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方法論記事

体外メゾスケール粒子画像流速測定法研究神経血管の流れ

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DOI：

10.3791/58902

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2018年12月3日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Mechanical Engineering, University of California, Riverside, 2Division of Interventional Neuroradiology, University of California, Los Angeles, 3Materials Science and Engineering Program, University of California, Riverside, 4Department of Bioengineering, University of California, Riverside

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

ここで透明な神経血管ファントムを作製し、そこに流れを特徴づけるの簡略化手法を提示します。我々 は、いくつかの重要なパラメーターを強調表示し、フィールドの精度との関係を示します。

要約

粒子画像流速測定法 (PIV) は、幅広い分野、正確に可視化と大規模な時空間の範囲にわたって流の定量化は、機会のために使用されます。ただし、その実装は通常高価で、専門的な計測器より広範な応用を制限する使用を必要です。また、バイオ エンジニア リングの分野で体外流れ可視化研究は、しばしば、さらにそれらのために特に必要な解剖学的構造を要約するだろう商業的供給された生体ファントムの高コストによって制限されます。メソスケール政権 (すなわちミリメートルの長さスケール サブミリ) に します。本明細書で提案する簡易実験プロトコルが重要な要素に 1) 3次元印刷及びシリコン鋳造を用いたメソ組織ファントムを作製する比較的低コスト方法は、これらの制限に対処するために開発、2)メソスケールの流れを測定するための計測時に需要を減らしてオープン ソース画像の解析と処理のフレームワーク (すなわち、数十ミリの最大速度/秒)。まとめて、これは既に多くの工学研究者の処分で資源を活用してのうえ、エントリへの障壁を下げます。私たち刻みフロー解析、神経血管のコンテキスト内でこのプロトコルの適用しかし、それは生体内外のメソスケール アプリケーションの広い範囲に関連するとなっています。

概要

PIV は、流れの可視化と微小循環フロー1,2,3大気から長さスケールで変わる流体運動の定量調査のための実験流体力学で使用されています。その実装の詳細は、その応用として広く異なります 1 つの側面のほぼすべての PIV 研究に共通はトレーサー粒子連続の画像フレームのペア分析に続いて、作動流体内シードのビデオ画像の使用必要な流量特性を抽出。通常、これは、尋問 windows と呼ばれる小さな地域ごとのイメージのフレームを分割で。分散粒子のランダムな位置、結果として各尋問ウィンドウにはユニークな輝度分布が含まれています。ウィンドウ サイズとデータ レートが適切に選択されている場合は、その領域内で平均変位を推定する各ウィンドウで輝度信号の相互相関を使用できます。最後に、倍率とフレーム レートが実験的パラメーターを知られていることを考えれば、瞬時速度ベクトル フィールドは計算して容易に。

PIV のシングル ポイント測定技術上の主な利点は、2 次元または 3 次元ドメイン全体でベクトル フィールドをマップする機能です。血行動態のアプリケーション、特に、恩恵を受けているこの機能から血管疾患や改造 (例えば、アテローム性動脈硬化、血管新生) で重要な役割を果たすことが知られているローカルの流れの徹底的な調査が可能4,5,6また血管流の評価のために行われている、ことができます血管内デバイス (例えば、流れリネンカード、ステント、intrasaccular コイル)、このようなアプリケーションで関連する長さスケール以来とその相互作用。1 つ以上の桁 (例えば、ミリのマイクロメータから)、およびデバイスのジオメトリにまたがることが多いと配置することができますローカル流体力学7に大きく影響します。

