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方法論記事

プライマリ マウス骨格筋の微小血管内皮細胞の分離

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⸱

DOI：

10.3791/58901

⸱

2019年3月6日

 ,  ,  ,  , 
1Institute for Translational Neurology and Neurology Clinic, University of Muenster

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

骨格筋 (MMEC) の微小血管内皮細胞筋毛細血管の内壁の形状し、両方を規制する流体/分子と筋肉組織と血液の間 (免疫) 細胞の移行の交換。前述のように、プライマリ マウス MMEC の分離により「myovascular ユニット」の包括的な生体外の調査。

要約

(筋微小血管内皮細胞、MMEC) 骨格筋毛細血管の内皮細胞が血流や水分、栄養素、感染に対する免疫応答の交換を規制する骨格筋の間の障壁を構築します。免疫細胞の移動を制御することによってエージェント。これらの関数を MMEC 形成機能「myovascular ユニット」(MVU) さら細胞の種類、線維芽細胞、血管、骨格筋細胞などと。その結果、MMEC したがって、MVU の機能不全は様々 な myopathies に貢献します。しかし、MMEC の健康および病気の制御機構の理解が不十分なまま、その解明 myopathies より特定の処置の前に。分離と、MVU のコンテキストでプライマリ MMEC 関数の詳細な調査は可能性がありますこれらのプロセスのよりよい理解を促進します。

この記事は、浄化と文化保守手順などを含む機械と酵素の解離によって骨格筋のプライマリ マウス MMEC を分離するプロトコルを提供します。

概要

酸素、基板、その他の必要な分子血流を介して細胞や臓器を納入します。このインターチェンジは、毛細血管、最小の容器で行われます。毛細血管は、その整合性のまま血管内と間質性スペース間筋恒常性の正常な調節の前提条件内部内皮細胞 (EC) レイヤーによって形成されます。可溶性因子や細胞の選択的な移行を確保するため、EC はタイトで相互接続された単分子膜と単接合1を構成します。栄養素や代謝産物のための障壁としての役割のほか、EC は白血球炎症のプロセスの募集を調節します。炎症や組織の損傷は、EC の表面と白血球の添付ファイルとターゲット組織2に移住を促進するケモカインの製造接着分子のアップレギュレーションにつながります。その結果、EC 批判的に病原体または組織の修復に対する防御など炎症性プロセスの調節に関与しています。

EC の機能不全は直接血管疾患、慢性腎機能障害、静脈血栓症深刻な病原体感染症に関連付けられています。さらに、EC 事実上常に糖尿病や多発性硬化症3など臓器特異免疫に関与しています。血流や臓器間バリア機能したがって、異なる種類の細胞の協調的相互作用によって制御されます。骨格筋血管内皮細胞 (MMEC) 一緒に筋細胞、線維芽細胞と血管形成機能ユニット、「myovascular ユニット」(MVU).したがって、機能不全、MVU は筋疾患の病態に重要な役割を果たす可能性があります。しかし、これらの機構のより深い理解は依然行方不明、現在 myopathies の新しい、緊急に必要な治療標的の同定を排除します。

複雑な生理学的および病態生理学的メカニズムを調べるためには、動物モデルがよく使用されます。ただし、体外モデルは、さまざまな交絡因子を除外することによって関心の対象に焦点を当てることの利点を提供します。プロセスを調査するには、体外必要だ純粋な実行可能な一次電池を分離します。細胞株と対照をなしてトランスジェニック動物由来初代培養細胞は体外遺伝の修正の結果を調査する有効にします。

ここでは、プライマリ マウス MMEC を分離する方法は、機械と酵素の解離を磁気活性化細胞の浄化のための技術 (MCS) の並べ替え順を使用して説明します。この目的のため特定の表面マーカーに対して磁気ビーズを使用します。血小板内皮細胞接着分子-1 (PECAM1、CD31) EC の発現は、この型のセルを豊かに使用することができます。高い細胞純度を保証するには、造血起源の細胞は (PTPRC, CD45) 型受容体蛋白のチロシン脱燐酸化酵素 C の負の淘汰によって除外されます。さらに、品質管理、栽培プライマリ マウス MMEC、潜在的なアプリケーションの制限事項と注意事項が掲載されています。

