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方法論記事

高スループット Nitrobenzoxadiazole ラベル コレステロール排出アッセイ

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DOI：

10.3791/58891

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2019年1月7日

 ,  , 
1Group of Genomics and Pharmacogenomics in HIV, Laboratory of Retrovirology and Viral Immunopathogenesis, IDIBAPS, Hospital Clínic de Barcelona

この記事について

サマリー

血清または血漿マクロファージ細胞モデルの in vitro におけるコレステロール排出能力の測定は、動脈硬化症のバイオ マーカーとして有望なツールです。本研究で我々 は、蛍光 NBD コレステロール排出法を標準化して 96 ウェルのプレートを用いた高スループット解析を開発を最適化します。

要約

動脈硬化は、心血管疾患 (CVD) に します。コレステロール HDL (cHDL) 濃度が動脈硬化の進展に因果的役割を果たしているかどうかは不明です。しかし、アテローマ プラーク形成の初期段階に重要な要因は HDL (大食細胞からコレステロールを受け入れるように HDL 粒子の能力) はコレステロール排出容量泡沫細胞の形成を避けるために。これは、血管内皮細胞との逆のコレステロールの輸送 (RCT) 肝臓でコレステロールを排除するために一部のコレステロールの蓄積を回避する上で重要なステップです。血清またはマクロファージ細胞モデルにおける血漿コレステロール排出能力は、アテローム性動脈硬化のマーカーとして使用できる有望なツールです。伝統的に、[3H]-コレステロールは、コレステロール排出試金で使用されています。本研究では THP-1 由来マクロファージのコレステロール摂取量と流出プロセスをトレースするアッセイで蛍光標識コレステロール (NBD コレステロール) を使用してより安全でより高速な戦略を開発する目指しています。最後に、我々 は、最適化 NBD コレステロール排出方法を標準化、96 ウェルのプレートを用いた高スループット解析を開発します。

概要

世界保健機関によると、死の世界の現在の主な原因は虚血性心疾患と脳卒中 (1520 万の死の合計のための会計)1。どちらも、動脈硬化や血管の2,3アテローム斑の破裂によって付けることができます心血管疾患 (CVD)。

動脈硬化は、血管壁炎症性疾患、マクロファージ、T 細胞、肥満細胞、樹状細胞、血管内皮細胞に潜入し、最終的に動脈硬化性プラークを形成、血から蓄積です。動脈硬化性プラークは脂質に頸動脈内膜メディアの厚さ4、5の高解像度の B モード超音波測定によって立証される、コアとコレステロールの結晶を提示します。マクロファージ、脂質受容体粒子へのコレステロール排出 (ABCG1) ATP 結合カセット (ABC) 受容体 ABCA1、ATP 結合カセット亜科 G メンバー 1 の手段とスカベン ジャー受容体 SR 双方向で実行されます。コレステロールの流入と流出マクロファージの不均衡は、アテローム性動脈硬化開始6キー プロセスと見なされます。プラズマに末梢の組織からコレステロール除去の重要なステップ、逆のコレステロールの輸送 (RCT) と呼ばれるプロセスで肝臓コレステロール排出であります。コレステロールは、主にアポリポ蛋白 A1 (ApoA1) 見つけられる大食細胞高密度リポタンパク質 (HDL) 粒子の表面にから転送されます。Hdl は、排泄と再利用の7,8,9の肝臓へのコレステロールを輸送します。

