このプロトコルを目指す活動電位神経文化伝達を研究するためのマイクロ流体デバイスと体外電極アレイを結合する方法を示します。データ分析、すなわち検出と、活動電位伝搬の特性は新しい高度なを使用して実行されるまだユーザーフレンドリーおよび自由に利用できる計算ツール。
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この記事について
サマリー
要約
微小電極アレイ (Mea)生体外で神経機能研究に活躍しています。これらのデバイスは、長時間同時非侵襲的な記録/電気生理学的活性化を許可します。コミュニケーションを理解し、信号を神経回路網の伝搬しようとしたとき、すべての電極の周りのすべてのソースからの信号を検出のプロパティは不利ななります。神経ネットワークのいくつかのニューロンは、同時にアクティブにできるし、差別し、信号伝搬特性を追跡しにくく、重複する活動電位を生成することができます。この制限を考慮して分離し、高分解能を持つ軸索信号を増幅することができる電気生理学的コミュニケーションの評価に焦点を当てた体外セットアップを設けています。マイクロ流体デバイスと意味のインタ フェースで我々 は軸索と電極の配置の制御された神経の文化を区分することができます。このセットアップでは、数週間のコース上高い信号対雑音比とスパイクの伝搬の録音ができます。特殊なデータ解析アルゴリズムを組み合わせると、いくつかの通信の詳細な数量を提供しています前向性スパイク発火率、伝導障害伝播速度などの関連プロパティおよびコーディングのメカニズム。
このプロトコルは、基板統合測定上区分神経文化セットアップを作成する方法、このセットアップで神経細胞を培養する方法と正常に記録、分析およびそのような実験の結果を解釈する方法を示します。ここでは、神経回路および軸索の信号伝搬特性の理解を確立されたセットアップが簡略化する方法を示す.これらのプラットフォームは、ニューロン ネットワークの設計および制御可能な地形での in vitroモデルの新しい道を開きます。彼らは、同種の神経文化または共同文化構成、たとえば、感覚ニューロンと他の細胞型との間の通信は監視は、評価のコンテキストで使用できます。このセットアップは、神経発達、神経回路、コーディング、神経変性と再生に関するアプローチの情報を勉強する非常に興味深い状態を提供します。
概要
神経回路における電気通信を理解することは、通常の機能を明らかにし、機能不全に対処するための治療戦略を考案する基本的なステップです。ニューロンは、統合、計算し、細い軸索に沿って伝播活動電位 (APs) を中継します。従来の電気生理学的手法 (例えば、パッチク ランプ) は神経細胞の活動を研究するための強力な技術が、細胞体や樹状突起などのより大きい細胞構造に制限が多い。イメージング技術を提供高空間分解能、軸索信号を研究する代わりに、彼らが技術的に困難な実行し、長期の測定値1を許可しません。この文脈において微小電極アレイ (Mea) とマイクロ流体の組み合わせ2 培養神経回路網内の neuron´s 活動と信号伝送の基本特性を明らかに強力な貢献が出来る,3。
MEA 技術は、神経細胞培養の細胞外記録に依存します。この電気生理学的手法の主な利点は、長期的な同時刺激と非侵襲的方法3複数のサイトでの記録をサポートする能力です。Mea は、ガラス基板に埋め込まれた生体適合性、高い導電性と耐腐食性の電極から成っています。従来の携帯文化バイオ-コーティング、大幅細胞接着を促進することによって基板とセルの3
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プロトコル
( Decreto レイ113/2013 で立法はポルトガル語に転置) 欧州連合 (EU) 指令 2010年、63、EU によると動物を含むすべてのプロシージャを行った。実験的プロトコル (0421/000/000/2017) は、特定のポルトガル語に公式機関動物福祉と実験 (Direção ジェラール山脈・ デ ・ Alimentação e Veterinária - DGAV) の両方のホスト機関の倫理委員会で承認されました。
1. 文化メディアとその他のソリューションの準備
注: はたて当日使用のコーティング溶液を準備します。未使用のコーティング溶液及び培地は、下記のとおり 4 ° C または-20 ° C で保存されるかもしれない。
- 0.05% (v/v) Poly(ethylene imine) (PEI) 実用的なソリューションの 10 mL を準備します。
- 精製 PEI を溶解することにより 0.25% (w/v) ペイ原液 20 mL を準備 (材料表参照) 滅菌水で。
- 8 mL の滅菌蒸留水に 0.25% (w/v) ペイ原液 2 mL を希釈します。よく混合し、使用します。未使用の溶液は 4 ° C で保存できます。
- 5 μ g/mL ラミニン溶....
