ミトコンドリア、リソソーム T 細胞のマルチカラー フロー フローサイトメトリーを用いた定量化

Summary

この記事は、ミトコンドリアや細胞内のリソソームを定量化する強力な方法を示しています。リソソームやミトコンドリア固有染料表面マーカー蛍光に活用された抗体との組み合わせにより、初代培養細胞を用いた組織サンプルから収穫のような混合細胞集団におけるこれらのオルガネラの定量化フローサイトメトリー マルチ カラー。

Abstract

T 細胞は、分化と増殖中に機能的なニーズに合わせて、さまざまな代謝プログラムを利用します。ミトコンドリアは細胞エネルギーの供給を行う重要な細胞成分です。ただし、過剰なミトコンドリアも細胞死を引き起こすことができる活性酸素種 (ROS) を生成します。したがって、ミトコンドリアの数は、細胞のニーズに合わせて常に調整する必要があります。このダイナミック制御は、一部剰余金/破損した細胞内小器官と高分子削除リソソームの機能によって実現されます。したがって、細胞のミトコンドリア、リソソーム内容は、細胞の代謝の調整を評価する重要な指標です。細胞内小器官のためのプローブの開発と、よ特徴付けられたリソソームやミトコンドリア固有染料細胞リソソーム、ミトコンドリアのラベルに様々 なフォーマットで利用可能になっています。フローサイトメトリー マルチ カラー プロファイル細胞の表現型に共通のツール、他の試金と統合する機能です。ここでは、流れの cytometer でリソソームと異なる T 細胞集団におけるミトコンドリアの量を測定する染色表面マーカーと細胞小器官特定の染料を結合する方法の詳細なプロトコルを提案する.

Introduction

活性化し、T 細胞の増殖は、正常な免疫応答をマウントするための重要なステップです。最近の進歩は、細胞の代謝がしっかりと開発と T 細胞の機能の両方に関連付けられているが示唆されました。たとえば、ナイーブ T 細胞は、酸化的リン酸化 (OXPHOS) 二次リンパ器官の中で循環の中にエネルギー需要を満たすために大きく依存しています。起動時に、ナイーブ T 細胞は、抜本的な代謝リプログラミング、ATP の生産を増加し、細胞の分化と増殖の間に途方もない代謝要求を満たす好気性解糖作用の誘導を含むを受けます。代謝の必要なフォロースルーに失敗した細胞アポトーシス^1,2で死ぬ。彼らは細胞小器官、細胞のエネルギー供給への ATP の生産に対する主な責任と代謝スイッチの中に細胞のミトコンドリアの内容が変動するので、ミトコンドリアが重要な役割を果たす代謝リプログラミング中T 中セルの開発と活性化³を実行します。ただし、不要なまたは破損したミトコンドリアの蓄積は、脂質、蛋白質および DNA を損傷し、最終的に細胞死⁴につながることができます余分な活性酸素を作り出すことができます。

代謝変化から生じる過剰なまたは破損しているミトコンドリアは、オートファジーの⁵、mitophagy として知られている特殊な形式で削除されます。ミトコンドリアはオートファゴソームで包装し、劣化のためリソソームと融合し。これらはミトコンドリアの間の通信を閉じてリソソームが大きな関心^6,7を生成します。例えば、酸化ストレスがミトコンドリア由来の小胞 (MDVs) ホスファターゼとテンシン相同物 (PTEN) の劣化のリソソームを対象とを形成するミトコンドリアを刺激-推定のキナーゼ 1 (PINK1) を誘発、パーキン (E3 ユビキチンリ ガーゼ)依存する方法⁸.また、その mitophagy はベージュがかった白色脂肪細胞転移^9,10のために不可欠に分られました。もっと重要なは、リソソームは単なる低下のコンパートメントだけでなく、細胞内シグナル伝達の調節因子ではありません。酵素不足による過剰な基板の蓄積はライソゾーム膜の透過性を混乱させることによってリソソーム機能不全の結果し、¹¹の Ca^{2 +}の恒常性に影響を与えます。ライソゾーム酸性リパーゼ (ラル)¹²またはリソゾーム代謝物トランスポーター ノックアウト マウス モデル¹³ T 細胞の機能的な欠陥は、T 細胞の恒常性を維持するためにさらにリソソームの重要性を示した。ミトコンドリア、リソソームは、細胞の代謝調節の不可分の部分です。したがって、細胞のミトコンドリア量の測定は、T 細胞の代謝と機能の状態を評価する重要な指標をされています。