伝統的に、トリチウム (3H) ラジオ ラベル コレステロールは、コレステロール排出10で使用されています。放射性同位元素の発光信号が高感度10;但し、無線標識のコレステロールは長いプロトコル、電離放射線への暴露のリスクと放射性排出物の安全な取り扱いを確保するため特別な放射能設備と機器の必要性など明らかな障害を示します。それどころか、蛍光は蛍光信号検出、さまざまな fluorophores が付いて、およびその安全性11の単純さのための診断技術で正常に組み込まれています。いくつか蛍光標識ステロールは、コレステロールの代謝 (蛍光) と dehydroergosterol, ダンシル コレステロール, 4, 4-フッ素-3 a、4adiaza s indacene を含む (団) を研究に使用されている - コレステロール、および 22-(n-(7-Nitrobenz-2-Oxa-1,3-Diazol-4-yl)Amino)-23,24-Bisnor-5-Cholen-3β-Ol (NBD コレステロール)。特に、NBD コレステロールは人間の細胞12の効率的な吸収を示します。2 つ異なる NBD ラベル-コレステロールは、現在利用可能な: 22-(N-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)amino)-23,24-bisnor-5-cholen-3b-ol (22-NBD) と 25-(N-[(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)-methyl]amino)-27-norcholesterol (25-NBD;図 1)。コレステロール 22 NBD 部が付いた可能性がありますコレステロール排出研究合わせて最高 25 NBD コレステロールは細胞膜のダイナミクス研究13,14で主に使用します。

通常コレステロールの体外排出の試金で使用される細胞は、THP 1 ひと白血病細胞、マウスの未加工 264.7 のセルの15、J774.1 など単球のようなセルです。ホルボール 12-ミリスタート 13-アセタート (PMA) を用いてマクロファージに分化可能これらのセルのすべてが、THP-1 由来マクロファージ (dmTHP-1) ベスト反映、ヒトマクロファージ16を模倣します。

本研究では、最適化し、代わりに [3H] 22 NBD コレステロールを使用して dmTHP - 1、血清のコレステロール排出容量を決定する蛍光高スループット方法を標準化-コレステロール。さらに、我々 は標準的な放射性アナログと最適化された蛍光法を比較します。

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プロトコル

本研究では、倫理委員会の承認 (Comitè Ètic d'Investigació 早速、病院クリニック、バルセロナ; 承認番号 HCB/2014/0756) とすべての科目の通知書面による同意が得られました。

1. NBD コレステロール準備

  1. NBD-コレス トロールを溶かし (MW 494.63; 参照テーブルの材料) で純粋なエタノール (2 mM) の株式を取得します。10 mg バイアル 10.1 mL 量の 2 mM の在庫を取得するエタノールで全体バイアル内容を解散します。
  2. 5 μ M の最終濃度に到達する 10% 胎仔ウシ血清と 5% ペニシリン/ストレプトマイシン (R10 中) を添加した RPMI 1640 年に在庫から NBD コレステロールを希釈 (例えば, 5 μ M 最終濃度で NBD コレステロールの 10 mL を取得) でR10 中 NBD コレステロール株式 (2 mM) の 25 μ L を希釈します。このボリュームは、96 ウェル プレートで十分です。

2. 細胞培養と播種 (日 2)

  1. 37 ° C、5% CO2で R10 中文化 thp-1 細胞。3 日おき 0.3 x 106セル/mL に調整します。
  2. シード 106細胞/ウェル R10 中 (100 μ L/ウェル) × 0.2 でフラットな底で白い 96 ウェル プレート内のセル。
  3. 100 nM ホルボール 12-ミリスタート 13-アセタートで細胞を治療 (PMA; 10 μ M 在庫から) 48-72 h、37 ° C で培養の THP 1 を区別するために 5% CO2セルの dmTHP 1 に。
    注:PMA 株式 (10 μ M) の 5 μ L を使用するは、500 μ L の R10 媒体でそれをお勧めします。これに先立ち、準備 10 μ M PMA 株式ジメチルスルホキシド (DMSO)、分注、-20 ° C で在庫の 10 mL に 1 g の凍結乾燥バイアルを溶解することにより
  4. また (提案) 結合手順 2.2 および 2.3 より均質化のため。10 mL を 15 mL チューブで thp-1 細胞を準備、PMA 株式 (10 μ M) 200 μ L を追加、優しく、ミックス、すぐに 100 μ L/ウェル プレートを播きます。2.3 の手順で説明するように、セルをインキュベートします。