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結果
ここで説明されているプロトコルを使用して、µEF でシード E-18 ラット大脳皮質ニューロンが開発し、1 ヶ月以上のこれらの培養条件で健康を維持することができます。文化では、3 〜 5 日早く皮質ニューロンは µEF (図 1) の軸索のコンパートメントに向かって溝を通して成長します。15 日間培養後 µEF 上で培養した大脳皮質ニューロン活動の安定したレベルを示すことが予想が、溝に沿って活動電位の伝搬が期待されます。古い文化 (> 14 DIV) 従来 MEA 録音18,19のようにアクティビティのバーストによって支配される傾向にあります。
録音およびデータ分析
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ディスカッション
ここで提示されたプロトコルは、記録されたデータを分析する方法と、µEF、マイクロ流体デバイスと標準的な市販デザイン、MEA の構成を組み立てる方法を示しています。
実験を設計するとき研究者考慮しなければならない体外モデルがマイクログルーブ手配を拘束 MEA 固定グリッドによって制限されること。特定のマイクロまたは MEA の設計の使用の実験的ニーズが異なりますが、一般的には、同じ手順を実行する必要があります異なる µEF 構成に適用されます。
µEF アセンブリは、ユーザーが将来的に組み立てられた µEF を再利用しようとするかどうかの前に重要な意思決定の実験します。MEAs20マイクロ流体デバイスの共有結合に両面に酸素プラズマを用いた治療を行うことができます。しかし、このシールは頻繁になります MEA チップ、更なる実験に使用できなくなるパッシベーション膜の損害賠償不可逆的マイクロ流体デバイスをデタッチします。この問題を回避するために研究グループを (.......
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開示事項
著者が明らかに何もありません。
謝辞
この作品は、フェダー - Fundo Europeu デ Desenvolvimento 競う 2020 年まで地域の資金によって融資された - FCT - カルーストを通じて競争力と国際化 (POCI)、ポルトガルの 2020 年とポルトガル語で Operacional プログラム資金パラ Ciência e、技術/Ministério da Ciência、技術 e Ensino 優れたプロジェクト PTDC/CTM-ナン/3146/2014 (POCI-01-0145-フェダー-016623) のフレームワーク。ホセ ・ C ・ マテウスは FCT (PD/BD/135491/2018 年) によって支えられました。サンパウロ aguiar 氏は、プログラム Ciência - プログラム Operacional ・ ・圏環境共生分野 (POPH) - 科学的な雇用促進、ESF と MCTES とプログラム Investigador FCT POPH とマイプ社会 Europeu によって支持されました。マイクロ流体デバイスをジョアン ペドロ コンデとバージニア州の朱の監督の下で INESC - サン ・ マイクロシス テムズ、ナノテクノロジー、ポルトガルで作製しました。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| B-27 サプリメント (50X) | サーモフィッシャーサイエンティフィック | LTI17504-044 | |
| 分岐ポリ(エチレンイミン) (PEI), 25 kDa | Sigma-Aldrich | 408727 | 2.5 kDaカットオフメンブレンを用いた透析により、分岐PEIを4°Cで3日間精製します。5 mM HCl溶液に対するC溶液(毎日更新)。精製したPEIを凍結乾燥します。 |
| セルストレーナー(40 µm) | ファルコン | 352340 | |
| 錐形マイクロチューブ(1.5 ml) | VWR | 211-0015 | |
| 使い捨ておむつ、60x40 cm | Bastos Viegas SA | 455-019 | |
| 鉗子デュモン#5、ストレート | ファインサイエンスツール | 91150-20 | |
| 鉗子デュモン#5/45 | サイエンスツール | 11251-35 | |
| 鉗子デュモン#7、湾曲 | ファインサイエンスツール | 91197-00 | |