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プロトコル

すべての動物実験は自治体によって承認され、ドイツの動物福祉法 (84-02.05.20.13.097) に従って実施します。

1. 動物実験に関する総論

  1. それぞれの施設の動物ケアのガイドラインに従ってすべてのマウスの実験を行い、委員会を使用します。
  2. 実験動物科学連合 (FELASA) のための連合などの国際ガイドラインによると標準化された条件下でマウスを維持します。
    注:一般的に年齢、性別、遺伝的背景の独立したマウスのこの分離方法を使用できます。十分な細胞数を得るためには、4-10 週古い男性が好ましい、年齢や性別と生物学的特性が異なるため。

2. ソリューション、メディアおよびコーティングの準備

  1. 200 μ L と 2.2 mL Dulbecco´s 変更イーグル培地 (DMEM) を混合することによって消化ソリューション (DS) を準備コラゲナーゼ当期と 45 μ デソキシリボ核酸 (DNase)。
  2. 50 ml の FCS DMEM (約 10%)、0.25 mL 塩基性繊維芽細胞増殖因子 bFGF (20 μ g/mL; 約 0.05%) の 450 mL を混合することにより血管内皮細胞用培地 (ECM) の 500 mL を準備します。5 mL ペニシリン-ストレプトマイシン (約 1%)。ガラス管の中の生殖不能のろ過を実行 (フィルター孔の直径: 0.2 μ m)。その後 4 ° C でソリューションを格納します。
  3. 下記のとおり細胞培養皿をコートします。
    1. 新鮮単離のプライマリ マウス MEC カバーの耕作のためよくセル 6 ウェルあたり 1 mL の全体の表面のゼラチン ベース速度コーティング液培養プレート (材料の表を参照してください) の部屋で 3-5 分の製造元の指示に従って温度 (RT)。
    2. 吸引し、コーティング液を破棄します。2 mL 滅菌リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)、pH 7.1 から 7.5 2 連続洗浄ステップでの各ウェルを洗浄します。
    3. 吸引し、PBS を破棄します。ECM の 1 mL 量と井戸を埋めます。

