血清または血漿マクロファージ細胞モデルの in vitro におけるコレステロール排出能力の測定は、動脈硬化症のバイオ マーカーとして有望なツールです。本研究で我々 は、蛍光 NBD コレステロール排出法を標準化して 96 ウェルのプレートを用いた高スループット解析を開発を最適化します。
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この記事について
サマリー
要約
動脈硬化は、心血管疾患 (CVD) に します。コレステロール HDL (cHDL) 濃度が動脈硬化の進展に因果的役割を果たしているかどうかは不明です。しかし、アテローマ プラーク形成の初期段階に重要な要因は HDL (大食細胞からコレステロールを受け入れるように HDL 粒子の能力) はコレステロール排出容量泡沫細胞の形成を避けるために。これは、血管内皮細胞との逆のコレステロールの輸送 (RCT) 肝臓でコレステロールを排除するために一部のコレステロールの蓄積を回避する上で重要なステップです。血清またはマクロファージ細胞モデルにおける血漿コレステロール排出能力は、アテローム性動脈硬化のマーカーとして使用できる有望なツールです。伝統的に、[3H]-コレステロールは、コレステロール排出試金で使用されています。本研究では THP-1 由来マクロファージのコレステロール摂取量と流出プロセスをトレースするアッセイで蛍光標識コレステロール (NBD コレステロール) を使用してより安全でより高速な戦略を開発する目指しています。最後に、我々 は、最適化 NBD コレステロール排出方法を標準化、96 ウェルのプレートを用いた高スループット解析を開発します。
概要
世界保健機関によると、死の世界の現在の主な原因は虚血性心疾患と脳卒中 (1520 万の死の合計のための会計)1。どちらも、動脈硬化や血管の2,3アテローム斑の破裂によって付けることができます心血管疾患 (CVD)。
動脈硬化は、血管壁炎症性疾患、マクロファージ、T 細胞、肥満細胞、樹状細胞、血管内皮細胞に潜入し、最終的に動脈硬化性プラークを形成、血から蓄積です。動脈硬化性プラークは脂質に頸動脈内膜メディアの厚さ4、5の高解像度の B モード超音波測定によって立証される、コアとコレステロールの結晶を提示します。マクロファージ、脂質受容体粒子へのコレステロール排出 (ABCG1) ATP 結合カセット (ABC) 受容体 ABCA1、ATP 結合カセット亜科 G メンバー 1 の手段とスカベン ジャー受容体 SR 双方向で実行されます。コレステロールの流入と流出マクロファージの不均衡は、アテローム性動脈硬化開始6キー プロセスと見なされます。プラズマに末梢の組織からコレステロール除去の重要なステップ、逆のコレステロールの輸送 (RCT) と呼ばれるプロセ....
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プロトコル
本研究では、倫理委員会の承認 (Comitè Ètic d'Investigació 早速、病院クリニック、バルセロナ; 承認番号 HCB/2014/0756) とすべての科目の通知書面による同意が得られました。
1. NBD コレステロール準備
- NBD-コレス トロールを溶かし (MW 494.63; 参照テーブルの材料) で純粋なエタノール (2 mM) の株式を取得します。10 mg バイアル 10.1 mL 量の 2 mM の在庫を取得するエタノールで全体バイアル内容を解散します。
- 5 μ M の最終濃度に到達する 10% 胎仔ウシ血清と 5% ペニシリン/ストレプトマイシン (R10 中) を添加した RPMI 1640 年に在庫から NBD コレステロールを希釈 (例えば, 5 μ M 最終濃度で NBD コレステロールの 10 mL を取得) でR10 中 NBD コレステロール株式 (2 mM) の 25 μ L を希釈します。このボリュームは、96 ウェル プレートで十分です。
2. 細胞培養と播種 (日 2)
- 37 ° C、5% CO2で R10 中文化 thp-1 細胞。3 日おき 0.3 x 106セル/mL に調整します。
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結果
コレステロール排出分析の目的は、生体外で与えられた血清、血漿、または HDL 粒子を含む上清のコレステロール排出容量を決定します。メソッドは標準のマクロファージ細胞株の培養にラベル コレステロールを読み込んで、セルと FBS 自由な媒体に希釈した試験サンプルと接触を誘発するから成っています。最後に、メディアと細胞ライセート、NBD から蛍光レベルが測定されます。測定を最適化するには、メディアへの細胞から effluxed コレステロール混合エタノールを含む溶媒の 1 つのボリュームです。NBD コレステロールを細胞の残りはエタノールや測定前に洗剤を含む溶媒に再停止されます。最後に、effluxed/合計ラベル コレステロールの比率が決定されます。テクニックを設定、アポリポ蛋白 B 枯渇血清 (ABDS) 健常者のプールを使用しました。
中規模およびエタノール NBD コレステロールに最適な希釈条件を調べた。エタノールと無色 RPMI 1640 の異なる比率を含むいくつかの溶媒環境で無料 NBD コレステロールの蛍光挙動をテストします。NBD コレステロール希釈水溶液の蛍光強度 (F.......
