Method Article

ミトコンドリア、リソソーム T 細胞のマルチカラー フロー フローサイトメトリーを用いた定量化

DOI:

10.3791/58844

⸱

January 9th, 2019

 ,  ,  , 
1Institute of Microbiology and Immunology, National Yang-Ming University

In This Article

Summary

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この記事は、ミトコンドリアや細胞内のリソソームを定量化する強力な方法を示しています。リソソームやミトコンドリア固有染料表面マーカー蛍光に活用された抗体との組み合わせにより、初代培養細胞を用いた組織サンプルから収穫のような混合細胞集団におけるこれらのオルガネラの定量化フローサイトメトリー マルチ カラー。

Abstract

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T 細胞は、分化と増殖中に機能的なニーズに合わせて、さまざまな代謝プログラムを利用します。ミトコンドリアは細胞エネルギーの供給を行う重要な細胞成分です。ただし、過剰なミトコンドリアも細胞死を引き起こすことができる活性酸素種 (ROS) を生成します。したがって、ミトコンドリアの数は、細胞のニーズに合わせて常に調整する必要があります。このダイナミック制御は、一部剰余金/破損した細胞内小器官と高分子削除リソソームの機能によって実現されます。したがって、細胞のミトコンドリア、リソソーム内容は、細胞の代謝の調整を評価する重要な指標です。細胞内小器官のためのプローブの開発と、よ特徴付けられたリソソームやミトコンドリア固有染料細胞リソソーム、ミトコンドリアのラベルに様々 なフォーマットで利用可能になっています。フローサイトメトリー マルチ カラー プロファイル細胞の表現型に共通のツール、他の試金と統合する機能です。ここでは、流れの cytometer でリソソームと異なる T 細胞集団におけるミトコンドリアの量を測定する染色表面マーカーと細胞小器官特定の染料を結合する方法の詳細なプロトコルを提案する.

Introduction

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活性化し、T 細胞の増殖は、正常な免疫応答をマウントするための重要なステップです。最近の進歩は、細胞の代謝がしっかりと開発と T 細胞の機能の両方に関連付けられているが示唆されました。たとえば、ナイーブ T 細胞は、酸化的リン酸化 (OXPHOS) 二次リンパ器官の中で循環の中にエネルギー需要を満たすために大きく依存しています。起動時に、ナイーブ T 細胞は、抜本的な代謝リプログラミング、ATP の生産を増加し、細胞の分化と増殖の間に途方もない代謝要求を満たす好気性解糖作用の誘導を含むを受けます。代謝の必要なフォロースルーに失敗した細胞アポトーシス1,2で死ぬ。彼らは細胞小器官、細胞のエネルギー供給への ATP の生産に対する主な責任と代謝スイッチの中に細胞のミトコンドリアの内容が変動するので、ミトコンドリアが重要な役割を果たす代謝リプログラミング中T 中セルの開発と活性化3を実行します。ただし、不要なまたは破損したミトコンドリアの蓄積は、脂質、蛋白質および DNA を損傷し、最終的に細胞死4につながることができます余分な活性酸素を作り出すことができます。

代謝変化から生じる過剰なまたは破損しているミトコンドリアは、オートファジーの

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Protocol

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ここで説明されているマウス組織収穫手順は、機関動物ケアおよび使用委員会 (IACUC) 国立陽明大学によって承認されています。

1. リンパ器官からのリンパ球懸濁液の準備

  1. 死を確保するための頚部転位続いて透明アクリル商工会議所での CO2吸入などの承認された方法でマウスを安楽死させます。
    注意: 毎分商工会議所、および 5 つの psi (1 平方インチあたりポンド) 以上の 20% を変位の CO2の流量。意識を失うには、マウスの 2 〜 3 分かかります。動物が呼吸 (5-7 分全体) を停止した後、CO2の流れを 1 分の少なくとも維持します。
  2. クリーン ボード (例えばポリスチレン プラスチック ボード) の上にマウスを置くし、手足をテープで固定します。70% エタノールでリンスします。
  3. 脾臓を収穫するには、カット、11 cm 解剖はさみ (脾臓は胃の下と左腎上) と腹腔を開きます。鉗子で脾臓を削除し、(必要な場合は、はさみを使用) 結合組織からきれい。
  4. 胸腺を収穫、横隔膜と肋骨、解剖はさみで両側からをカットします。全体の胸腔内を明らかにするための胸骨を持ち上げる鉗子を使用します。胸腺を慎重にハサミでは、周囲の組織から分離し、PBS で湿ったペーパー タオルで任意の残留の結合組織を削除します。

