(呼ばれる S1BF) 対応する体性感覚バレル フィールド皮質領域が正しく磁気共鳴イメージング (大胆な fMRI) 活性化、主要な血の酸素のレベルに応じた機能によるチェック後本研究の目的は乳酸含量を定量化するにはローカライズされたプロトン磁気共鳴分光法 (1H-MRS) 7 t によって活性化ラット脳における変動
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この記事について
サマリー
要約
核磁気共鳴 (NMR) 分光学は脳代謝物内容vivo で測定する機会を提供し、非侵襲的です。過去 10 年間と磁場の強さの増加技術発展のおかげで、良い解像度スペクトル体内ラット脳で得ることが可能です今。Neuroenergetics (すなわち、脳代謝の研究)、異なった細胞のタイプ間の特に、代謝相互作用は、近年ますます多くの関心を集めています。これらの代謝の相互作用の中でニューロンとアストロ サイトの間乳酸シャトルの存在は現在でも議論します。それは、したがって、脳の活性化とモニターの乳酸のラットモデルにおける機能的なプロトン磁気共鳴分光法 (1H-MRS) を実行する大きな関心の。ただし、メチル乳酸ピークは脂質共鳴ピークが重複し、定量化することは困難です。下記プロトコルができ代謝活性化脳領域で監視する変動を乳酸します。ひげ刺激による脳活性化が得られるし、 1H 夫人は血酸素レベル依存機能的磁気共鳴画像 (BOLD 法) を使用してその領域が検出された対応するアクティブ化されたバレル皮質で実行されます。すべての手順が完全に記述されている: 麻酔薬、コイル、および達成の磁石、およびデータ処理で直接効率的なひげ刺激に対するシーケンスの選択。
概要
脳は、両方の貢献と地域の脳活動の変化によって、その利用のための主要な基質 (すなわちブドウ糖)、規制をできる組み込みのメカニズムを所有しています。ブドウ糖は、脳の主要なエネルギー基質が、近年の実験は、アストロ サイトのプロデュース、その乳酸は、ニューロンの効率的なエネルギー基質をある可能性がありますを示しています。これはニューロンとアストロ サイトの1間乳酸シャトルの仮説を発生させます。グリア-ニューロン乳酸シャトル2ANLS、として知られている理論は非常にまだ討論されるが、血糖値が提案につながっている、アストロ サイト, それはどこに代謝される入力ニューロンに直接行くよりもむしろ乳酸が代謝物、効率的なエネルギー基質として使用ニューロンに移しました。機能的脳イメージング (陽電子放射断層撮影 [PET]) における基礎技術の理解と観察代謝変化を解読するためのいくつかの重要な結果にならないようなシャトルが生体内で存在する場合で脳の病態。
脳の代謝を研究して、特に、代謝相互作用ニューロンとアストロ サイト、4 つの主要技術、利用可能な (ないを含むマイクロ/ナノセンサー): 放射線写真法、ペット、2 光子蛍光共焦点顕微鏡、および夫人。オートラジオグラフィーによる最初の手法の一つであったし、放射性の14C 2-デオキシグル コース脳スライスにおける放射性18の地域の取り込みの画像体内ペット利回り中の地域集積の画像を提供しますF-デオキシグル コース。彼らの両方は低空間分解能画像を生産しながら薔薇の分子を使用しての欠点を持っています。2 光子顕微鏡、蛍光プローブの携帯の解像度を提供しますが、組織による光散乱イメージング深さ。これらの 3 つのテクニックは、ウィスカ刺激3,4,5,6中に齧歯動物で neuroenergetics を勉強する以前に使用されています。生体内で夫人と非放射性、非侵襲的であることの二重の利点があり、どんな脳の構造を調べることができます。また、夫人は、神経活性化、齧歯動物7で非常に最近開発された機能的な夫人 (fMRS) と呼ばれる技術の中に実行できます。そこで、脳代謝体内 1H-MRS は、および非侵襲的脳活動を監視するためのプロトコルを提案します。プロシージャは、7 T 磁気共鳴 (MR) 撮像素子内で直接実行空気パフひげ刺激によって得られる脳の活性化で健康なラットに記載されてが、遺伝子組み換え動物にだけでなく、あらゆる病態に適合させること.