イムノブロット、電子顕微鏡、蛍光抗体 (IF) 染色および pcr 法によるミトコンドリア DNA コピー数^14,15,のアッセイ一般的細胞ミトコンドリア、リソソーム内容を定量化するために使用が含まれます¹⁶. イムノブロットできますさまざまなサンプルや電子顕微鏡は¹⁷これらの細胞内小器官の形態学的特徴を可視化できるかどうかにタンパク質レベルを定量的に比較して、これらの試金は特定の技術的な欠点ご。たとえば、それは十分な数の高倍率と分解能と細胞像を取得または低スループット方法と見なされますこれらのアッセイを行うサンプルの多数の間で蛋白質の表現のレベルを比較する時間です。さらに、これらのアッセイは、混合集団から成る組織サンプルでないのに細胞などの同種細胞集団にのみ適用できます。

また、最小セルの要件が 10 から番号を特殊な集団にこれらのアッセイを適用することは困難だ⁶ 10⁸はお会いすること。最後に、セルが通常分離か、さらに情報を抽出する他の方法と互換性がないそれらを作るプロセス中に固定します。従来の方法と比較して、蛍光を用いたフローサイトメトリーが比較的高いスループット - すべてサンプル内のセルから成る混合細胞集団の情報を分析および同時に収集できます。さらに、同じセルに 10 以上のパラメーターを検出、さらに試金のための所望の表現型を基にセルを並べ替えできます。反応性蛍光プローブは、リソソーム、細胞内のミトコンドリアをラベルに使用されているし、流れ cytometry^18,19によって検出することができます。細胞小器官のこれらのプローブは、細胞透過性、細胞小器官や細胞内の特定の場所に集中することができます物理化学的特性を持っています。便利なマルチカラー解析に応用ができ、様々 な蛍光の形式でこれらのプローブがあります。

表面マーカー ラベル リソソームにリソソームやミトコンドリア固有染料で染色を結合する方法について詳しく説明このプロトコルまたはミトコンドリアが細胞を住んでいます。これは、主な組織や臓器は、しばしば異種細胞集団から成るから生成されるサンプルのため便利です。研究者は、表面マーカー発現によって興味のセル人口を識別し、これらの細胞の特定の細胞小器官染料をライソゾームやミトコンドリアの内容を具体的に測定できます。ここでは、主要な脾 T リンパ球サブポピュレーションのライソゾームまたはミトコンドリア質量が評価されるフローサイトメトリーによる解析の詳細な手順を示します。

