密度勾配遠心法を用いた差動品質の精液採取

Summary

本稿では、密度勾配遠心法と精子の生理学的研究への応用のパフォーマンスについて説明を目指します。

Abstract

有性生殖、雄性配偶子または精子細胞は、受精させる雌性配偶子の融合します。ただし、受精を保障する雌性配偶子と対話する能力を肥やすことで精子の数が多いが必要。など、個々 の精子の受精能力は、正常な再生のため重要です。密度勾配遠心法は、生殖補助医療に使用される質の高い精子だけを収集する再現性の高い、高速、効率的、効果的な非常に適応可能である方法として数十年間利用されています。我々 はここに記載されているプロトコルはその品質によってオンドリの精子の 3 つの異なる集団を隔離する不連続パーコール密度勾配遠心法 (PDGC) 技術の活用に焦点を当てます。低、中、高品質の精子を収集することができました。生存率、モビリティ、および透過性を評価することにより精子の決定の不妊の可能性を伴う再現性のあるプロトコルについて述べる。PDGC 技術を使用してその品質によって精子のコレクションは正確に有用であるし、徹底的に差分不妊治療の可能性と精子を特徴付けます。

Introduction

脊椎動物、雄性配偶子を受ける強烈な選択圧;したがって男性の生殖のフィットネス、成功受精を達成するために極めて重要です。すべての脊椎動物種の男性は、受精のニーズを満たすために十分な品質と大量に精子細胞を生成できる必要があります。精子細胞、精子頭部と、鞭毛を持つは、体内で最も偏光セルです。また、精子の質の非常に異質です (ライブと死んで、形態学的正常と異常、および不動、低モバイル、高モバイル)、男性の生殖効率の変動幅を明らかには。なるほどの正常に卵子を受精に必要な交配の数は減りますが、質の高い精子の割合。しかし、不妊治療を達成するために形態学的に正常精子細胞はオスミウム酸¹を浸透するも受精のサイトに到達する彼らの鞭毛によって生成された推進力に頼る (ZP 哺乳類の場合) または内部囲レイヤー² (IPVL の鳥類と爬虫類の場合) 次の自然交配または人工授精 (AI) 卵子の。精子を決定する品質は生殖補助医療技術³ (アート) で使用するために必要な AI で使用される繁殖の男性の選択プログラム⁴。その一方で、アートの成功はもっぱら精子の質の正確な評価に依存します。多くの検査は精子の機能の特性を決定する開発されています。最も重要なパラメーターは、精子形態、生存率、モビリティ、精子 (鳥精子受精⁵は必要....

Protocol

ここで説明したすべてのメソッドは、機関動物ケアおよび使用委員会 (IACUC) ジョージアの大学によって承認されています。

1. 伝統的なの遠心分離を用いた洗浄

1. リン酸緩衝液 (PBS) を準備します。8.0 g nacl、KCl、1.44 g Na₂HPO₄と KH₂PO₄ 800 mL の蒸留水 (dH₂O) 0.24 g の 0.2 g を追加します。0.1 N HCl を使用して 7.4 に pH を調整し、dH₂o. を使用して 1 L にソリューションをもたらす
2. 運動性バッファーを準備します。追加, 塩化ナトリウム 6.5 g、4.5 g グルコース、0.444 g CaCl₂と N - トリス-[ヒドロキシメチル] 11.5 g のメチル-2-アミノ-ethanesulfonic 酸 (TES) dH₂O. 800 mL に 1 M NaOH を使用して 7.4 に pH を調整して dH₂o. を使用して 1 L にソリューションをもたらす
3. ポリプロピレン微量遠心チューブに精液の 0.5 mL のピペットします。1.0 mL の PBS を加え、軽く混ぜます。
4. 室温 (RT) で 10 ....

Results

PDGC 技術は、すべてのパラメーターの間で品質の程度によって精子の 3 つの層をはっきりと分離で起因しました。精子は高密度ソリューションより高いと低密度ソリューションと上記の低密度ソリューション低品質層間媒体品質層高品質レイヤーに分離します。これらの品質に違いは生存率 (図 4)、移動 (図 5) および浸透 (図 6) の明確な違いが証明されています。PDG の高品質の膜から分離した精子は、それらの伝統的洗浄標本を基準にしてすべての 3 つのパラメーターの増加を展示しました。指摘している PDGC による分離時に中・低品質表示中等度および劇的なそれぞれ、これらのレイヤーは、すべてテスト パラメーターの間で減少します。

Discussion

不妊治療は、動物生産の収益性を決定するだけでなく、存在のための種の自然淘汰の手段としても機能します。精子細胞の究極の機能は、卵子を受精することです。女性の卵管は卵子^23,24の受精を保障するためにそれらの適者生存精子のみを選択します。生体外研究も質的な精子と受精成功^4,11,23,24間密接な相関関係を明らかにしました。減らされた豊饒は精子^4,11,25の質の悪さに関連付けられます。そのため、精子の質の改善のための精液の処理が必要と。アート、PDGC は人間および農.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Accudenz	Accurate Chemical and Scientific Corporation、米国ニューヨーク州ウェスト	ベリーAN7050
Percoll	Sigma-Aldrich, Corp., St. Louis, MO, USA	P7828
Schiff'試薬	Sigma-Aldrich, Corp., St. Louis, MO, USA	3952016
TES	Sigma-Aldrich, Corp., St. Louis, MO, USA	T1375
Eosin Y	Sigma-Aldrich, Corp., St. Louis, MO, USA	E4009
Nigrosin	Sigma-Aldrich, Corp., St. Louis, MO, USA	198285
ST 40R Centrifuge	Thermo Scientific, Waltham, MA, USA	75004524
DU 530 Life Sciences UV/Vis Spectrophotometer	Beckman Coulter, Brea, CA, USA		カタログが見つかりません
Olympus IX 71 Inverted Fluorescence and Phase Contrast Microscope	Olympus America Inc., PA, USA		カタログが見つかりません