PIV を用いた血行動態調査を行うほとんどのグループは、ステント血管7,8影響の最も早い調査のいくつかを近づける実験のセットアップに頼ってきました。通常、これらを含む、) パルス レーザーと高速フローをキャプチャするための高速カメラb) シンクロナイザー、レーザーのパルス周波数とカメラ フレーム レート; のエイリアシングを防ぐためにc) 円筒光学、光シートを形成し、トレーサー粒子尋問平面の上下からのバック グラウンド蛍光を最小限に抑えるため、d) 商業ターンキー システム、相互相関解析を実行するための独自のソフトウェア パッケージの場合します。ただし、一部のアプリケーションでは、パフォーマンスおよび/または総称してこれらのコンポーネントによって与えられる汎用性も必要ですが、多くの他はありません。また、目的の血管構造を要約ファントムがまた証明できる商業的供給された組織のコストが高い多くの in vitro研究を制限するとファントムの特に機能橋メソスケール政権 (> 500 米ドル/怪人)。通常空間の両方にある神経血管の流れと一時的メソスケール政権 (すなわち長さのスケールの範囲内の in vitro視覚化の PIV を実装するための簡略化されたプロトコルの開発を報告します。サブミリ波ミリ波、し数十ミリメートルの最大速度/秒)。プロトコルは、うえのエントリへの障壁を押えて、バイオ エンジニア リングの研究者の処分で既にリソースの活用を目指しています。

このプロトコルの最初の要素は、透明、ポリジメチルシロキサン (PDMS) の社内製作を可能にする投資鋳造技術の使用を含む-いけにえ金型の 3 D 印刷から生体ファントムを用いた。近年特に、共有/マルチ ユーザー (例えば、機関施設または設備公共 makerspaces) 3 D プリンターの増加空室状況を活用することにより、この方法論カット コスト大幅 (例えば、<ここに提示の場合 100 ドル/ファントム)、さまざまな設計と形状の作製の急激な方向転換を可能にしながら。現在のプロトコルの溶融堆積モデリング システムはアクリロニ トリル ・ ブタジエン ・ スチレン (ABS) で建築材料として使用、その後ファントム鋳造用犠牲型として印刷されて。我々 の経験はそれが (例えばアセトン)、一般的な溶剤に可溶であり十分な強さ及び剛性サポート材料を除去した後の金型の整合性を維持するため、ABS はそのような使用に適してを示している (例えば、防ぐため変形や小柄なモールド フィーチャーの破壊)。現在のプロトコルの金型の整合性はさらに保証印刷のソリッド モデルを使用して、溶解が増加時間を犠牲にして来ているがこれ。中空モデルの使用溶媒のアクセスを高め、溶解時間を削減する、いくつかのケースで可能な場合もあります。ただし、考慮する必要があります注意してください効果をこれにあります金型整合性。最後に、本作製したファントムは、一般的なコンピューター支援設計 (CAD) ソフトウェア パッケージを使用して生成された神経血管構造の理想的な表現に基づいています、間プロトコルがより複雑な加工にする予定です。、患者固有のジオメトリ (例えば、経由での使用に臨床画像データの変換によって生成されたモデル ファイル、。STL ファイル形式ほとんどの 3 D プリンターで使用される)。ファントムの作製プロセスに関する詳細については、プロトコルのセクション 2 で提供されます。

プロトコルの 2 番目の要素には、オープン ソース相互相関解析9を実施する ImageJ のプラグインの使用が含まれます。これは単純な統計しきい値方式の実装とつながれる (すなわち強度の上限) 正規化された postcorrelation ベクトルの検証スキームと同様に、相互相関、送る前に画像信号を改善するために10中間テスト (NMT)、その最も近い隣人11にそれぞれの比較を通してスプリアス ベクトルを排除します。総称して、これは典型的な PIV システム (例えば、パルス レーザーの高価なコンポーネントの多くの取得の必要性がなくなり、バイオ エンジニア リングの研究所で一般的に見られる機器を使用して実行するイメージングによりシンクロナイザー、円筒形の光学系と独自のソフトウェア)。ビデオ コレクション、画像処理、データ分析に関する詳細については、セクション 5 および 6 のプロトコルで提供されます。