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Results

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脾臓と胸腺における主要な T 細胞サブセットの同定

簡単に言えば、脾臓と胸腺から単一細胞懸濁液された赤い血球の分離、2.4G2 上清を添加して、続いて細胞小器官特定の色素と蛍光色素標識された抗体 (表 1) 染色表面マーカー。発達進行胸腺細胞の共受容体に抗体を用いた記述できます CD4 と CD8。最も未熟な胸腺細胞は CD4 や CD8 を表明しないと二重否定 (DN) と呼びます。その後、CD4 と CD8 の両方を調整して二重正 (DP) になります。最後に、彼らはダウン調整する CD4 や CD8 と器官を残して準備ができている成熟した単一正 (SP) 細胞になります。T 細胞の発生、細胞の共受容体を発現していないときの初期 CD44 と CD25 式に基づいて CD4 および CD8、さらに分類します。最も早い前駆細胞は CD44+ CD25-.......

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Discussion

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このプロトコルは細胞器官特定の染料とミトコンドリア、リソソームの異なる T 細胞集団の量を定量化する染色表面マーカーを組み合わせたものです。このメソッドは、イムノブロット分析電子顕微鏡などの従来の方法で細胞数と均質性要件の制限を克服するために開発されました。稀な細胞集団の分析と同時に同時に複数のセルの種類を調べることで特に便利です。

手続きの期間と孵化の温度は、このプロトコルでは最も重要な要因です。分類の適切な細胞小器官オルガネラ固有染料の正確な滴定が必要です。細胞には、生存率を高め、抗体をキャッピングと内面化を避けるために氷の上厳密に保管する必要があります。さらに、これらの特定の細胞小器官の染料の蛍光は光の暴露や温度の変化に対して脆弱です。したがって、サンプル汚損プロシージャが完了したらの即時解析は非常に重要です。我々 は一貫して 2 時間以内に全体の実験を完了することがされています。

このプロトコルは細胞内のコンポーネントを評価するフローサイト メーターによる多色蛍光を検出する能力に依存しているので取得設定 (例え.......

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Disclosures

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著者は利益相反行為を宣言しません。

Acknowledgements

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このプロトコルの開発は、セの許に台湾省、科学および技術 (ほとんど) NSC103-2320-B-010-002-MY2 と MOST104-2628-B-010-002-MY4 からの補助金によって支えられました。C. w. 魏優秀論文賞の微生物学と免疫学、国立陽明大学の受信者であります。

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
10 cm Graefe 鉗子 (ストレートおよび鋸歯状)Dimeda
11 cm アイリスはさみ (シャープ/シャープヘッド付きストレート)Dimeda
15 mL 遠心分離管サーモフィッシャーサイエンティフィック339650
5 mL シリンジテルモ 
6 cmペトリ皿&α;-プラス
70&マイクロ;m ナイロンセルストレーナーSPL Lifesciences93070
塩化アンモニウム (NH4Cl)   ΣA9434
抗マウスCD25Biolegend102007:PC61
抗マウスCD4Biolegend100453:GK1.5
抗マウスCD44Biolegend103029クローン:IM7
抗マウスCD62LBiolegend104407:MEL-14
抗マウスCD8Biolegend100713クローン:53-6.7
抗マウスTCR&β;バイオレジェンド109233クローン:H57-579
BD LSRFortessaBD Biosciences
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)Bio basic6381-92-6
FALCON 5ml ポリスチレン丸底チューブ (FACSチューブ)BD Biosciences352052
Fetal Bovine Serum (FBS)HycloneATD161145
Flowjo, LLCBDBiosciences
Hydroxyethyl piperazineethanesulfonic acid (HEPES)SigmaH4034
L-glutamine (200 mM)GibcoA2916801
LysoTracker Green DND26Thermo Fisher ScientificL7526
MEM 非必須アミノ酸 (100X)Gibco11140050
MitoTracker Green FMThermo FisherScientificM7514
ペニシリン-ストレプトマイシン (10,000 U/mL)Gibco15140122
重炭酸カリウム (KHCO3)J.T.baker298-14-6
ヨウ化プロピジウム溶液Sigma 25535-16-4
RPMI 1640 中 (粉末)Gibco31800089
重炭酸ナトリウム (NaHCO3)SigmaS5761
ピルビン酸ナトリウム (100 mM)Gibco11360070
クローンクローンクローン

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Buck, M. D., O'Sullivan, D., Pearce, E. L. T cell metabolism drives immunity. Journal of Experimental Medicine. 212 (9), 1345-1360 (2015).
  2. Marelli-Berg, F. M., Fu, H., Mauro, C. Molecular mechanisms of metabolic reprogramming in proliferating cells: i....

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