3. プライマリ マウス筋微小血管内皮細胞 (MMEC) の分離

  1. 4-12 週間大人 1 人を安楽死させる頚部転位、麻酔なしで古い、男性マウス。目的は、すぐに動物を迅速かつ痛みのない死を提供するために脳から脊髄を分離することです。
  2. 四肢を切断します。
    1. 手術シャープ/鈍 (最先端 42 mm、ストレート) を使用して、シャープ/シャープ (最先端 23 mm、ストレート) シザー、ストレート (鋸歯状、2 mm x 1.25 mm x 12 cm) とカーブ (鋸歯状、1.3 mm x 1 mm x 13 cm) 鉗子。
    2. 70% エタノールですべての手術器具を消毒します。
    3. その背中に動物の位置、足 70% エタノールを湿らせた。シャープ/鈍外科はさみと股関節で切断することによって脚全体を断ちます。閉鎖細胞培養ディッシュ (35 mm × 10 mm) に四肢を配置します。
      注:さあ今から滅菌層流フードの下ですべての手順を実行、滅菌器具を使用します。
  3. 筋肉組織を分離 (毛様体筋大腿四頭筋または両方の足から下腿三頭筋を優先的に使用)。
    1. シャープ シャープはさみとカーブタイプ鉗子を使用してヒップからつま先先端に開いている皮膚をカットします。ストレート ピンセットでつま先や足蹠を保持します。腰につま先からカーブタイプ鉗子で皮をはがします。
    2. 膝の腱を切断することによって毛様体筋大腿四頭筋を隔離し、股関節を大腿骨に沿って筋を断ちます。下腿三頭筋を分離するには、アキレス腱を切断します。以下、膝窩に脛骨に沿ってカットし、筋肉を削除します。
      注:大型船 (A. 反射、 A. 前脛骨筋、後脛骨 A.、 A. fibularis) が分離された筋肉で表示されている場合は、血管内皮細胞による汚染を避けるために船を削除します。
    3. 大型船を削除するには、カーブタイプ鉗子を含まない大血管の筋肉の一部を押し船の横に切ってください。このプロトコルでは、1 g または大腿四頭筋、下腿三頭筋の両方に等しい以下の筋肉組織を推奨します。
    4. 2,445 μ DS (ステップ 2.1) から細胞培養ディッシュ (35 mm × 10 mm) を追加し、重量を決定します。
    5. 2445 μ DS を含むこの細胞培養皿にすべての筋肉の部分を転送し、重量を決定します。両方の測定値の差は、1 g を超えないようにする必要があります筋肉組織の乾燥重量を提供します。
    6. シャープ シャープはさみを使用して小さな断片 (2 mm 角、約 100 枚) に全体の筋組織をカットします。
  4. 筋肉組織を切り離して考えます。
    注:    このステップが約 120 分かかります。
    1. 37 ° c (5% CO2インキュベーター) 1.5 h. ストア筋/DS サスペンションは、懸濁液 1 mL インスリン注射器を使用して約 5 分間、20 分ごとに慎重に混ぜます。
    2. 懸濁液を 50 mL のチューブに配置 70 μ m ナイロン セル ストレーナーに転送し、流れを収集します。DMEM の ml の 8 セル ストレーナーを洗浄し、流れを収集します。
    3. 20 ° C で 300 x gで 10 分間の細胞のストレーナー、遠心懸濁液を破棄します。上清を慎重に取り外します。
      注意:ペレットは失いやすい。
    4. アンモニウム塩化カリウム (ACK) lysing バッファーの 1 mL の細胞ペレットを再懸濁します (材料のテーブルを囲む参照) 赤の血液細胞の換散のためインキュベートする 30 の右追加 9 mL DMEM で s + 10% と 15 mL t 反応と移動セル中断を停止する FCS宇部。
  5. CD45 を使い果たす+セル CD45 ビーズ メーカーの指示に従います。CD45 のすべての次の手順の+枯渇 MCS バッファーを使用 (材料のテーブルを囲まれているを参照してください)。
    注:    この手順は、約 60 分。
    1. カウント部屋ノイバウアー細胞を使用して細胞の数を決定する (g 筋肉組織ごと約 5 x 10 の6セルを期待)。
    2. 4 ° C で 10 分間 300 × gで遠心分離機を懸濁液上清を完全に脱ぐし、90 μ L MCS バッファー (10 の7セルごとまたはそれ以下) で細胞ペレットを再懸濁します。CD45 ビーズ (10 の7セルごとまたはそれ以下) の 10 μ L を追加します。
    3. 細胞懸濁液を混合し、4 ~ 8 ° C で冷蔵庫の中に 15 分間インキュベート
    4. (10 の7セルごとまたはそれ以下) 1 mL MCS バッファーを追加します。300 x gで 4 ° C で 10 分間遠心上清を完全に削除して 500 μ L MCS バッファー内の細胞を再懸濁します。
    5. 磁気細胞分離用 8 mL のタンク容量と最大 2 x 109の合計セルの容量大きな磁気列 (LMC) を使用します。区切り文字の磁場で、LMC を配置します。
    6. 3 mL の MCS のバッファーで、LMC の貯水池にすすいでください。洗浄した後、流れを収集する列の下の 15 mL の円錐管を配置します。列にセル全体の懸濁液 (500 μ L) を適用し、通すそれ完全に流れ。
    7. 貯水池に 3 mL の MCS のバッファーを追加することによって、列を 3 回洗浄し、洗浄の次のステップを実行する前に column´s 貯水池は空まで待ちます。
    8. 分離手順についてはさらに渡す列ラベルのセルを使用して収集 (、CD45 を表す分数- )。標識細胞 (、CD45 を表す+分画) に蓄積された列を破棄することができます。
  6. CD31 を蓄積+細胞次の CD31 ビーズ製造元の指示。CD31 のすべての次の手順の+蓄積 MCS バッファーを使用します。
    注:    この手順は、約 60 分。
    1. 商工会議所を数えるノイバウアー セルを使用してセル数を決定する (期待する g 筋あたり約 4 x 106セル)。
    2. 遠心分離機は、4 ° C で 300 x gで 10 分間のステップ 3.5 からラベルのない細胞懸濁液を取得されました。
    3. 上清を完全に削除します。90 μ L MCS バッファーでペレットを再懸濁します、CD31 ビーズ (10 の7の合計セルごとまたはそれ以下) の 10 μ L を追加します。全体の懸濁液を混合し、4 ~ 8 ° C で冷蔵庫の中に 15 分間インキュベート
    4. 4 ° C で 10 分間 300 x gで 1 mL MCS バッファーと遠心分離機を追加します。上澄みを取るし、500 μ L MCS バッファーの細胞を再懸濁します。
    5. 磁気細胞分離用 3.5 mL のタンク容量と最大 2 x 108の合計セルの容量媒体磁気列 (MMC) を使用します。
    6. 区切り文字の磁場に MMC を置きます。MCS バッファーの 500 μ L で MMC をすすいでください。洗浄した後、流れを収集する列の下の 15 mL の円錐管を配置します。
    7. 列にセル全体の懸濁液 (500 μ L) を適用し、通すそれ完全に流れ。
    8. MCS バッファーの 500 μ L を追加することによって、列を 3 回洗浄し、洗浄の次のステップを実行する前に、列の貯水池が空まで待ちます。ラベル付けされていないセルの列を渡すことを表す、CD45- CD31-分数。品質管理強化のため保存します。
    9. 列区切り記号から削除して適切なコレクション チューブ (15 mL チューブ) の上に置きます。ピペット 2 mL MCS バッファー列に。しっかりと列にプランジャーを押すことにより磁気標識細胞をすぐにフラッシュします。この CD45- CD31+分数を表します豊かなプライマリ マウス EC
    10. 20 ° C で 350 x gで 5 分間遠心分離細胞懸濁液上清を完全に除去し、1 mL の ECM に (期待約 0.6 × 10 g 筋あたり6細胞) 細胞を再懸濁します (手順 2.2 を参照)。(ステップ 2.3) からコーティングの 6 ウェル培養プレートのよく、単一細胞 (0.5 〜 0.7 x 106細胞) を転送 ECM の 1 mL を含みます。
  7. 栽培、滅菌のインキュベーターで CO2を 37 ° C、5% でセルを孵化させなさい。2、3 日おき、ECM を更新します。

