方法論記事

ルシファーイエロー - ヒト血液脳関門の細胞モデルにおける堅牢な細胞透過性マーカー

DOI：

10.3791/58900

⸱

2019年8月19日

 ,  ,  , 
1Department of Pharmaceutical, Administrative and Social Sciences, Duquesne University, 2Department of Pharmaceutical Sciences, University of Kentucky

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

我々は、ルシファーイエロー(LY)がヒト血液脳関門のインビトロモデルであるhCMEC/D3細胞単層の明らかな細胞透過性を決定する堅牢なマーカーであることを実証するために蛍光アッセイを提示する。このアッセイを用いて、培養hCMEC/D3細胞におけるコンフルエント単層形成の動態を決定した。

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

血液脳関門BBBは、全身循環と脳の間の障壁を形成する内皮細胞からなる非必須イオンと有毒物質の交換を防ぐ。タイトジャンクション(TJ)は、単層の準細胞空間を効果的にシールし、そのままのバリアを生み出します。本研究では、LYベースの蛍光アッセイを用いて、その明らかな透過性係数(Pアプリ)を決定し、次にコンフルエント単層の形成と得られたタイトジャンクションの動態を決定するために使用することができる。hCMEC/D3単層におけるバリアの完全性。我々はさらに、トランスフェクト細胞におけるTJ機能完全性を決定するために、このアッセイの追加の有用性を実証する。LY Pアプリアッセイからの我々のデータは、トランスウェルセットアップで播種されたhCMEC/D3細胞が効果的にLY細胞輸送7日後培養を制限することを示しています。提示されたアッセイの付加的な有用性として、我々はまた、DNAナノ粒子トランスフェクションがhCMEC/D3単層におけるLY細胞細胞輸送を変化しないことを実証する。

概要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

血液脳関門(BBB)は、脳組織への血漿成分の流入を制限する保護障壁であり、脳内皮細胞とペリサイトなどの支持細胞からなる。BBBの主な役割は、神経微小環境1、2の血球を維持するために末梢血と中枢神経系(CNS)の間の空間を密封する障壁として機能する。脳毛細血管内皮細胞は、細胞間タイトジャンクション(TJs)1の形成を介して細胞間経路を効果的にシールする。この保護バリアは、ブドウ糖と選択された栄養素が脳に入ることを可能にする一方で、イオン、有毒物質、薬物の大部分がこのタイトな障壁を通過するのを防ぎます。その保護的役割とは別に、BBBの自然なバリア機能は、CNSを標的とする薬物送達システムの開発において深刻な課題を提起する。

BBBのインビトロ細胞培養モデルは、その生物学を研究し、TJバリア完全性に対する薬物治療の影響を理解するのに役立つツールです。ヒト脳内皮細胞株(hCMEC/D3)をインビトロモデルとして用いたのは、ヒト脳内皮3の受け入れモデルであり、ヒトBBBの多くの機能を要約する。hCMEC/D3は、インビトロ4、5、6、7、8、9でBBBをモデリングするための最も一般的に使用される細胞株の一つです。バリア締めの尺度である経体皮電気抵抗(TEER)の比較的低い値にもかかわらず、この細胞株は脳内皮細胞の形態的および機能的特性のほとんどを保持し、共培養グリア細胞6,7.hCMEC/D3細胞株は、不安定な表現型6、7、9に脱分化を受けることなく、約35経過まで、活性トランスポーターおよび受容体を含む複数のBBBマーカーを発現する 、10、11.インビトロBBBモデルとしてのhCMEC/D3細胞株の最も顕著な特徴は、TJs5、9、11、12を形成する能力です。幹細胞由来BBBモデルは、hCMEC/D3細胞株と比較して多くの研究において高い透過性を示し、いくつかのBBBマーカーを発現するが、それらは最も一般的なBBB細胞モデル13としてまだ進化していない。重要なことに、幹細胞由来BBBモデルは、細胞が安定したBBB現象型14を維持することを可能にする最大通過数に関して特徴付けされたままである。