Protocol

ここで説明されているマウス組織収穫手順は、機関動物ケアおよび使用委員会 (IACUC) 国立陽明大学によって承認されています。

1. リンパ器官からのリンパ球懸濁液の準備

1. 死を確保するための頚部転位続いて透明アクリル商工会議所での CO₂吸入などの承認された方法でマウスを安楽死させます。
   注意: 毎分商工会議所、および 5 つの psi (1 平方インチあたりポンド) 以上の 20% を変位の CO₂の流量。意識を失うには、マウスの 2 〜 3 分かかります。動物が呼吸 (5-7 分全体) を停止した後、CO₂の流れを 1 分の少なくとも維持します。
2. クリーン ボード (例えばポリスチレン プラスチック ボード) の上にマウスを置くし、手足をテープで固定します。70% エタノールでリンスします。
3. 脾臓を収穫するには、カット、11 cm 解剖はさみ (脾臓は胃の下と左腎上) と腹腔を開きます。鉗子で脾臓を削除し、(必要な場合は、はさみを使用) 結合組織からきれい。
4. 胸腺を収穫、横隔膜と肋骨、解剖はさみで両側からをカットします。全体の胸腔内を明らかにするための胸骨を持ち上げる鉗子を使用します。胸腺を慎重にハサミでは、周囲の組織から分離し、PBS で湿ったペーパー タオルで任意の残留の結合組織を削除します。
5. 機械的に 5 mL 冷たい FACS バッファー (PBS 2% ウシ胎児血清 (FBS) と 1 mM EDTA を添加) を含む 6 cm 皿にシリンジのプランジャーと組織を切り離して考えます。単一細胞懸濁液を 15 mL 遠心管; に転送します。追加 2 mL FACS バッファーと 6 センチメートルの皿を洗うし、同様、細胞の懸濁液と洗浄を組み合わせます。
6. 細胞懸濁液 (4 ° C で 5 分間 x g の 300) を遠心し、上清を捨てます。2 mL のアンモニウム塩化カリウム (ACK) 溶解バッファー (155 mM NH₄Cl、10 mM KHCO₃と 0.1 mM ナ₂EDTA) 1 分間室温 (RT) 赤の血液細胞を溶解するためにペレットを再中断します。細胞懸濁液を 10 mL FACS バッファーを追加して ACK バッファーを中和します。
7. 細胞懸濁液 (4 ° C で 5 分間 x g の 300) を遠心し、上清を捨てます。完全 RPMI 培地 5 ml を再停止 (44 mM NaHCO₃、10 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic 酸 (HEPES)、100 U/mL ペニシリン、ストレプトマイシン 100 mg/mL、2 mM L グルタミン、1 mM ピルビン酸ナトリウム、添加 RPMI 1640 媒体1 %mem 非必須アミノ酸と 10 %fbs)。
8. フィルター セル細胞塊を削除するセル ストレーナー (細孔サイズ 70 μ m) から懸濁液。検定や自動化された細胞カウンターのセルをカウントします。

2 ミトコンドリア、リソソームの定量化

メモ: 実行これらの染料の最適な染色条件は 37 ° C で培養するため、まず染色オルガネラ特異色素表面マーカー染色することができます大幅に削減キャッピングの抗体とその温度で内面化のため。

1. 丸底 FACS 管、遠心分離機のセル (4 ° C で 5 分間 x g の 300)、上澄みを廃棄する 1 x 10 の⁶セルを追加します。
2. 最終作業濃度プローブ溶液を希釈 (100 nM MitoTracker グリーン、LysoTracker グリーン; 今後ミトコンドリア固有またはリソソーム染料、それぞれ) 37 ° C に予め温めておいた無血清培地の。これはリソソームやミトコンドリア固有染料のため作業ソリューションです。
   注: テスト (ミトコンドリア固有の染料のための 20-200 nM) とここで使用される特定のライソゾーム色素 50 75 nM の製造元によって提案された作業濃度の範囲を含む複数の濃度染色効率最高を得るために。肯定的な制御としてターゲット (例えばリソソーム) を染色の良い表現に知られている細胞集団を選択 (例:人間 CD14⁺単球)。ネガティブとポジティブの染色として良い細胞生存率の良い分離に基づく作業濃度を選択します。
3. セル 100 μ L ライソゾームまたはミトコンドリア固有に実用的なソリューションを染める、37 ° C で 5% CO₂インキュベーターで孵化を再懸濁します 15 分または 30 分のそれぞれ。
4. 反応を停止する冷たい FACS バッファーの 1 つの mL を追加します。300 x ト、4 ° C で 5 分間遠心分離によって細胞をペレットし、上澄みを廃棄します。細胞は表面マーカー染色する準備が整いました。

3. 表面マーカー染色

1. FACS バッファーの遠心分離機 (4 ° C で 5 分間 x g の 300) 1 ml 10 分セルを洗浄するため氷の上清 2.4G2 ハイブリドーマがあらかじめ滴定されたの 100 μ L でブロック Fc 受容体。上清を捨てます。
2. 20 分光を回避のための氷の FACS バッファーに 50 μ L 中古滴定された蛍光標識抗体の組み合わせでセルを孵化させなさい。
   注: 準備抗体、蛍光抗体の存在するすべての単一の色染色細胞とセルの組み合わせ処理のみフローの各蛍光検出器、補償調整の電圧を設定する特定のオルガネラ色素cytometer。同様に、染色細胞小器官特定の染料で染色することがなくが、すべての抗体と細胞を用いたバック グラウンド コントロールとしてマイナス 1 (FMO) 蛍光を準備します。
3. 遠心分離 (4 ° C で 5 分間 x g の 300) によって FACS バッファーとペレットの 1 mL を加えることによって細胞を洗います。上清を捨てます。
4. FACS バッファー 1 μ G/ml propidium ヨウ化 (PI) を含む 300 μ L で細胞を再懸濁し、すぐに流れの cytometer でサンプルを分析します。