4. プライマリ マウス MMEC 浄化

  1. CD31 の 2 番目のサイクルを実行+蓄積、製造元の指示に従って (CD31 ビーズ マウス プロトコル; ステップ 3.6 を参照してください。)。
    1. (7 日間) の後で通常 80-90% の合流点では、セル/トリプシン EDTA 溶液をデタッチします。このため、連続洗浄の 2 つのステップで、2 mL 滅菌 pbs 各ウェルをすすいでください。6 ウェルあたり 800 μ L トリプシン/EDTA 溶液を使用し、1200 μ 10 %fcs の最小値を含む DMEM を使用して 37 ° C、5% CO2 3-5 分停止酵素活性の滅菌インキュベーターで孵化させなさい。
    2. 20 ° C で 350 x gで 5 分間細胞懸濁液を遠心分離します。
    3. 純度 (CD31 ビーズ manufacturer´s 指示に従って; 3.6 参照) を増加する 2 番目 CD31 MCS 手順実行します。
    4. 明るいフィールドを介して細胞合流または標準的な位相差顕微鏡を使用して観察、
      20 倍の倍率と 0.35 レンズの開口数。図 1を参照してください。
      注:セルをそれぞれ実験用または文化に継が保管できます。低い通路で速やかに実験用セルを使用します。通過した後セルを使用することは控える
      8-10。

