンドをライニングします。(通称 EDH)、内皮由来過分極反応の中に特に、細胞内 Ca2 + ([Ca2 +]私) 内皮細胞座標血管内皮細胞間の電気信号と、動脈弛緩4のギャップ結合を介した周囲の平滑筋細胞。EDH の生理開始は順次 Gqの刺激を伴います-受容体 (Gpcr) [Ca2 +]私との内皮小中間 Ca2 +活性化の増加を結合-アクティブに K+(SKCa/IKCa) hyperpolarize 脳血管内皮膜電位 (Vm)5,6,7
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プロトコル
次の実験を実施する前に、すべての動物の世話使用し、プロトコル施設動物ケアおよび使用委員会 (IACUC) によって承認され、国家研究会議"ガイドと一致を実行をようにケアとの使用のため実験動物" (8th版、2011) のガイドラインが到着。Loma リンダ大学 IACUC は男性と女性の c57bl/6 マウスのこの原稿を使うすべてのプロトコルを承認した (年齢: 30 に 3 mo)。
1. 装置および材料
注:プロトコルに必要な材料の詳細は、表の材料、試薬とマニュアルやそれぞれのベンダーに関連付けられているウェブサイトで見つけることが。
-
流れの部屋
- 陽極酸化アルミニウム プラットフォームにガラス coverslip 底の superfusion チャンバーを固定します。コンパクトなアルミ ステージに納めたプラットフォームを固定します。
- アルミ ステージ固定のピペットなどを保持するために、プラットフォームの各端にマイクロマニピュレーターを設定します。
注:実用的なオプションとし....
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結果
上記で説明したプロトコルの概略のデモは、添付図に表示されます。若い成人男性 C57BL/6 n マウス (5 ヶ月) から分離された脳は、図 1 aに表示されます。後大脳動脈は、ウィリス輪、結合組織せずに削除し、(図 1 bの D) のセグメントにカットから慎重に分離されています。部分的に消化動脈セグメントからそのまま内皮チューブを生産し、固定ピペットを使用してガラス製カバー スリップ上の保護します。穏やかなメカニカル ストレッチは、血管蛇行せず体内長さを近似する 2 つの固定ピペットを使用して適用されます。原稿 (図 2 a-d) でこれはさらに解明されています。後大脳動脈由来内皮の管が 〜 90-100 μ m の長さの幅と ≥ 300 μ m。チューブを搭載 Fura 2 午前 PSS とウォッシュ アウトが続きます。[C.......
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ディスカッション
最近の動向6,15,16,17、照らして今 [Ca2 +] の同時測定のための準備のマウス脳血管内皮細胞を分離する方法を示すiおよび Vm 37 ° C の ~ 2 h を一貫して EDH の基になります。技術的に困難な細胞間の結合も (参照6図 1 を参照) を測定できます。この方法では、離散と同時にイベントを通知実施を測定できます。マウスの血管内皮細胞を分離しながら直面する一般的な課題のアカウント参照11,12を参照してください。マウス脳動脈内皮 [Ca2 +]私と Vm、トラブルシュー.......
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開示事項
著者は利益相反を宣言しません。
謝辞
現在のプロトコルに必要な用品を確立している間優秀なテクニカル サポートありがとうチャールズ ・ ヒューイット。我々 はそれぞれ追加の倒立顕微鏡と電位計、私たちを提供するため夫妻ショーン ・ m ・ ウィルソンと LLU 周産期生物学センターからのクリストファー ・ g. ウィルソンをありがとうございます。この研究は、国立衛生研究グラント R00 AG047198 (EJB) そして Loma リンダ大学医学部新学部設立基金によってサポートされています。内容は著者の責任と国立衛生研究所の公式見解を必ずしも表さない。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| グルコース | Sigma-Aldrich (米国ミズーリ州セントルイス) | G7021 | |
| NaCl | Sigma | S7653 | |
| MgCl2 | Sigma | M2670 | |
| CaCl2 | Sigma | 223506 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| KCl | Sigma | P9541 | |
| NaOH | Sigma | S8045 | |
| ATP | Sigma | A2383 | |
| HCl | ThermoFisher Scientific (米国ペンシルベニア州ピッツバーグ) | A466250 | |
| コラゲナーゼ (H 型ブレンド) | Σ | C8051 | |
| ジチオエリスリトール | Σ | D8255 | |
| パパイン | シグマ | P4762 | |
| エラスターゼ | シグマ | E7885 | |
| BSA | Sigma | A7906 | |
| ヨウ化プロピジウム | Sigma | P4170 | |
| DMSO | Sigma | D8418 | |
| Fura-2 AM 色素 | Invitrogen, Carlsbad, CA, USA | F14185 | |
| Recirculating Chiller (Isotemp 500LCU) | ThermoFisher Scientific | 13874647 | |