3. アポリポ蛋白 B 枯渇血清 (ABDS) 準備 (2 または 3 日目)

  1. ポリエチレング リコール (PEG) 溶液を準備、グリシン pH 7.4 で 200 mM の濃度 (滅菌 H2O) と 10 %pbs で希釈します。ペグを取得するペグ 8000 の 10 g を 200 mM グリシンの 40 mL を加えて 20% (w/v)。均質化に、積極的にソリューションをミックスします。
  2. 4 の適用の 20% の部分 1.5 mL チューブの血清/血漿検体の血清/血漿の 10 部分ごとペグし、25 分17氷の混合物を残す (例えば、100 μ L の血漿または血清、追加 20% の 40 μ L のペグ ソリューション)。
  3. 4 ° C で 15 分間 13,000 x gでペグ アポリポ蛋白 B 沈殿を遠心分離します。
  4. 沈殿物を破棄します。上清を新しいチューブに転送します。
    注:(新鮮な) 3 日目、ABDS の準備をお勧めします。それができない場合は、2 日目に、ABDS を準備し、一晩で 4 ° C を維持します。

4. NBD コレステロール セル読み込み (2 日目)

  1. DmTHP 1 の培養液を破棄し、リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) × 1 と 2 回細胞を洗浄します。
  2. 5 μ M とロードセル NBD コレステロール (100 μ L/ウェル) R10 培地で 37 ° C、5% CO2で一晩インキュベートし、。

5. コレステロール受容体 (3 日目) の孵化

  1. 媒体を廃棄し、PBS で 2 回細胞を洗浄します。


  1. figure-protocol-1

  2. figure-protocol-2

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結果

コレステロール排出分析の目的は、生体外で与えられた血清、血漿、または HDL 粒子を含む上清のコレステロール排出容量を決定します。メソッドは標準のマクロファージ細胞株の培養にラベル コレステロールを読み込んで、セルと FBS 自由な媒体に希釈した試験サンプルと接触を誘発するから成っています。最後に、メディアと細胞ライセート、NBD から蛍光レベルが測定されます。測定を最適化するには、メディアへの細胞から effluxed コレステロール混合エタノールを含む溶媒の 1 つのボリュームです。NBD コレステロールを細胞の残りはエタノールや測定前に洗剤を含む溶媒に再停止されます。最後に、effluxed/合計ラベル コレステロールの比率が決定されます。テクニックを設定、アポリポ蛋白 B 枯渇血清 (ABDS) 健常者のプールを使用しました。

中規模およびエタノール NBD コレステロールに最適な希釈条件を調べた。エタノールと無色 RPMI 1640 の異なる比率を含むいくつかの溶媒環境で無料 NBD コレステロールの蛍光挙動をテストします。NBD コレステロール希釈水溶液の蛍光強度 (F...

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ディスカッション

蛍光標識されたコレステロールは、分析してプロパティおよび自然なコレステロールの体外代謝を調べる有望な戦略です。その主な利点は、それは、細胞内では、細胞によってとることができる膜分布研究科このプロトコル (図 7) のようにこのようなコレステロール排出アッセイを適用ことができます。いくつかの蛍光標識ステロールは、BODIPY コレステロール、ダンシル コレステロール、dehydroegrosterol、22 と 25 NBD コレステロール12を含む体外コレステロールの追跡を許可します。特に、22 NBD コレステロールは、異なる種類の細胞、コレステロールの標識18の代用品としてコレステロール動態を勉強に適しています。コンセンサス コレステロール排出アッセイ、蛍光信号を評価する方法はありません。歌ら14収穫 FI を個別に測定する媒体およびセル lysates劉ら14...