5. 品質管理

  1. 2 番目の CD31 MCS ステップ後のプライマリ マウス MMEC フローサイトメトリーを実行します。
    1. 1 mL の流れ cytometry (FC) バッファーを追加して FACS チューブを準備 (材料のテーブルを囲まれているを参照してください)。
    2. (14 日) の後で通常 100% の合流点では、セル/トリプシン EDTA 溶液をデタッチします。このため、連続洗浄の 2 つのステップで、2 mL 滅菌 pbs 各ウェルをすすいでください。6 ウェルあたり 800 μ L トリプシン/EDTA 溶液を使用し、1200 μ L を使用して, 3 – 5 分停止酵素活性の滅菌のインキュベーターで CO2を 37 ° C、5% で 10% の FCS を含む DMEM。
    3. · ノイバウアー商工会議所細胞数および準備の FACS チューブに 1 x 10 の5セルの最小値を追加を使用してセル数を決定します。
    4. 4 ° C で 300 x gで 10 分間遠心分離細胞懸濁液上清を除去し 1 mL FC バッファー内セルを再、4 ° C で 300 x gで 10 分間遠心分離して 2 つの洗濯の手順します。
    5. 抗マウス CD31 FITC 抗体 (1: 100) と抗マウス CD45 PE (1: 100) FC バッファーを追加することによって染色ミックスを準備します。
    6. FACS チューブでミックスを染色の 100 μ l 細胞を再懸濁します。4 ° C で 30 分間インキュベートします。FC バッファーの 1 つの mL を追加します。4 ° C で 300 × gで 5 分間遠心分離細胞懸濁液慎重に上清を除去し、FC バッファーの 200 μ L で細胞を再懸濁します。
    7. ゲートの戦略に従う流れの cytometer でメジャーのセルを図に示します。2 A。
  2. また 2 番目の CD31 MCS ステップ後プライマリ マウス MMEC の免疫蛍光染色を行います。
    1. コート、coverslips。
      1. 24 well プレートのウェルにガラス基板ラウンド滅菌 13 mm 径を転送します。スピード コーティング ソリューション ウェルあたりの 300 μ L を追加することによって coverslip をコートします。室温 (RT) で 3-5 分間インキュベートします。
      2. 吸引し、コーティング液を破棄します。2 連続洗浄ステップで 2 mL 滅菌 PBS の各ウェルを洗浄します。吸引し、PBS を破棄します。
      3. 種子 1 x 105 1 mL ECM、コート上で細胞し、細胞が 99% 合流まで滅菌のインキュベーターで CO2を 37 ° C、5% で孵化させなさい。
    2. 固定および免疫組織染色法を実行します。
      1. 5.2.1.3 から培養細胞の ECM のメディアを削除します。
      2. まあ、4 ° C で 10 分間あたり 7.4 の pH を 300 μ L 4% パラホルムアルデヒド (PFA) を追加することによって培養細胞を修正します。
        注意:PFA は毒性があり注意して処理する必要があります。
      3. ウェルあたり 1 mL の PBS を追加することによって 3 の洗浄手順を実行し、室温 5 分後に上清を除去
      4. ブロッキング ソリューション含む 5 %bsa、PBS で 0.2% トリトン X と 1% ヤギ血清を準備します。
      5. 各ウェルにブロッキング液の 300 μ L を追加し、室温 1 時間インキュベート
      6. 上澄みを除去し、5 %bsa、PBS で 1% ヤギ血清中抗 PECAM 1 (CD31) 抗体 (レバレッジ) ウェルあたり 200 μ L を追加し、, 4 ° C で一晩。
      7. ウェルあたり 1 mL の PBS を追加および削除して手順を洗浄、培養上清中の各ステップで常温 5 分後 3 を実行します。
      8. 1 %bsa と PBS Cy3 標識抗ラット IgG 抗体 (1: 500) を含む二次抗体溶液を準備します。二次抗体の解決の井戸あたり 300 μ L を追加し、暗闇の中で RT で 1 時間インキュベートします。
      9. ウェルあたり 1 mL の PBS を追加および削除して手順を洗浄、培養上清中の各ステップで常温 5 分後 3 を実行します。
    3. ピンセットで慎重に丸いガラス coverslips を取り出し、顕微鏡スライド上に転送。細胞層の媒体含む DAPI をマウントの適切な量を追加し、慎重につけてカバー ガラス (囲まれた材料の表を参照してください)。
    4. 蛍光光源 (120 W) を搭載した適切な蛍光顕微鏡で細胞を観察し、2 つのフィルター セット: 励起/蛍光フィルター セット 550/25 nm と 605/70 nm 波長 Cy3 540/562 nm を検出します。