4 流れの Cytometer でサンプル コレクション

1. コンピューター、フローサイト、FACS 集録ソフトウェアとマシンのプラットフォームに応じて他の付属デバイスを入れます。動線を確保するため約 1 分の PBS は満ちている PBS と鞘のバッファーを実行します。流れがスムーズに実行されることを確認します。
2. 新しい実験を開き、製造元の指示に従って cytometer パラメーター (蛍光検出器) を選択します。70 μ m の細胞のストレーナーと渦塊とダブレットの形成を避けるために各サンプルの獲得の前に細胞をフィルター処理します。
3. セルの大きさと粒度をそれぞれ表す前方散乱 (FSC) と側方散乱 (SSC) のドット プロットを作る。興味のセルがプロットに表示されますを確認する FSC と SSC の電圧を最適化します。FSC A対FSC W (または FSC H) のドット プロットを行い、単一セルのゲートを描画します。
4. 各蛍光パラメーターのドット プロットを作る。無染色の細胞を使用して、バック グラウンド信号を判断して単一カラー染色コントロールを使用して、正と負の細胞集団が明確に区別できると獲得のダイナミック レンジ内に蛍光パラメーターごとの電圧を調整します。
5. すべての電圧を設定すると、自動補正可能な場合を使用またはスペクトル スピル オーバーを修正する無染色および単一の色染色コントロールで補正を手動で調整します。サンプルに補正を適用します。
6. 各パラメーターのドット プロットを行い、あなたの実験セットによるとゲートを策定します。たとえば、FSC A対FSC H (または FSC W)、ダブレットを除外する後に FSC A対SSC-A リンパ球のゲート;SSC A対PI (生きているセル)、CD4とCD8 (図 1)。
7. 集団間の十分なイベント (細胞数) 意味のある比較を収集します。通常、興味の人口の少なくとも 1,000 のイベントは²⁰を取得する必要があります。
8. すべてのサンプルを取得した後は、フロー流動フローサイトメトリー解析ソフトで分析するデータをエクスポートします。実験を cytometer 設定と、将来的に同様の実験に適用するパラメーターを維持するためにテンプレートとして保存します。

5. データの解析

注: 両方の商業および無料のソフトウェア フロー フローサイトメトリーによるデータを分析する多くのツールがあります。流れの cytometers の集録ソフトウェアもデータ解析のために使用できます。ここでは、例として FlowJo を使用しました。

1. ソフトウェアを起動、FCS ファイルをワークスペースにドラッグします。グラフィック ウィンドウを開くサンプルをクリックします。表示するパラメーターを選択して、X 軸と Y 軸をクリックして X と Y 軸。ツールバーを使用して、特異的発現マーカーまたはセル人口の定義された表現型によるとゲートを描きます。
2. 図 1に示すように、各パラメーターの門を追加します。ワークスペースのすべてのサンプルにゲートをドラッグして同じになるゲートします。
3. プロットをグラフィカルなレポートを作成するレイアウト ・ エディターにドラッグします。
4. グラフィック ウィンドウで [統計] ボタン (Σ) をクリックし、「意味」とオルガネラ特異色素を検出するために使用チャネルなどの適切なパラメーターを選択する興味のそれぞれの人口の平均蛍光強度 (MFI) を表示します。「追加」をクリックします。
5. テーブル エディターのアイコンをクリックし、MFI を統計レポートを作成するテーブル エディターにドラッグします。MFI (細胞小器官特定の染料) - MFI (FMO) としてデルタ MFI (ΔMFI) を計算する Excel、テキストまたは CSV ファイルとして保存します。
   注: 別の cytometer で集録したサンプルの MFI を計算しない設定 (電圧、蛍光チャネルまたは補償)。異なる設定を持つ実験から派生した値の比較は無意味と偏りのあります。
6. 図表を作るため、ワークスペースとレイアウト エディターからのプロットからすべての値をエクスポートします。