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開示事項

著者が権利特許出願 (EPO; 18382337.6 1118 2018 年 5 月 17 日) の発明者であることを宣言する「コレステロール排出法」は、この法に基づきます。

謝辞

この作品は、部分的に支えられてきた研究は、セルバンテス ・ デ ・ サラッド カルロス III、マドリード、スペインから FIS (PS12/00866) を付与フォンド Europeo パラ エル開発地域 (フェダー);レッド ・ デ ・危惧アン SIDA (RIS) ISCIII 主任 (RD16/0025/0002)、CERCA プログラム/ジャナラリター ・ デ ・ カタルーニャ。レトロ ウイルス免疫病理学講座研究所 d'Investigacions Biomèdiques 8 月 Pi 私スニェ (IDIBAPS) を著者に感謝します。発明を保護する上で彼女の指導のため彼らの支援と知識と技術移転オフィスから s. Cufí、t. Escribà、C. Rovira と C. フルタドに感謝します。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
96ウェル収集プレートCorning IncCostar 3912白色 96 ウェルプレート、不透明な透明底
96 ウェル培養プレートCorning IncCostar 3610白色 96 ウェルプレート、フラットクリア底
コレステロール排出アッセイキット (細胞ベース)Abcamab196985>commercial ハイスループット細胞ベースアッセイキットコレステロール排出
無色 RPMI 1640Sigma-AldrichR7509RPMI 1640 ペノールなし
- 赤 Gen5 データ分析ソフトウェアBioTekバージョン 2.0
グリシンSigma-AldrichG8790-100Gグリシン、非動物用
ルミノメーターBiotekSYNERGY HTマルチ検出マイクロプレートリーダー
溶解液 1社内50 mM Tris Buffer、150 mM NaCl および H2O
Lysis Solution 2社内純エタノールおよび細胞溶解液 1:1 (v:v)
NBD-コレステロールThermo-FisherN114822-(N-(7-Nitrobenz-2-Oxa-1,3-Diazol-4-yl)Amino)-23,24-Bisnor-5-Cholen-3β-Ol
PBSSigma-AldrichP3813Phosphate-buffered 生理食塩水
PEG 8000Sigma-Aldrich202452-250Gポリエチレングリコール
PMASigma-Aldrich79346ホルボール 12-メリステート B-アセテート。
R10自社製RPMI 1640 に 10% ウシ胎児血清と 5% ペニシリン/ストレプトマイシンを添加。
RPMI 1640Sigma-AldrichR8758RPMI 1640 with 2 mM L-glutamine containing 1.5 g/L sodium bicarbonate and 4.5 g/L glucose
THP-1 cellsSigma-AldrichATCC, #TIB-202monocyte-like line derived from leukemia from a 1 years old baby
Tween 80Sigma-AldrichP1754