    5. 励起/蛍光波長 365/50 の設定 2 番目のフィルターを使用して nm と 445/50 nm DAPI 350/440 nm を検出します。40 倍の倍率を使用し、Cy3 の検出のため 30 さんの取得期間が DAPI の 14.5 mW/cm2の 80% の強度が 60 ms の取得期間が 67.5 mW/cm2の 80% を使用します。
  3. 量的な PCR を実行します。
    1. MRNA の隔離。
      1. チオシアン酸-フェノール (AGTP)、酸のための試薬を使用して mRNA を分離する標準的な手順に従います。CD45 の細胞 106 × 0.5 の最小値を使用して- CD31- (3.6.8 のステップを参照)、CD45- CD31+ (3.6.9 の手順を参照してください). 分数と栽培されているプライマリ マウス MMEC (4.1.3)
      2. 20 ° C で 300 x gで 10 分間遠心分離細胞懸濁液上清を完全に脱ぐ。2 mL の反応管に AGTP 試薬および転送細胞懸濁液 500 μ L に細胞ペレットを再懸濁します。右で 5 分間インキュベートします。
      3. 100 μ L のクロロホルムを加え室温 3 分間 15 s. 加温のため積極的に振る
      4. 4 ° C で 12,000 × gで 15 分遠心懸濁液
      5. 上水相 (RNA を含む) 慎重に離陸し、反作用の管を 1.5 mL に転送します。イソプロパノールの 250 μ L を追加し、室温 10 分間インキュベート
      6. 4 ° C で 10 分間、12,000 × gで遠心分離のステップを実行します。
      7. 上澄みを取るし、慎重に 75% エタノール 1 mL を加えます。7,500 × gで 4 ° C で 5 分間遠心します。
        注:ペレットは、失いやすいです。
      8. 上清を完全に削除します。5-10 分のための空気の乾燥ペレットをしましょう。
        注:エタノールが削除する必要がありますあまり乾燥しません。
      9. 30 μ L ジエチルピロカーボネート処理に水を含むと 55 ° C で 10 分間の熱でペレットを溶解します。
        注:RNA 濃度・純度は、分光光度計で測定できます。
    2. CDNA 合成 (逆転写 PCR) を実行します。
      1. マスター ミックスを含む準備: 10 μ L の PCR バッファー (5 x)、2, 5 μ L desoxyribonucleosid-三リン酸 (dNTP (10 mM))、単一座礁させたプライマーの混合物をランダム 0.5 μ L (0.2 μ g/μ L)、RNase 阻害剤の 1 μ L (40 U/μ L、0.4 逆転写酵素 (200 U/μ L) と 5.6 μdiethylpyrocarbonat 処理水 (囲まれたを参照してください材料表)。
      2. 0.2 mL PCR チューブおよび全体の 20 μ L マスター ミックスを追加で 30 μ L ジエチルピロカーボネート処理水 500 ng の RNA を希釈します。
      3. 次の手順を実行する PCR サーマルサイクラーを使用: 4 ° C の 25 ° C、30 分 50 ° C、5 分 85 ° C 10 分押し
  4. 量的な PCR (qPCR) を実行します。
    注:重複またはトリプリケートの qPCR のサンプルを実行します。
  5. 2 つの異なる蛍光色素でプライマーを使用します。495 の吸収とプライマー nm と 517 の放出興味の遺伝子の nm。
  6. 衛星細胞マーカー遺伝子発現の検出、対ボックス タンパク質 7 のためのプライマー (Pax7) と M-カドヘリン (Cdh15) を使用 (材料のテーブルを囲まれているを参照してください)。
  7. 血管内皮細胞マーカー遺伝子発現の検出用プライマー クローディン-5 (Cld5)、オクルディン (Ocln) と精巣毛細血管 1 (Tjp1またはZO1) を使用 (囲まれたを参照してください材料表)。
  8. 18 歳の参照の遺伝子として rRNA、538 の吸収とプライマーを使用して nm と 554 nm 波長の放出。
  9. それぞれのプライマーで興味の各遺伝子の qPCR マスター ミックスを準備します。マスター ミックスが含まれています: 10µl qPCR バッファー (2 x) 興味 (10 μ M)、18 歳のプライマーの 1 μ L の遺伝子のプライマーの 1 μ L rRNA とヌクレアーゼ フリー水 4 μ。
  10. 96 ウェル反応板の単一の井戸に、マスター ミックスの 16 μ L を追加します。まあ、マスター ミックスを含むあたり (5.3.2 のステップから取得) cDNA の 4 μ L を追加します。
  11. 次の手順を実行するリアルタイム PCR サーマルサイクラーを使用: 1 分 10 分 40 サイクルでサイクリング ステージ 95 ° C 15 s と 60 ° C の 50 ° C 2 分および 95 ° C のステージを開催します。