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ディスカッション
蛍光標識されたコレステロールは、分析してプロパティおよび自然なコレステロールの体外代謝を調べる有望な戦略です。その主な利点は、それは、細胞内では、細胞によってとることができる膜分布研究科このプロトコル (図 7) のようにこのようなコレステロール排出アッセイを適用ことができます。いくつかの蛍光標識ステロールは、BODIPY コレステロール、ダンシル コレステロール、dehydroegrosterol、22 と 25 NBD コレステロール12を含む体外コレステロールの追跡を許可します。特に、22 NBD コレステロールは、異なる種類の細胞、コレステロールの標識18の代用品としてコレステロール動態を勉強に適しています。コンセンサス コレステロール排出アッセイ、蛍光信号を評価する方法はありません。歌ら14収穫 FI を個別に測定する媒体およびセル lysates劉ら14.......
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開示事項
著者が権利特許出願 (EPO; 18382337.6 1118 2018 年 5 月 17 日) の発明者であることを宣言する「コレステロール排出法」は、この法に基づきます。
謝辞
この作品は、部分的に支えられてきた研究は、セルバンテス ・ デ ・ サラッド カルロス III、マドリード、スペインから FIS (PS12/00866) を付与フォンド Europeo パラ エル開発地域 (フェダー);レッド ・ デ ・危惧アン SIDA (RIS) ISCIII 主任 (RD16/0025/0002)、CERCA プログラム/ジャナラリター ・ デ ・ カタルーニャ。レトロ ウイルス免疫病理学講座研究所 d'Investigacions Biomèdiques 8 月 Pi 私スニェ (IDIBAPS) を著者に感謝します。発明を保護する上で彼女の指導のため彼らの支援と知識と技術移転オフィスから s. Cufí、t. Escribà、C. Rovira と C. フルタドに感謝します。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 96ウェル収集プレート | Corning Inc | Costar 3912 | 白色 96 ウェルプレート、不透明な透明底 |
| 96 ウェル培養プレート | Corning Inc | Costar 3610 | 白色 96 ウェルプレート、フラットクリア底 |
| コレステロール排出アッセイキット (細胞ベース) | Abcam | ab196985 | >commercial ハイスループット細胞ベースアッセイキットコレステロール排出 |
| 無色 RPMI 1640 | Sigma-Aldrich | R7509 | RPMI 1640 ペノールなし |
| - 赤 Gen5 データ分析ソフトウェア | BioTek | バージョン 2.0 | |
| グリシン | Sigma-Aldrich | G8790-100G | グリシン、非動物用 |
| ルミノメーター | Biotek | SYNERGY HT | マルチ検出マイクロプレートリーダー |
| 溶解液 1 | 社内 | 50 mM Tris Buffer、150 mM NaCl および H2O | |
| Lysis Solution 2 | 社内 | 純エタノールおよび細胞溶解液 1:1 (v:v) | |
| NBD-コレステロール | Thermo-Fisher | N1148 | 22-(N-(7-Nitrobenz-2-Oxa-1,3-Diazol-4-yl)Amino)-23,24-Bisnor-5-Cholen-3β-Ol |
| PBS | Sigma-Aldrich | P3813 | Phosphate-buffered 生理食塩水 |
| PEG 8000 | Sigma-Aldrich | 202452-250G | ポリエチレングリコール |
| PMA | Sigma-Aldrich | 79346 | ホルボール 12-メリステート B-アセテート。 |
| R10 | 自社製 | RPMI 1640 に 10% ウシ胎児血清と 5% ペニシリン/ストレプトマイシンを添加。 | |
| RPMI 1640 | Sigma-Aldrich | R8758 | RPMI 1640 with 2 mM L-glutamine containing 1.5 g/L sodium bicarbonate and 4.5 g/L glucose |
| THP-1 cells | Sigma-Aldrich | ATCC, #TIB-202 | monocyte-like line derived from leukemia from a 1 years old baby |
| Tween 80 | Sigma-Aldrich | P1754 |
参考文献
- The top 10 causes of death. , Available from: http://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/the-top-10-causes-of-death (2018).
- Hansson, G. K., Hermansson, A. The immune system in atherosclerosis. Nature Immunology. 12 (3), 204-212 (2011).
- Libby, P., Ridker, P. M., Hansson, G. K.
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再版と許可