図 1の連続の白色光源 (すなわち、メタルハライド ランプ) を外部だけでなく、イメージングのための高速カメラを搭載した蛍光顕微鏡に依存してこのプロトコルで使用されている PIV セットアップを示しています。目的によって体積の照明。神経血管組織ファントムで透明な模擬血液ソリューションの循環気流を課すため変速歯車ポンプに使用します。ソリューションは脱イオン (DI) 水とグリセリンは、一般的な代替は、血液循環動態の研究ために12,13,14, 60: 40 の混合物から成る、) と同様の密度と粘度 (はすなわち、1,080 kg/m3と 3.5 cP vs 1,050 kg/m3との血のための 3-5 cP)15,16;b) 表示の範囲で透明度c) そのような屈折率 PDMS (1.38対1.42 PDMS の)17,18,19、20、光の歪みを最小限に抑えますd) 必要な場合は、非ニュー トン粘性挙動を導入することができますしやすさを介してxanthane21を追加。最後に、蛍光のポリスチレン ビーズはトレーサー粒子 (直径 10.3 μ m; 480 nm/501 nm 励起/蛍光) として使用されます。中立的に浮揚性のビーズが必要なとき最適な流体の力学特性 (例えば密度、サイズ、組成) と発光波長トレーサー粒子を調達挑戦証明することができます。たとえば、ここで用いられるビーズはグリセロールの解決 (1,050 kg/m3 対1,080 kg/m3) よりわずかにより少なく密です。ただし、流体力学的効果は、そのはごく典型的な実験の期間は浮力効果に関連付けられたタイム スケールよりもはるかに短いことを考える (すなわち、5 分、20 分、それぞれ)。さらに模擬血液ソリューションの定式化と体外循環システムのセットアップに関する詳細は、セクション 3 と 4 のプロトコルで提供されます。

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プロトコル

1. ABS ベース犠牲型作製

  1. CAD ソフトウェアを使用して必要な組織ファントムの逆モデルを設計します。
  2. 建築材料として abs 樹脂 3 D プリンターを用いたモデルを印刷します。

2. PDMS による血管ファントム作製

  1. 混合
    1. (量り売り); PDMS プレポリマー ベースと比 10:1 硬化剤を混ぜる66 g の混合物は、50 cm3をボリュームとファントムの作製のための十分な材料を提供します。
    2. ドガし、気泡の巻き込みを最小限に抑えるために 60 分の真空デシケータで混合物を配置します。繰返し加圧・減圧を使用して、促進するバブル破裂します。
  2. 鋳造
    1. インターフェイスをシールする成形パテを使用してスライド ガラスに印刷された abs 樹脂金型をマウントします。
    2. 慎重に中に気泡の巻き込みを最小限に抑えるため、金型に PDMS の混合物を注ぐ。残留気泡は、針を使用して手動で破裂することができます。
    3. 少なくとも 24 時間室温 (25 ° C) で、cast、ファントムを治します。
      注意: 高温でこのプロセスは加速22をすることができます。
  3. 離型
    1. アセトンでファントムを水没して 70 w. までの力を使って、少なくとも 15 分間 sonicating ABS を解散します。
      注意: アセトンは常温、低引火点の高い蒸気圧です。その結果、ヒューム フードの下で、潜在的な点火源からとは限りません。適切な個人用保護具 (例えば、ゴーグルまたは面のシールド、白衣、アセトン耐性の手袋) を着用します。
    2. イソプロピル アルコールと、その後、溶媒残基を削除する・ ディ ・水ファントムを徹底的にすすいでください。
      注: アセトン; への露出に PDMS のうねりただし、怪人すすぎは、23を十分に乾燥したら腫れが治まります。
  4. 光学顕微鏡を用いたファントムの再現性の確認
    1. 光学顕微鏡を使用すると、接続されたカメラと画像キャプチャ ソフト、ビューのフィールド内の機能を最大倍率でファントム内の重要な機能のイメージをキャプチャします。
    2. 同じ倍率で適切な校正レチクルのイメージをキャプチャします。
    3. ImageJ に両方の画像をロードするには、ツールバーにドラッグします。
    4. アクティブにするキャリブレーション レチクル画像をクリックし、 [線] ツールを選択します。既知の距離と選択の機能に沿って線を描画するマウスを使用して分析 > スケールを設定ImageJ メニューから。
      注:スケールを設定] ウィンドウで [ピクセル単位の距離] フィールド事前設定が必要ピクセル単位で描かれた線の長さを持つ。
    5. 既知の距離と長さの単位] フィールドにそのユニットの欄にフィーチャの長さを入力します。チェック ボックスをオンすべての開いている画像にこの校正係数を適用するグローバル。
    6. ファントムの重要な機能のイメージをアクティブにして、線ツールを使用して、対象の特徴に沿った線を描画します。ImageJ メニューから選択分析 > メジャー (またはctrl キーを押しながら Mキーを押して)、線の長さを測定します。
    7. 結果ウィンドウでファントムの再現性を確認するため、長さをマークされた列内の値に対する予期される値を比較します。

