シンプルかつ強力な可視化と薬理学的ターゲットの評価法として放射線写真法

Summary

オートラジオグラフィー法は質的または量的薬理学による組織切片にイメージングに関する基礎的バインディングを研究する使用します。

Abstract

体外放射線写真法は、実験動物として人間から組織の興味の蛋白質の解剖学的分布を可視化を目指しています。メソッドは、その生物学的対象放射性リガンドの特定の結合に基づいています。したがって、凍結するティッシュ セクションはリガンド溶液で培養した、ターゲットへのバインドはその後ローカライズ放射性崩壊の検出によってたとえば、感光性フィルムまたは蛍光イメージング プレートを使用しています。結果として得られるデジタル autoradiograms は、定量化と明確な解剖学的構造の放射性リガンドの結合の局在化を可能にする顕著な空間分解能を表示します。また、定量化できます親和性リガンドの薬理学的解析による結合部位 (B_最大) 選択した組織の密度と同様、酸解離定数 (K_d)、阻害定数 (K_私)。したがって、メソッドは、ターゲットの局在と性についての情報を提供します。高親和性 γ-ヒドロキシ酪酸 (GHB) 結合の試金に関する方法論的考察に特別な重点を置いて、哺乳類の脳組織内のサイトを結合のオートラジオ グラフの特性と技術を例示するここでは、パラメーター、リガンドと検出方法の選択。

Introduction

放射線は、放射性崩壊の画像を提供する方法です。テクニックは、日常的に関心体外に基づく放射性標識化合物とそのターゲットの特定の薬理学的相互作用の蛋白質の組織分布を調査する使用されます。これは、ターゲットのリガンドの選択性について直接的な情報を提供します。体外放射線写真法は、決定するだけでなく、解離定数 (K_d) などの結合部位 (B_最大)、密度イメージングに関する基礎的薬理学的バインディング パラメーターの定量のためにまた使用されるかもしれません競合するリガンド^1,2の阻害定数 (K_i) です。オートラジオグラフィーによる伝統的な磨砕液放射性リガンド結合と比較して、空間の解剖学を視覚化することができるという、地域性の表現パターン³の簡潔な詳細を与えることの利点があります。したがって、放射線写真法のメソッドは検証された抗体の有無を中心に、各種の関連する代替です。ミクロトーム クライオスタット切片、および適切なイメージングを準備するために、必要な薬理学的特異性と適切なリガンドの可用性を与えられる標準的なラジオ アイソトープ実験室の放射線写真法を簡単に実装します。それぞれティッシュ セクションの放射能の分布を分析することができるデバイス。特に、リガンドの重要な選択基準は、非タ....

Protocol

デンマーク動物実験の検査官からのガイドラインに準拠したすべての動物取扱を行った。

注: ここで説明したプロトコルをカバー ティッシュの準備 (すなわちマウス脳組織)、新しいラボ内のメソッド、蛍光イメージング プレートへの露出を設定するための十分な詳細で体外オートラジオグラフィーによるアッセイと同様その後デンシトメトリー分析 autoradiograms (図 2) のローカライズおよび明確な解剖学的構造の放射性リガンドの結合の定量化を目的と。病理組織学的比較クレシル バイオレットの汚損のためのプロトコルが含まれます。また、競合するリガンド非特異的結合の決定はプロトコルの中で含まれています。B_最大K_dまたは K は_私を確認する方法の詳細については、前の文書⁴を参照してください。

1. 組織作製セクショニング

1. 頚部転位によってマウスを安楽死させるし、すぐにハサミ、鉗子を使用して脳を解剖します。直接組織の損傷を避けるために次の手順に進みます。
2. スナップ-凍結組織による粉末ドライアイス、ガスの CO₂イソペンタン。クライオスタットに-20 ° C 設定温度、凍結....

Results

記述のプロトコルを使用して、高親和性 GHB 結合部位の解剖学的分布は放射性標識された GHB アナログ [³H] 可視化したマウスの脳は、コロナ、矢状面、水平方向のセクション (図 3 にカットされた HOCPCA).バインドの高レベルは、海馬と皮質で観察された、線条体下部のバインドとバインドがありませんが小脳で検出された高親和性 GHB サイト^{9,10、前回の報告式のパターンに対応します。 11,12}。別の断面平面を使用して、下図のように、解剖学的構造を視覚化が可能し、クレシル バイオレット染色による解剖学的整合性をサポート可能性があります。GHB の高親和性結合部位、組織 (図 3

Discussion

オートラジオグラフィーによるアッセイの品質よく、リガンドの感度によって決定されます。主要な貢献の要因は適切な特定活動 (すなわち放射能の量を持つ配位子を生成する知られている配位子の可用性または特定のラベリング技術の可能性に与えられる選択したラジオ アイソトープ放射性リガンドの単位モル) あたり²³と化学的な劣化の限られた量。イメージングに関する基礎的知られている配位子の数が多いは、トリチウム^{9,10,24,25,26}, いくつかの利点を推論するとラベル付けされます。まず、トリチウム (³H) は、長い半減期 (12.43 年) 各バッチの長期保管を促進が特徴です。第二に、 ³H 配位子がその親化合物生物学的.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
無水エタノール	メルク ミリポア	107017
酢酸	Sigma-Aldrich	A6283
BAS-TR2040 イメージングプレート	GE Healthcare Life Science		28956481 20x40 cm - トリチウムに敏感
クレシルバイオレットアセテート	Sigma-Aldrich	C5042-10G
DPX (顕微鏡用非水性封入剤)	メルクミリポア	100579
O.C.T.コンパウンド、12 x 125 mL	Sakura	4583	Tissue-Tek
パラホルムアルデヒド	Sigma-Aldrich	16005-1KG-R
Superfrost Plus スライド	VWR	631-9483	顕微鏡スライド
Tissue-Tek 手動スライド染色セット	Sakura Finetek デンマーク ApS	4451
ガラス	のトリチウム標準アメリカン・ラジオラベルド・ケミカルズ社	ART 0123
キシレン代替品	Sigma-Aldrich	A5597