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結果

分離、プライマリ マウス MMEC と残留後 1 日他のセル コングロマリットを形成し、培養皿 (図 1 a 1 日目) の下部に付着します。7 日から平らで細長い細胞が観察できます。しかし、他、大抵回転楕円体セルの汚染はまだ目に見える (図 1 aの 7 日目)。したがって、CD31 正の選択を介してMCS は必要の別のサイクル。以下、プライマリ マウス MMEC は約 80-90% の密度に増殖します。合流時に彼らは通常縦一直線に並べられた細胞 (図 1 aの 14 日目) の非重複化単分子膜を形成します。接触阻害による合流点に増殖を停止します。約 14 日後 5-10 x 10 の5セルのすることができますさらに捜査のため使用します。

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ディスカッション

微小血管内皮細胞は、すべての組織にバリア機能と関連臓器3疾患における機能不全成果を提供します。また、微小血管の EC の器官特定研究は新しい治療戦略の道を開く可能性があります。したがって、生理学的および病態生理学的条件下での微小血管の EC 機能のより深い理解は、偉大な科学的な関心です。白血球/血管内皮細胞の相互作用の変調はナタリズマブ、リンパ球の接着を防ぐ抗体の多発性硬化症患者を治療するために正常に使用し、それにより輪廻6。しかし、まだ炎症のサブタイプを含めて様々 な myopathies まま日付に不十分な治療のみ。したがって、骨格筋の血管内皮細胞では特に EC 性質の解明は、ミオパチーや新規治療法で結果に利用可能な治療を展開する助けることができます。

不死化血管内皮細胞 (といえども) は設立されいくつかの生体外モデルを使用します。これらの細胞は、不死化と増殖の速いためプライマリ血管 EC に比べていくつかの利点を提供しています。さらに、初代培養細胞は老衰を経るまたは失うといくつか...