3. 模擬血液ソリューション策定

  1. ・ ディ ・水と 60: 40 の比率でグリセリンを混ぜる (ボリューム) で。
    注: 100 mL ボリューム記載体外循環のシステムのために十分です。
  2. 模擬血液ソリューションに 2.5 %w/v 蛍光ポリスチレン ビーズ ソリューション (すなわち、トレーサー粒子) の 1 つの mL を追加します。
  3. 10 分間 400 rpm で電磁攪拌プレートでの混合物を均質化します。

4.体外循環システムのセットアップ

  1. ポンプのセットアップ
    1. AC-DC アダプター電源から DC 側プラグを遮断するワイヤ ストリッパー工具を使用します。
    2. 電源コーティングをストリップし、地上線パルス幅変調 (PWM) 電圧レギュレータの入力端子に接続します。
    3. ポンプの DC モーターから PWM 電圧レギュレータの出力端子に電源とグランド線を接続します。
      注: PWM の 7 セグメント表示出力デューティー比可変電圧 DC モータを達成するために使用される (0% から 100%)。
  2. 校正をポンプします。
    1. 模擬血液溶液 (参照 3) 200 mL を準備します。
    2. ポンプ インレットから模擬血液のソリューションを保持しているビーカーにチューブを置きます。
    3. 空のビーカーにポンプ排水口からチューブを配置します。
    4. (0% から 100%) に必要なデューティ サイクルのセット ポイントを選択します。ボタンを押すし、タイマーを起動します。
    5. ポンプが模擬血液ソリューションの全体ボリュームを転送したら、タイマーを停止します。この時間を使って体積流量を計算します。
    6. 4.2.1 - 4.2.5 最低 5 つの異なるデューティ サイクル セット ポイント最小二乗回帰曲線を確立するための手順を繰り返します。
      注: デューティ サイクル セット ポイントごと 3 つ複製ポイントの最小値をお勧めします。この関係を使用して所望の流量必要な PWM のデューティ サイクルを関連付けることができます。

5. ビデオ コレクション

  1. イメージキャリブレーション
    1. ビデオ イメージング (参照 2) 校正比率を決定します。
  2. 装置設定
    1. 蛍光顕微鏡のステージに PDMS ファントムを配置します。
    2. 歯車ポンプにファントムを接続し、模擬血液のソリューションをご紹介します。
      注: 必要に応じて、濡れ prefill 検討を容易にするエタノール モデル;フラッシュし、模擬血液ソリューションでそれを埋めます。これは小さい船および/またはブラインド フィーチャーを持つモデルにとって特に有益かもしれません。
    3. ポンプ較正曲線に基づく任意の流量のポンプ モーター コント ローラーを設定します。
    4. 定常状態を確認するための実験の前に 1-5 分のポンプを実行します。
    5. ビューのフィールドを照らす外部ランプを点灯します。蛍光ビーズの励起波長に基づいて適切なフィルターを選択します。
    6. 容器内ミッド プレーンにイメージング焦点面を調整します。
      注: これはイメージ容器断面の最大焦点距離を使用して達成することができます (例えば、円形の容器でファントムを使用する場合の断面);および/または容器のミッド プレーンの識別を容易にするために設計されたファントム機能のインデックスします。
  3. ビデオの録画
    1. 信号対雑音比 (SNR) を最適化するためにビデオの録画のパラメーターを選択します。重要なパラメーターは、露出時間、フレーム レートし得る。
      注: このプロトコルで我々 を使用して 2,000 fps のフレーム レートおよび 1.0 の利得。ただし、これらのパラメーターは、アプリケーションに基づいて異なる場合があります (詳細についてはさらに議論を参照してください)。
    2. ビデオを収集し、AVI 形式で保存します。
  4. ファントム クリーンアップ
    1. 実験後ビーズ付着が見られる場合超音波ファントム 70 w. までの力を使って洗剤水溶液を