一般的に、TEERの測定、スクロース、イヌリン、ルシファーイエローなどの小さな親水性トレーサー分子の見かけ透過性係数(Pアプリ)の測定を含む、TJバリアの完全性を決定するために一般的に使用されています。クラウディン-5、ZO-1、オクルージン等のTJの既知の分子マーカーの免疫染色等5.TEERは、多孔質膜基板上で培養された細胞単層全体の電気抵抗を測定する比較的単純で定量的な方法5である。しかし、TEER値は培養培地の組成や測定器の種類などの実験変数の影響を受ける可能性があります。これらの因子の組み合わせは、2〜21日間培養されたhCMEC/D3細胞株において、2~1150 Ω cm2までのTEER値の広範な分布につながる。免疫染色は、抗体を用いて標的タンパク質を標識することによりTJタンパク質の存在を決定する視覚的方法である。しかし、免疫染色は、実験的なアーティファクトをもたらす可能性のある細胞を固定/透過する必要性を含む一連の実験ステップを伴い、蛍光シグナルは時間の経過とともに消えてしまいます。上記の要因は、データ品質に影響を与える主観的なエラーにつながる可能性があります。

本研究の主な焦点は、培養hCMEC/D3細胞におけるコンフルエント単層形成の動態を決定するLYベースの明らかな透過性アッセイを提示することである。共培養システム、マイクロ流体システムなどの他の高度なインビトロBBBシステムは、大幅に改善されたバリア機能15、16、17、hCMEC/D3を有する生理学的に関連性の高い模倣であるトランスウェルセットアップは、TJ形成の動態を推定し、バリア機能に対する異なる薬物製剤の効果を迅速にスクリーニングするためのシンプルで信頼性の高いモデルです。一般に、Pアプリ値は、hCMEC/D3単層における様々な親水性溶媒に対して一貫しています。例えば、インビトロBBBモデルにおける様々な低分子量溶質(スクロース、マンニトール、LYなど)に対する報告されたPアプリ値は、10-4 cm/min 5、18、19の順に示されます。,20.我々の実験セットアップでは、脳内皮細胞は、細胞の付着および単層形成のためのコラーゲンコーティングされた微多孔質膜上に播種され、生体内の障壁を模倣する。頂点側に添加されたLYは、細胞間のタイトジャンクションを横断し、側側に蓄積することが期待される。側側のLYの濃度が高いほど、未熟で完全に機能しない障壁を示し、低濃度は成熟した障壁をもたらす機能的なTJの存在による制限された輸送を反映する。

LYは、明確な励起/発光ピークを有する親水性染料であり、スクロース、マンニトールまたはイヌリンなどの放射ラベルトレーサー分子の必要性を回避します。したがって、LYの蛍光値は、BBB単層全体のその準細胞透過性を直接計算するために使用することができる。また、フルオレセイン21などの小さなストークスシフトに苦しむ生物医学分野で使用される多くの市販の染料と比較して、LYのストークスシフトは、十分なスペクトル分離を有する約108nmであり、したがって、LY蛍光データを細胞細胞透過性を決定するための堅牢な読み出し。我々は、培養時間にわたってタイトジャンクションマーカータンパク質ZO-1の発現の変化を実証するために、直交技術としてウェスタンブロッティングを使用した。ウェスタンブロッティングを介して検出されたZO-1式は、LY Pアプリデータを補完するために使用され、組み合わせることで、これらのデータは、LY Pアプリ値の観察された変化が、徐々に増加する単層の形成を反映していることを示唆している。タイトジャンクションマーカー、ZO-1の表現。

先に指摘したように、この研究の中心的な焦点は、機能的なタイトジャンクションを持つコンフルエント単層の形成を監視する簡単な技術としてLYアッセイを実証することです。しかし、開発されたアッセイのさらなる有用性を実証するために、DNAナノ粒子トランスフェクトhCMEC/D3単層におけるLY Pアプリを測定した。核酸は、正に帯電したポリマー群と核酸22の負に帯電したリン酸基との間の静電相互作用を介して、直径100〜200nmのポリ電解質ナノ粒子に凝縮することができる。23.これらの複合体をDNAナノ粒子(DNADNA)と呼んでいます。私たちの意図は、細胞をトランスフェクトし、所望のタンパク質を発現することですが、hCMEC/D3単層のバリア特性が損なわれないようにする必要があります。我々のデータは、標準的な4時間ルシフェラーゼ遺伝子トランスフェクション体制が、TJバリア完全性の変化を決定するためにLY Pアプリアッセイの有用性を実証するLY透過性を測定可能に変化しないことを示唆している。