| Plexiglas superfusionチャンバー | ワーナーインスツルメンツ、カムデン、コネチカット | RC-27 | |
| ガラスカバースリップボトム(2.4 × 5.0;>cm) | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 12-548-5M | |
| 陽極酸化アルミニウムプラットフォーム(直径:7.8 cm) | ワーナーインスツルメンツ | PM6 または PH6 | |
| コンパクトアルミステージ | シスキユー、グランツパス、オレゴン州、米国 | 8090P | |
| マイクロマニピュレーター | シスキユー | MX10 | |
| 実体顕微鏡 | Zeiss, NY, USA | Stemi 2000 & 2000-C | |
| 光ファイバー光源 | ショット、マインツ、ドイツ&KL200, Zeiss | Fostec 8375 | |
| Nikon 倒立顕微鏡 | Nikon Instruments Inc, Melville, NY, USA | Ts2 | |
| 位相差対物レンズ | ニコンインスツルメンツ株式会社 | (Ph1 DL;10倍 &20倍) | |
| 蛍光対物レンズ | Nikon Instruments Inc | 20X (S-Fluor), and 40X (Plan Fluor) | |
| Nikon Instruments | Inc | Eclipse, TS100 | |
| Microsyringe pump controller (Micro4 ) | World Precision Instruments(WPI)、フロリダ州サラソタ、米国 | SYS-MICRO4 | |
| 防振テーブル | テクニカルマニュファクチャリング、ピーボディ、マサチューセッツ州 | 、米国 Micro-g | |
| Amplifiers | Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA | Axoclamp 2B & (英語)Axoclamp 900A | |
| ヘッドステージ | モレキュラーデバイス | HS-2A &HS-9A | |
| ファンクションジェネレータ | EZ Digital、ソウル、韓国 | FG-8002 | |
| データ取得システム | Molecular Devices、カリフォルニア州サニーベール、米国 | Digidata 1550A | |
| 可聴ベースラインモニター | Ampol US LLC、サラソタ、フロリダ州、米国 | BM-A-TM | |
| デジタル・ストレージ・オシロスコープ | Tektronix, Beaverton, Oregon, USA& | nbsp;TDS 2024B | |
| 蛍光システム インターフェース、ARC ランプ + 電源、ハイパースイッチ、PMT | 分子デバイス、サニーベール、カリフォルニア州、米国 | IonOptix システム | |
| 温度コントローラー | ワーナーインスツルメンツ | TC-344BまたはC | |
| インラインヒーター | ワーナーインスツルメンツ | SH-27B | |
| バルブコントローラー | ワーナー・インスツルメンツ | VC-6 | |
| インライン流量制御弁 | ワーナー・インスツルメンツ | FR-50 | |
| 電子プーラー | Sutter Instruments、カリフォルニア州ノヴァト、米国 | P-97またはP-1000 | |
| Microforge | Narishige, East Meadow, NY, USA | MF-900 | |
| ホウケイ酸ガラス管 (トリチュレーション) | World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA | 1B100-4 | |
| ホウケイ酸ガラス管 (ピン留め) | ワーナーインスツルメンツ | G150T-6 | |
| ホウケイ酸ガラス管 (鋭利な電極) | ワーナーインスツルメンツ | GC100F-10 | |
| シリンジフィルター (0.22 µm) | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 722-2520 | |
| ガラスシャーレ+チャコールシルガード | リビングシステム計装、セントオールバンズシティ、バーモント州 | 米国 DD-90-S-BLK | |
| バンナススタイルはさみ(3 mm&9.5 mm) | World Precision Instruments | 555640S, 14364 | |
| Scissors 3 & 7 mm blades | Fine Science Tools (or FST), Foster City, CA, USA | Moria MC52 & 15000-00 | |
| Sharpened fine-tiped 鉗子 | FST | デュモン#5&デュモン #55 |
参考文献
- Longden, T. A., Hill-Eubanks, D. C., Nelson, M. T. Ion channel networks in the control of cerebral blood flow. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 36 (3), 492-512 (2016).
- Chen, B. R., Kozberg, M. G., Bouchard, M. B., Shaik, M. A., Hillman, E. M.
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再版と許可