参考文献

  1. The top 10 causes of death. , Available from: http://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/the-top-10-causes-of-death (2018).
  2. Hansson, G. K., Hermansson, A. The immune system in atherosclerosis. Nature Immunology. 12 (3), 204-212 (2011).
  3. Libby, P., Ridker, P. M., Hansson, G. K. Progress and challenges in translating the biology of atherosclerosis. Nature. 473 (7347), 317-325 (2011).
  4. Ilhan, F. Atherosclerosis and the role of immune cells. World Journal of Clinical Cases. 3 (4), 345(2015).
  5. Greaves, D. R., Gordon, S. Immunity, atherosclerosis and cardiovascular disease. Trends Immunol. 22, (2001).
  6. Yamamoto, S., Narita, I., Kotani, K. The macrophage and its related cholesterol efflux as a HDL function index in atherosclerosis. Clinica Chimica Acta. 457, 117-122 (2016).
  7. Escolà-Gil, J. C., Rotllan, N., Julve, J., Blanco-Vaca, F. In vivo macrophage-specific RCT and antioxidant and antiinflammatory HDL activity measurements: New tools for predicting HDL atheroprotection. Atherosclerosis. 206 (2), 321-327 (2009).
  8. Santos-Gallego, C. G., Ibanez, B., Badimon, J. J. HDL-cholesterol: Is it really good? Differences between apoA-I and HDL. Biochemical Pharmacology. 76 (4), 443-452 (2008).
  9. Rothblat, G. H., Phillips, M. C. High-density lipoprotein heterogeneity and function in reverse cholesterol transport. Current Opinion in Lipidology. 21 (3), 229-238 (2010).
  10. Hafiane, A., Genest, J. HDL-mediated cellular cholesterol efflux assay method. Annals of Clinical and Laboratory Science. 45 (6), 659-668 (2015).
  11. Szalaia, R., Hadzsiev, K., Melegh, B. Cytochrome P450 Drug Metabolizing Enzymes in Roma Population Samples: Systematic Review of the Literature. Current Medicinal Chemistry. 23, 1-26 (2016).
  12. Mcintosh, A. L., et al. Fluorescent Sterols for the Study of Cholesterol Trafficking in Living Cells. Probes and Tags to Study Biomolecular Function: for Proteins, RNA, and Membranes. , 1-33 (2008).
  13. Ostašov, P., et al. FLIM studies of 22- and 25-NBD-cholesterol in living HEK293 cells: Plasma membrane change induced by cholesterol depletion. Chemistry and Physics of Lipids. 167, 62-69 (2013).
  14. Song, W., et al. Characterization of fluorescent NBD-cholesterol efflux in THP-1-derived macrophages. Molecular Medicine Reports. 12 (4), 5989-5996 (2015).
  15. Liu, N., Wu, C., Sun, L., Zheng, J., Guo, P. Sesamin enhances cholesterol efflux in RAW264.7 macrophages. Molecules. 19 (6), 7516-7527 (2014).
  16. Qin, Z. The use of THP-1 cells as a model for mimicking the function and regulation of monocytes and macrophages in the vasculature. Atherosclerosis. 221 (1), 2-11 (2012).
  17. Low, H., Hoang, A., Sviridov, D. Cholesterol Efflux Assay. Journal of Visualized Experiments. (61), 5-9 (2012).
  18. Gimpl, G., Gehrig-Burger, K. Cholesterol reporter molecules. Bioscience Reports. 27 (6), 335-358 (2007).
  19. Zhang, J., Cai, S., Peterson, B. R., Kris-Etherton, P. M., Heuvel, J. P. Vanden Development of a Cell-Based, High-Throughput Screening Assay for Cholesterol Efflux Using a Fluorescent Mimic of Cholesterol. ASSAY and Drug Development Technologies. 9 (2), 136-146 (2011).
  20. Rader, D. D. J. Molecular regulation of HDL metabolism and function: implications for novel therapies. Journal of Clinical Investigation. 116 (12), 3090-3100 (2006).
  21. Davidson, W. S., et al. The effects of apolipoprotein B depletion on HDL subspecies composition and function. Journal of Lipid Research. 57 (4), 674-686 (2016).
  22. Park, S. H., et al. Sage weed (Salvia plebeia) extract antagonizes foam cell formation and promotes cholesterol efflux in murine macrophages. International Journal of Molecular Medicine. 30 (5), 1105-1112 (2012).
  23. Litvinov, Y., Savushkin, E. V., Garaeva, E. A. D. A. Cholesterol Efflux and Reverse Cholesterol Transport: Experimental Approaches. Current Medicinal Chemistry. 371 (25), 2383-2393 (2016).
  24. Phillips, A., Mucksavage, M. L., Wilensky, R. L., Mohler, E. R. Cholesterol efflux capacity, high-density lipoprotein function, and atherosclerosis. N Engl J Med. 364 (2), 127-135 (2011).
  25. Rohatgi, A., et al. HDL Cholesterol Efflux Capacity and Incident Cardiovascular Events. New England Journal of Medicine. 371 (25), 2383-2393 (2014).

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