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プロトコル

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1.一般的なhCMEC/D3細胞培養

  1. 凍結細胞の蘇生
    注:すべての細胞培養維持および実験は無菌バイオセーフティフード内で行われた。培養培養剤、サプリメントおよび試薬は、無菌製品として購入するか、または微生物汚染を防止するために0.22 μm膜フィルターを用いて濾過を介して殺菌された。
    1. 組織培養フラスコ(75cm2成長面積、今後はT75と呼ばれる)にコラーゲン溶液(0.15mg/mL)を8.5mL加え、インキュベーター(37°C、5%CO2)に1時間置きます。
    2. コラーゲン溶液を取り出し、殺菌されたリン酸緩衝生理食べ物(PBS)でフラスコを静かに洗います。フラスコに完全成長培地の15mLを加え、CO2インキュベーターに15分間放置します。
      注:完全な培地(最終濃度)は、胎児ウシ血清(5%)、ペニシリン連鎖マイシン(1%)、ヒドロコルチゾン(1.4μM)、酸アスコルビン(5 μg/mL)、化学的に定義された脂質を補充した内皮細胞成長基底培地-2(500mL)を含有した。濃縮物(1/100)、HEPES(10mM)および基本的な線維芽細胞増殖因子(1 ng/mL)。
    3. 液体窒素タンクから凍結したhCMEC/D3細胞の凍結を移動し、37°Cの水浴(<1分)でバイアルを急速に解凍します。
    4. 氷の小さなフレークだけが見えたら、すぐに吸引し、事前に温められた媒体を含むフラスコに細胞を移します。フラスコをゆっくりと振り、細胞と増殖培地との混合を可能にする。
    5. フラスコをインキュベーター(37°C、5%CO2)に入れ、2時間後に光顕微鏡で細胞を観察し、細胞が付着していることを確認します。
    6. 細胞がフラスコの底部に付着したら、古い成長培地を取り出し、古い成長培地24でジメチルスルホキシドを置き換えるために、新鮮な予め温められた成長培地の10 mLを加える。
    7. 24時間後、小顕微鏡でスピンドル状の細胞を観察し、古い成長培地を予め温めた新鮮な成長培地に置き換えます。
  2. 細胞培養維持
    1. 100%合流するまで、成長培地を1日おきに補充する。古い成長培地を除去する前に、また新鮮な成長培地を追加した後、顕微鏡下の細胞を確認してください。インキュベーターからフラスコを取り出し、位相コントラスト顕微鏡下でhCMEC/D3細胞を調べて、健康に見えるようにします。
      注:細胞の大部分は、フラスコの底部に取り付けられるべきであり、紡錘形の形態を持っており、しばしば、その膜の周りに屈折する光も見られる。成長媒体は、透明(非曇り)とピンクオレンジ色の色でなければなりません。
    2. フラスコから古い成長培地を取り出し、予め温めた新鮮な培地の10mLをフラスコに移します。
      注: 培地はフラスコの上面に追加し、セルの表面に直接追加する必要はありません。
    3. フラスコを水平位置に戻し、数回静かに揺さぶり、フラスコをインキュベーター(37°C、5%CO2)に戻す前に、顕微鏡下のhCMEC/D3細胞を確認してください。
    4. 通常の培養作業中と実験中の両方で、細胞を取り扱う前後に毎回反転光顕微鏡下で細胞を観察します。実験室のノートに細胞番号または形態の顕著な変化を記録します。
  3. セルの通過
    1. 新しいT75フラスコをインキュベーターで1時間8.5mLのコラーゲン溶液でインキュベートします(37°C、5%CO2)。
    2. コラーゲン溶液を取り出し、殺菌されたPBSでフラスコを静かに洗います。新しいフラスコに予め温められたhCMEC/D3培地の10 mLを加え、フラスコをインキュベーター(37°C、5%CO2)に入れなさい。
    3. インキュベーターからフラスコを取り出し、相コントラスト顕微鏡下でhCMEC/D3細胞を調べて、細胞が100%コンフルエントであるかどうかを確認します。
    4. フラスコ含有細胞からhCMEC/D3細胞培地を取り出し、10mLのPBSでhCMEC/D3細胞を洗浄します。
      注:成長培地に添加されたFBSには、α1-抗トリプシンおよびα2マクログロブリンなどのプロテアーゼ阻害剤が含まれている。これらはトリプシン化プロセスを阻害する。したがって、トリプシン化プロセスの阻害を防ぐためにFBSの痕跡を除去するためにPBSで細胞を洗浄することが不可欠である。