| 熱不活化ウシ胎児血清プレミアム | バイオウエスト | S181BH-500ML | |
| ラミニンEngelbreth-Holm-Swarmから | Sigma-Aldrich | L2020-1MG | ミニンストック溶液を1 mg/mLで調製し、それぞれの容量の非添加培地に粉末を溶解します。ラミニン溶液を-20°Cで保存します。小さなアリコート(20 µL)凍結/解凍サイクルの繰り返しを避けるため。 |
| L-グルタミン 200mM | サーモフィッシャーサイエンティフィック | LTID25030-024 | |
| ノイバウアー改良計数室(血球計算盤) | マリエンフェルト | 630010 | |
| 神経基礎培地 (1X) | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 21103-049 | 神経細胞培養に使用される基礎培地 |
| PDMS マイクロ流体デバイス | 該当なし | 該当 | 、450&muの20マイクログルーブで相互接続された2つのセル播種コンパートメントで構成されています。m 長さ & 時間。10 μmの高さと時間。14 μm幅の寸法と86µで区切られています。m (総インタースペース 100 μm)です。 |
| ペニシリン-ストレプトマイシン(P / S)溶液(100X) | Biowest | L0022-100 | |
| PESシリンジフィルターユニット(Ø 30 mm)、0.22 µm | Frilabo | 1730012 | |
| ポリプロピレン コニカル チューブ、15 ml | サーモ フィッシャー サイエンティフィ | 07-200-886 | |
| ポリプロピレン コニカル チューブ、50 ml | サーモ フィッシャー サイエンティフィ | 05-539-13 | |
| ポリスチレン ディスポザベル セロジカル ピペット、10 ml | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 1367811D | |
| ポリスチレンディスポザベル血清ピペット、5 ml | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 1367811D | |
| 標準再生セルロースメンブレン (2 kDa) | スペクトラムラボ | 132107 | |
| 標準的な外科用ハサミ | ファインサイエンスツール | 91401-14 | |
| 基板一体型平面MEAs(256マイクロ電極) | マルチチャンネルシステム | 256MEA100/30iR-ITO | 252窒化チタン(TiN)記録電極と4つの内部参照電極を16×16の正方形グリッドに整理。各記録電極は30μです。直径はmで、間隔は100μ;mです。 |
| シリンジルアーロックチップ、10 ml | テルモヨーロッパ | 5100-X00V0 | |
| リンジルアーロックチップ、50ml | テルモヨーロッパ | 8300006682 | |
| テルガザイム | シグマアルドリッチ | Z273287 | MEAsの洗浄に使用される酵素活性粉末洗剤 |
| 組織培養プレート、35 mm | StemCell Technologies | 27150 | |
| 組織培養プレート、90 mm | フリラボ | 900095 | |
| トリパンブルー溶液(0.4%) | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| トリプシン (1:250) | Thermo Fisher Scientific | 27250018 | |
| Vinyl tape 471 | 3M | B40071909 |
参考文献
- Scanziani, M., Hausser, M. Electrophysiology in the age of light. Nature. 461 (7266), 930-939 (2009).
- Nam, Y., Wheeler, B. C. In vitro microelectrode array technology and neural recordings. Critical Reviews in Biomedical Engineering. 39 (1), 45-61 (2011).
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