筋芽細胞の分化と融合中にトラック核へライブ イメージングを利用しました。

サマリー

骨格筋は、特に核の配置に依存する非常にダイナミックなプロセスです。ここでは、我々 は筋芽細胞の分化と筋層の間の生きているセルイメージ投射によって核の動きを追跡する自動追跡から情報を抽出することにより核動態の定量的な解析を実行する方法をについて説明します。

要約

細胞内の核の配置、開発および再生の複数の細胞プロセスが重要です。核の配置の最も興味深い例は骨格筋の中に発生します。筋繊維 (筋線維) が筋前駆細胞 (筋芽細胞) 由来の筋幹細胞 (サテライト細胞) の増殖と分化を融合して多核巨細胞の細胞です。筋線維内の正しい核配置は、適切な筋肉の再生と機能に必要です。筋芽細胞の分化と筋線維の形成を評価する共通のプロシージャは、蛍光抗体法により、時間の経過とともに核の運動と細胞挙動の研究を妨げる用いて固定セルに依存します。ここでは、生細胞イメージングによる筋芽細胞の分化と筋線維の形成の解析手法について述べる.分化と融合の中に細胞核ダイナミクスと筋芽細胞挙動 (すなわち、軌道) の高スループットの定量的な特徴づけを取得する自動核追跡のためのソフトウェアを提供します。

概要

骨格筋は、本体質量¹の 35-40% を合計、人間の体内で最大の組織です。衛星細胞は筋肉細胞、増殖筋芽細胞 (筋前駆細胞) を生じさせる、(細胞膜、筋線維の基底膜下に並べ)、彼らの位置によって特徴付けられる解剖学的結果となった区別するため、既存の筋線維に統合および/またはフォーム新しい筋線維^2,3,4ヒューズします。彼らの発見と生物学の研究の進展は、筋肉の発達と再生に重要な洞察力につながっています。

分離し、単に筋芽細胞を分化するプロトコルは何年も前に開発されているおよびまだ広く骨格筋分化^5,6,7を調べるために用い。ただし、これらのメソッドのほとんどは、固定細胞の解析に依存し、その結果、筋芽細胞の融合や筋線維の成熟などの非常に動的なプロセスを完全に探検する科学者を許可しない静的なプロシージャを表します。最も顕著な例は、しっかりと規制されており、初期状態で筋線維の中心核と、筋線維の成熟^8,<....

プロトコル

動物を対象とするすべての手順は、サン ラッファエッレ機関動物ケアおよび使用委員会によって承認されました。

1. マウスの後肢筋の解剖

1. ピンセットとはさみ (直線と曲線) をオートクレーブで滅菌します。
2. 準備し、実験を開始する前にすべてのメディア (ブロック中、消化中、媒体、媒体を区別する) (0.22 μ m) にフィルターを適用 (材料の表を参照してください)。
3. リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 5 mL を 35 mm 筋コレクション用シャーレに入れてください。
4. 頚部転位か CO₂を使用して、マウスを犠牲にしエタノールで皮膚を消毒します。後肢と上肢から皮膚を削除するには、筋肉の分離を容易にするはさみとピンセットを使用します。
   注: 筋肉は新生児または大人のマウスから分離することができます。新生児マウス成体マウスに比べて衛星細胞数の増加があります。ただし、単一の大人マウスから分離でき、衛星細胞の総数は下記実験を実行するための十分です。
5. 前脛骨筋、ヒラメ筋、長趾伸筋 (EDL)、腓腹筋、大腿四頭筋、上腕三頭筋を隔離し、PBS を含むシャーレに入れてください。氷の上の皿を残します。腱と滅菌ハサミとピンセットで脂肪を慎重に取り外します。

2. 主な筋芽細胞の....

結果

自動的にライブ イメージングで筋芽細胞分化に非核運動に従う、核が優先的に蛍光に分類します。これらの分子は¹³主筋芽細胞の分化と増殖を妨害するため、DNA 間をインターカ レート分子を使用して実現可能なないが注意することが重要です。例として、増殖と分化をプライマリ筋芽細胞培養ヘキスト (図 1) の有無で分析されています。(図 1 a, B) 増殖と分化 (図 1、中央のパネル)、ヘキスト 33342 培養筋芽細胞で強く損なわれたことは明らかです。逆に、H2B GFP マウスから隔離され、ドキシサイクリンを培養筋芽細胞核の蛍光グリーンがあるし、(図 1、左右パネル、それぞれ) 野生型マウス由来の筋芽細胞への同様に区別します。

ディスカッション

筋繊維 (筋線維)、多核巨細胞の細胞増殖と分化の^{2,3を受ける筋幹細胞 (サテライト細胞) 由来筋前駆細胞 (筋芽細胞) の融合によって形成されます。 4}。媒体を区別し、MyHC、分化のマーカーとの染色の染色蛍光抗体法を実行する異なる時点で細胞を固定で筋芽細胞を培養筋芽細胞分化を評価するには、一般的な手順ので構成されています核 DNA 間をインターカ レート分子 (例えば、ヘキスト)⁵。このメソッドは分化インデックス (MyHC 陽性細胞/総細胞数の数) または融合インデックス (少なくとも 2 つの核/総細胞数と細胞数) など、さまざまなパラメーターを測定することにより筋芽細胞分化の評価に有用.ただし、筋層と筋芽細胞の融合は⁸核の運動に依存する非常にダイナミックなプロセスです。確かに、筋線維内の原子の配置が適切な筋再生と機能

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
鶏胚抽出物	セララブ	CE-650-J
コラゲナーゼ	シグマ	C9263-1G	125単位/mg
コラーゲン	シグマ	C8919
ディスパーゼ	ギブコ	17105-041	1.78 単位/mg
ドキシシクリン	Σ	D1515
DMEM	シグマ	D5671
ウシ胎児血清	生命技術	10270106
ゲンタマイシン	Σ	G1397
馬血清	Invitrogen	16050-098
Hoechst	生命技術	33342
IMDM	Σ	I3390
L-グルタミン	ΣG7513
マトリゲル	コーニング	356231
ペニシリン-ストレプトマイシン		SigmaP0781
赤血球溶解培地	レジェンド	420301
消化培地
コラゲナーゼ	40mg
ディスパーゼ	70mgPBS
	20 mL
ろ過 0.22um
ブロッキング培地
DMEM
ウシ胎児血清	10%
L-グルタミン	1%
ペニシリン-ストレプトマイシン	1%
ゲンタマイシン	1&パーミル;
ろ過された0.22um
増殖培地
IMDM
胎児ウシ血清	20%
L-グルタミン	1%
ペニシリン-ストレプトマイシン	1%
ゲンタマイシン	1&パーミル;
チチェン胚エキス	3%
濾過0.22um
分化培地
IMDM
馬血清	2%
L-グルタミン	1%
ペニシリン - ストレプトマイシン	1%
ゲンタマイシン	1およびパーミル;
チチェン胚エキス	1%
濾過0.22um

子牛の皮膚から バイオ