  7. figure-protocol-1
    figure-protocol-2

    figure-protocol-3










  10. figure-protocol-4figure-protocol-5








    figure-protocol-6



    2. figure-protocol-7









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結果

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まず、TJ形成の明らかな運動性を決定するために、LY透過性に対する培養時間の効果を決定した。1 日目から 10 ポストシードまでの平均 LY Pアプリの値を図 2aに示します。1日目の平均Pアプリは4.25 x 10-4 cm/minで、2日目は3.32 x 10-4 cm/minにわずかに低下しました。平均Pアプリの値は3日目に3.93 x 10-4 cm/minにわずかに増加し、6日目まで有意な変化なしで変動しました。Pアプリの値は、おそらく1日目(P< 0.05)と比較して、7日目に2.36 x 10-4 cm/minに大幅に減少しました。Pアプリの値は、7日目から10日目までの2.14 x 10-4と2.36 x 10-4 cm/minの間の範囲で安定化し、バリ...

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ディスカッション

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BBBの重要な役割は、神経微小環境の無血症を維持するために、全身循環と脳との間の非必須イオンおよび有害物質の交換を防止することです。BBBの特徴の一つは、毛細血管内皮細胞が輸送の準細胞経路を効果的に密封するタイトジャンクション(TJ)を形成する能力である。培養hCMEC/D3単層におけるTJバリア形成の明らかな動態を決定する定量的方法としてのLY Pアプリアッセイを実証した。西洋ブロッティングを介して検出されたZO-1式は、次の段落で詳しく説明したように、LY Pアプリスタディからのデータを検証した。開発されたアッセイのさらなる有用性として、我々はさらに、DNA NPトランスフェクションが実験セットアップにおけるTJバリア特性の変化を決定するために、このアッセイの適合性を示すLY Pアプリを測定可能に変更しないことを実証した。

ウェスタンブロットデータは、3日目、5日目、7ポストシードにおけるZO-1発現の明らかな増加と10ポストシード(図4a)

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開示事項

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著者は何も開示していない。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者らは、米国薬学会の2017年新研究者賞、デュケイン大学のハンケル恐れ病賞、マニッカム研究所の薬学部のスタートアップファンドからの財政的支援に感謝しています。私たちは、リーク研究所(デュケスネ大学)の西洋のブロッティング支援とオデッセイ16ビットイメージャーの使用を許可してくれたことに感謝します。また、カンダルプ・デイブ(マニッカム研究所)に対する感謝の気持ちを、西洋のブロッティングの助けを借りておきたい。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
hCMEC/D3細胞株Cedarlane Laboratories102114.3C-P25ヒト脳微小血管内皮細胞株 
gWizLucAldevron 5000-5001ルシフェラーゼ遺伝子をコードするプラスミドDNA
ルシファーイエローCHジリチウム塩 ポリエチレン
オリンパスプラスチックス25-207
24ウェルフラットボトム Olympus Plastics25-107
ブラック 96 ウェル イムノプレート Thermo Scientific437111
S-MEM 1XGibco1951695Spinner-minimum essential medium (S-MEM)
EBM-2CloneticsCC-3156内皮細胞基礎培地-2(EBM-2) 
リン酸緩衝生理食塩水 1XHyCloneSH3025601
Collagen Type I ディスカバリー・ラボウェア株式会社
Pierce BCAタンパク質アッセイキット Thermo Scientific23227
細胞培養溶解 5X 試薬 プロメガE1531
ビートルルシフェリン、カリウム塩 プロメガE1601
SpectraMax i3 Molecular Devices蛍光プレートリーダー
トリパンブルー溶液 0.4%Gibco15250061
ZO-1 ポリクローナル抗体 ThermoFisher61-7300
抗 GAPDH 抗体abcamab8245
Alexa Fluor680 標識 AffiniPure Donkey Anti-Mouse LgG(H+L)Jackson ImmunoResearch Inc128817
12 ウェル、平底Olympus Plastics25-106
RIPA バッファー (5X)Alfa AesarJ62524
AprotininFisherBioReagentsBP2503-10
Odyssey CLxイメージャーLI-CORウェスタンブロットメンブレンのスキャン用
テレフタレート(PET)トラックエッチングメンブレンFalcon 353095 Tissue培養フラスコを備えたTranswellインサート155267 354236バイオサイエンス

参考文献

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hCMEC D3 DNA ZO 1

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