6. 画像処理およびデータ解析

  1. 画像前処理
    1. 保存された AVI ファイルをインポートする ImageJ ウィンドウにドラッグします。グレースケールに変換マーク ボックスを選択します。
    2. ImageJメニューから選択分析 > ヒストグラムの生成(またはctrl キーを押しながら Hキーを押して) 画像ピクセル強度のヒストグラムを生成します。未処理の画像の標準偏差と平均の注意してください。
      注: 高フレーム レートでは珍しくゼロに向けて大きく傾斜するのに配布する (すなわち、信号なし)。
    3. ImageJメニューから選択イメージ > 調整 > 明るさとコントラスト(またはShift + Ctrl+ H) 明るさ/コントラスト フィルターを適用します。
    4. [明るさとコントラスト] メニューで、イメージの制限を定義する、[設定] ボタンを押します。(両方は 6.1.2 の手順で得られた統計に基づく) イメージの最大強度を最大値と 1 つの標準偏差、平均値に最小値を設定します。
      注: これは通常ピクセル強度のトップ 10% がなくなります。標準偏差の数は、所望の輝度分布によって変わるかもしれない。操作の上限強度を実行するためのカスタム マクロ スクリプトは、補足資料で提供されます。
    5. ImageJメニューから選択プロセス > ノイズ > ゴミ消し飽和ピクセルの数を減らすこと。
      注: この操作は、ピクセルの彩度と後続の相互相関の間に偽のベクトルを作り出すことができるコントラスト、明るさの最適化中に発生したの増加の可能性で必要とされています。
    6. ImageJメニューから選択プロセス > フィルター > ぼかし (ガウス)事前の操作を despeckling で 3 x 3 近所で照らされたピクセルの時折の除去から生じる成果物を減らすために 1.5 の半径を持つ。
    7. [ポリゴン]ツールをクリックし、利益 (率 ROI) の領域のアウトラインには画像をクリックします。
    8. ImageJメニューから選択編集 > クリア外信号がない場所でのセンサーのノイズを除去する期待される (例えば容器壁境界を越える区域)、全体的な SNR を低下させることができます。
  2. PIV 計算
    注: プロトコルのこの部分では、ImageJ は、サブピクセル精度で変位量の推定を可能にするピーク ガウシアンフィッティング依存のプラグイン サードパーティ PIV を採用しています。
    1. ImageJメニューから選択プラグイン > マクロ > を実行.、保存されているマクロの連続画像のペアを相互に関連付け、補足コード 2. ijjmに移動します。
      注: マクロは以下の通り続きます。連続した画像内の強度フィールドの 1) の相関は、まず運ばれるトレーサー粒子 (すなわちペアは、最初と 2 番目のイメージは、2 番目の画像のペアで構成されています最初の画像の局所変位を決定する実行されます。2 番目と 3 番目の画像等で構成されます。)2) 2 段階マルチパス評価がそれぞれ 256 x 256 ピクセル、128 × 128 ピクセルのウィンドウ サイズを初期および最終尋問で実行されます。最後に、3) マクロ実行スプリアス ベクトルの外観をさらに削減する時間の平均。
  3. 正規化された中間テスト (NMT)
    1. ImageJメニューから選択プラグイン > マクロ > を実行.、保存されているマクロ、速度フィールドを介して検証する補足コード 3. ijjmに正規化された中央値検定を移動します。
      注: マクロは以下の通り続きます。1) 各ベクトル瞬時ベクトル フィールドの最初、中央値を計算するその 8 つの最も近い隣人と比較されます。2) 誤差の配列は、各隣接ベクターと計算の中央値の差として計算されます。3) 調査の下でベクトルとベクトルの中央近隣の価値の違いは、残差の中央値で正規化されます。4) これは、画像取り込み時にノイズの先験的知識に基づいて変えることができるしきい値 (通常、0.2 ピクセル) と比較されます。最後に、5) これはベクトル フィールド品質24を高めるために示されている、すべての検証済みの瞬時ベクトル場の時間平均を実行複合フィールドを生成します。