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開示事項

著者は競合する金銭的な利益を宣言しません。

謝辞

この作品によって、「他 Kröner ・ フレゼニウス財団」を受けました (TR に 2018_A03)、"革新的なこの上海虹橋 (IMF) ミュンスター"(私-RU211811 TR) とドイツ研究振興協会 (DFG、INST 2105/27-1、私 3283/5-1、と私 3283/6-1 SGM に).イラスト画像は、平家 Blum によって提供されます。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
0.25% Trypsin-EDTAThermo Fisher25200-056ready to use
ACK バッファー150 mM NH4Cl、10 mM KHCO3、0.1 mM EDTA 水溶液、pH 7.3
抗マウス CD31-FITC (クローン MEC13.3)Biolegend102506アイソタイプコントロール: FITC ラット IgG2a, κアイソタイプ制御
抗マウスCD45-PE(クローン30-F11)バイオレジェンド103106アイソタイプコントロール:PEラットIgG2b、およびカッパ;アイソタイプ: Ctrl,
bFGFPeprotech100-18B塩基性線維芽細胞増殖因子
BSA,Sigma, AldrichA4503
CD31, MicroBeadsマウス, Miltenyi Biotec130-097-418
CD45, MicroBeadsマウス, Miltenyi Biotec130-052-301
コラゲナーゼ-ディスパーゼ, ロシュ10269638001V. alginolyticus由来のコラゲナーゼ、B. polymyxa
Corning Costar TCで処理された複数の6ウェルプレートCorning3516
Cy3-conjugated anti-rat IgG antibodydianova712-166-153
DAPI (ProLong Gold antifade reagent with DAPI)Thermo FisherP36935
DesoxyribonucleaseSigma AldrichD4513ウシ膵臓由来のデオキシリボヌクレアーゼ
I ジエチルピロカルボナート処理水サーモフィッシャーAM9916
DMEM、グルタミンサプリメントとピルビン酸サーモフィッシャー31966-02137°Cまで温めます。使用前のC
dNTP Mix (10 mM)Thermo FisherR01921 mL
EDTA SigmaAldrichE5134
FACS tubesSarstedt551,579
Falcon 70 μm Cell StrainerCorning352350
FC buffer0.1% BSA, 0.2% NaN3, 2 mM EDTA
子牛胎児血清Sigma AldrichF6178Fetal
Viability Dye eFluor780Thermo Fisher65-0865-14
鉗子 (鋸歯状、ストレート、12 cm)Fine Science Tools11002-12
鉗子(鋸歯状、ストレート、12 cm)Fine Science Tools11009-13
Insulin syringe 100 Solo 1 mL (Omnifix)Braun9161708V
large magnetiv columns (LS columns)Miltenyi Biotec130-042-401for CD45-MACS-step
MCS buffer0.5% BSA, 2 mM EDTA in PBS at a pH of 7.2
中磁気カラム (MS カラム)MiltenyiBiotec130-042-201CD31-MACS-step
NucleaseフリーウォーターThermo FisherR0581
PBSSigma AldrichPhosphate buffered saline, ready to use
PCR buffer (5x)Thermo FisherEP0742in a kit with the reverse transcriptase
Pecam1 rat α-mouseSantaCruzSc-52713100 &g/mL
ペニシリン-ストレプトマイシンSigma AldrichP4333
初代マウス筋細胞セルプロゲン66066-01
プライマー Cdh15 (M-カドヘリン)サーモフィッシャーMm00483191_m1FAM 標識
プライマー Cldn5 (クローディン-5)サーモフィッシャーMm00727012_s1FAM 標識
プライマー Ocln (オクルージン)サーモフィッシャーMm00500912_m1FAM 標識
Primer Pax-7Thermo FisherMm01354484_m1FAM 標識
Primer Tjp-1 (Zonula occludens 1)ThermoFisherMm00493699_m1FAM 標識
Primer 18s rRNA (Eukaryotic 内因性制御)Thermo Fisher4310893EVIC 標識
qPCR バッファー (Maxima Probe/ROX qPCR Master Mix (2X)Thermo FisherK02312 x 1.25 mL;各200反応の場合
一本鎖プライマーのランダム混合物サーモフィッシャーSO142ランダムヘキサマープライマー
、逆転写酵素(200 U/μL) + PCR バッファー (5x)Thermo FisherEP0742
Rnase Inhibitor (40 U/μL)サーモフィッシャーEO0381
ハサミ(刃先23mm、シャープ/シャープ)ファインサイエンスツール14088-10
ハサミ(刃先42mm、シャープ/鈍い)ファインサイエンスツール14001-13
スピードコーティング液ペロバイオテックPB-LU-000-0002-00
, , ,, , , , 由来のコラゲナーゼ を含む 、、、

参考文献

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