Results

脾臓と胸腺における主要な T 細胞サブセットの同定

簡単に言えば、脾臓と胸腺から単一細胞懸濁液された赤い血球の分離、2.4G2 上清を添加して、続いて細胞小器官特定の色素と蛍光色素標識された抗体 (表 1) 染色表面マーカー。発達進行胸腺細胞の共受容体に抗体を用いた記述できます CD4 と CD8。最も未熟な胸腺細胞は CD4 や CD8 を表明しないと二重否定 (DN) と呼びます。その後、CD4 と CD8 の両方を調整して二重正 (DP) になります。最後に、彼らはダウン調整する CD4 や CD8 と器官を残して準備ができている成熟した単一正 (SP) 細胞になります。T 細胞の発生、細胞の共受容体を発現していないときの初期 CD44 と CD25 式に基づいて CD4 および CD8、さらに分類します。最も早い前駆細胞は CD44⁺ CD25^-...

Discussion

このプロトコルは細胞器官特定の染料とミトコンドリア、リソソームの異なる T 細胞集団の量を定量化する染色表面マーカーを組み合わせたものです。このメソッドは、イムノブロット分析電子顕微鏡などの従来の方法で細胞数と均質性要件の制限を克服するために開発されました。稀な細胞集団の分析と同時に同時に複数のセルの種類を調べることで特に便利です。

手続きの期間と孵化の温度は、このプロトコルでは最も重要な要因です。分類の適切な細胞小器官オルガネラ固有染料の正確な滴定が必要です。細胞には、生存率を高め、抗体をキャッピングと内面化を避けるために氷の上厳密に保管する必要があります。さらに、これらの特定の細胞小器官の染料の蛍光は光の暴露や温度の変化に対して脆弱です。したがって、サンプル汚損プロシージャが完了したらの即時解析は非常に重要です。我々 は一貫して 2 時間以内に全体の実験を完了することがされています。

このプロトコルは細胞内のコンポーネントを評価するフローサイト メーターによる多色蛍光を検出する能力に依存しているので取得設定 (例え...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 cm Graefe 鉗子 (ストレートおよび鋸歯状)	Dimeda
11 cm アイリスはさみ (シャープ/シャープヘッド付きストレート)	Dimeda
15 mL 遠心分離管	サーモフィッシャーサイエンティフィック	339650
5 mL シリンジ	テルモ
6 cmペトリ皿	&α;-プラス
70&マイクロ;m ナイロンセルストレーナー	SPL Lifesciences	93070
塩化アンモニウム (NH4Cl)	Σ	A9434
抗マウスCD25	Biolegend	102007	:PC61
抗マウスCD4	Biolegend	100453	:GK1.5
抗マウスCD44	Biolegend	103029	クローン:IM7
抗マウスCD62L	Biolegend	104407	:MEL-14
抗マウスCD8	Biolegend	100713	クローン:53-6.7
抗マウスTCR&β;	バイオレジェンド	109233	クローン:H57-579
BD LSRFortessa	BD Biosciences
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Bio basic	6381-92-6
FALCON 5ml ポリスチレン丸底チューブ (FACSチューブ)	BD Biosciences	352052
Fetal Bovine Serum (FBS)	Hyclone	ATD161145
Flowjo, LLC	BDBiosciences
Hydroxyethyl piperazineethanesulfonic acid (HEPES)	Sigma	H4034
L-glutamine (200 mM)	Gibco	A2916801
LysoTracker Green DND26	Thermo Fisher Scientific	L7526
MEM 非必須アミノ酸 (100X)	Gibco	11140050
MitoTracker Green FM	Thermo FisherScientific	M7514
ペニシリン-ストレプトマイシン (10,000 U/mL)	Gibco	15140122
重炭酸カリウム (KHCO3)	J.T.baker	298-14-6
ヨウ化プロピジウム溶液		Sigma 25535-16-4
RPMI 1640 中 (粉末)	Gibco	31800089
重炭酸ナトリウム (NaHCO3)	Sigma	S5761
ピルビン酸ナトリウム (100 mM)	Gibco	11360070