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結果

図 2は、PDMS 組織ファントムの作製プロセスを示しています。ここに設計されたファントム分岐 perforator 動脈近位部と同様に、理想的な首の全体、嚢状、頭蓋内動脈瘤内の流れの研究としています。重要な追加のデザインは、1 があります) すべての船は、液滴形成が起こる小さい容器店怪人 - それ以外の場合より負担のない流体出口を確保するために、ドレイン共通の貯蔵所2) バブル トラップ、気泡の取り出しを容易にする3) 窩の外側壁水平面の容器の並列処理だけでなく、最終的なファントムのスラブの高さ、長さ、および幅の正確な定義を確認するには4) 十分な忠実度でこのような機能を定義する私たちのプリンターのことができないのため、perforator 動脈成形用 21 G 注射針のシャンク (公称外径 820 μ m) の使用。全体のデザインのすべての機能を忠実に再現が観察されます。

現在のプロトコル...

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ディスカッション

プロトコルは、神経血管を可視化する PIV 研究を実行するための簡易法流生理関連寸法と流量条件体外のアウトラインを記載しました。そうすることで、はるかに大きい長さの考察スケール25またはより低い流れを必要とする非常に異なるコンテキスト内でが、ベクトル場の定量化を簡素化に集中しても他の人によって報告されたプロトコルを補完するために提供しています料金は26,27 (例えば、大気中または微小流れ), と現在のアプリケーションと互換性がないスキームに依存したがって。

PIV の実装を成功させるための最も重要な考慮事項は、フロー フィールドのアーティファクトの最小化と画質の最大化にあります。組織ファントムの作製プロセスにいくつかの手順は、これらの条件の両方に重要です。混合時、ポリジメチルシロキサン内流入する空気量が忠実度の機能と光学的透明度の両方に悪影響を与えることができます最終的なファントム...

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開示事項

著者申告するものがあります。

謝辞

著者らは、研究所とカリフォルニア大学リバーサイド校で経済発展から共同種の助成金によって提供されるこのプロジェクトの部分的なサポートを認めます。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
Solidworks 2015Dassault SystemsN/ACADソフトウェア&NBSP;
ダウコーニングシルガード184キットエルスワース接着剤184 SIL ELASTキット3.9KGPDMSキット
Stratasys寸法エリートStratasys9180-001053D
プリンターP430モデル材料カートリッジStratasys340-21202ABSビルド材料 
P400 SR可溶性サポート材料カートリッジStratasys340-30200サポート材料
CleanStation DT3PM3ベースバス
LindbergブルーM LGOボックス炉 Thermo ScientificLB305745Mオーブン
21G BD PrecisionGlide ニードルベトコン ディケンソンBD 305167分岐穿孔器 モールドセグメント
デシケーター(真空)Polylab55205デシケーター
ブランソン 1800 Utrasonic クリーニングブランソンCPX-952-116Rソニケーター
アセトンフィッシャーケミカルA9494アセトン
イソプロポールアルコールフィッシャーケミカルA4514イソプロポールアルコール
グリセロールフィッシャーケミカルGW33500グリセロール
10um ポリスチレン 黄緑色 蛍光粒子マグスフィアPSF-010UM蛍光ビーズ
ファントム ミロ ビジョンリサーチミロ M310ハイスピードカメラ
マイクロポンプコール・パーマー81101循環ポンプ
ライカ DM2000ライカ マイクロシステムズDM2000蛍光顕微鏡
ライカ 10X 対物レンズライカ マイクロシステムズ 506259穿孔器用対物レンズ
ライカ 2.5X 対物ライカ マイクロシステムズ11506083対物レンズ動脈瘤嚢
ライカブルーフィルターキューブ L5ライカマイクロシステムズ513840ブルーフィルターキューブ
ライカEL6000ライカマイクロシステムズ11504115光源
アルコノックスアルコノックス1104-1洗剤
ImageJNIHN/Aオープンソース画像解析ソフトウェア
> https://imagej.nih.gov/ij/ Particle Image VelocimetryPIVプラグインQingson TsengN / Ahttps://sites.google.com/site/qingzongtseng/piv
テクノロジー00-00300Rレンズ

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