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プロトコル
動物のすべてのプロシージャは、1986 年 11 月 24 日 (86/609/EEC) の欧州社会理事会指令の動物実験ガイドラインにしたがって運営しました。プロトコル フランス農水省森林の倫理的ガイドラインを満たしてし、ローカル倫理委員会によって承認された (Comité d 'éthique 注ぐ L' expérimentation Animale ボルドー n ° 50112090 A)。
注: 氏測定中に麻酔と生理学的モニタリング (体温、呼吸数) の適切なレベル、不可欠な要件です。
1. 動物
- 350 と 450 g の間の重量を量る Wistar ラットを使用します。
- 12:12 h: 明暗サイクルし食品を提供し、自由水のそれらを保ちます。
2. 麻酔
- 麻酔に必要な機器を準備 (図 1 a, B、材料表を参照してください): 生理食塩液 (240 μ g/kg/h、灌流率が 20 μ L/分) におけるメデトミジンを含む 5 mL シリンジ 0.5 mL シリンジ含むアチパメゾール (食塩液 0.5 mL で 20 μ) と眼軟膏。
注意: 氏の買収時磁場に近い麻酔のシリンジ ポンプの配置は, メデトミジンの入った 5 mL 注射以外、レンジフードの下ですべての機器。 - 誘導室でラットを配置、4% イソフルランを提供することにより、麻酔を開始し、1.5 L/分の酸素流量を調整します。
- 足反射の撤退を評価することにより、麻酔の深さを評価します。
- ラットが刺激に応答しないとき麻酔ボックスから取る、イソフルラン マスクの鼻とベンチの上に置きます、1.5 L/分で酸素の 2.5% を提供することで麻酔を維持します。
- そっと尾をマッサージし、止血帯 (図 1) を配置します。
メモ: 38 ~ 42 ° C、静脈の良い血管拡張を取得する温度のぬるま湯でマッサージを実行できます。 - 以前ヘパリン、左または右の尾静脈の末梢静脈カテーテル (22 G) を挿入します。静脈還流が観察されることに注意してください (血の滴が針の遠位部に表示される) とき、カテーテルが正しく挿入 (図 1)。
- 生理食塩液とヘパリンを含む 2 mL 注射器を使用してカテーテル デッド スペース容積に空気の泡を吹きます。
- 眼軟膏を適用し、実験の終わりにラットを目覚めさせるアチパメゾール (17 μ g/mL) の入った注射を準備します。
3. ラットひげ刺激に対する磁石の配置
- 磁石ベッド上呼吸センサーを設置し、マグネット ベッドにベンチからラットを転送します。胸部と磁石のベッドの間に呼吸センサーを用いたイソフルラン マスク鼻と腹臥位に配置します。
注: MRI の部屋に入るすべての機器は、MRI セーフをする必要があります。 - ラット配置中 (4% から 1.5%-2%) からイソフルランを減少し、この手順の終わりにメデトミジンに麻酔を切り替えます。右のひげが無料、ラットのひげの動きを可能にする MRI ベッドをあらかじめフロント右の端を切ったことを確認します。
- テープの位置にラットを押し、毎分 60 と 80 の呼吸の間にある必要があります、呼吸を監視します。
- 紙テープ (図 2) ですべて右のひげをトラップする帆を確認します。ラット MRI ベッドに沿って空気パフ システムの柔軟なアウトレット パイプ チューブの終了部分が垂直であるので、帆から約 1.5 cm の位置を合わせます。それを紙テープで固定します。
4. ひげ刺激に対する
- ソレノイド コントロール バルブ入力やソレノイド コントロール バルブの出力 (図 3) にアウトレット パイプに圧縮空気のソース (1 つの棒) から柔軟なインレット パイプを接続します。ソレノイド コントロール バルブが磁石の部屋の外にとどまることを確認します。
- 電磁弁と、トランジスタートランジ スター論理 (TTL) を使用してマグネットにパルス デバイスをプラグイン-ポート。構成、パルス周波数 = 8 Hz のパルス時間 = 20 s、および休憩時間 = 10 秒。
注: これらのパラメーターは、小型の液晶上で可視化 (LCD) 画面を表示、3 つの専用類推ポテンショメータは、調節可能な経由で。パラダイムを制御、電子のパルス デバイス (正しい後処理) の時間パラメーターでずれを避けるために高品質の電子部品で構成される必要があります。
5. BOLD 法取得
- ラットの脳に置き、それが直立位置と耳バーを使用して、それを維持します。ラットの頭部 (図 4 a) 上記ボリューム配列コイルを置き、テープを使用してそれを修正します。(前後の動き、回転なし、帆のない摩擦) に帆が正しく動いているかをチェック、空気パフ システムがオンに。その後、スイッチをオフにします。
- 磁石の中心にベッドとコイルを挿入します。ベッドは、磁石の内部空気パフ システム上; 一度、帆のまだ移動が正しくことを確認します。その後、スイッチをオフにします。メデトミジンにイソフルラン麻酔から完全に切り替える (灌流率: 20 μ L/分)。
- チェック ネズミはよくあるローカリゼーション シーケンスを使用して (TE = 2.5 ms;TR = 100 ms。平均 = 1;繰り返し = 1;スライス = 1 mm画像サイズ = 256 x 256;視野 (FOV) = 50 × 50 mm;スキャン時間 = 12 s 800 ms)。命令の名前にローカライザーシーケンス タブをドラッグし、[続行] をクリックします。
- 命令の名前、中心視野には脳の真ん中にT2_Star_FID_EPIシーケンス タブをドラッグし、編集したスキャン命令を開く調整プラットフォーム」タブをクリックします。B0地図を記録し、スキャン シムに進みます。
注: B0マップの次のパラメーターを使用: 最初のエコー時間 = 1.65 ms;TR = 20 ミリ秒、平均 = 1;反転角度 = 30 °;エコー間隔 = 3.805 ms;スライス = 58 mm画像サイズ = 64 x 64 x 64;FOV = 58 x 58 x 58 mmスキャン時間 = 1 m 24 スキャン シムの 920 のさんは、次のパラメーターを使用: ボクセル選択励起 = 蒸気ガウシアン パルス;テ = 5 ms。混合時間 = 10 ms。取得期間 = 204.8 ms;帯域幅 = 10,000 Hzドウェル時間 50 μ s を =)。 - T2 Star_FID_EPIシーケンスを開始 (TE = 16.096 ms;TR = 500 ms。平均 = 1;繰り返し = 600。スライス = 1 mm4 つの連続したスライス。画像サイズ = 128 x 128;FOV = 20 x 20 mm帯域幅 = 333,333.3 Hzスキャン時間 = 5 分 00 秒)。
注: TTL ポートによる外部トリガー信号がシステムを起動空気パフ同時に。パラダイム = [20 s 活性化 + 10 s 残り] 600 のスキャン、スキャンごとの 500 ms の総持続期間のための x 10。スライスがバレル フィールド領域の中央を中心に。 - 最初の 1 つと比較し、ラットが T2_Star_FID_EPI シーケンス中に移動するかどうかを確認する別のローカリゼーション シーケンス (5.3 1 つで説明されている手順と同じ) を取得します。
- 初期位置にベッドをもたらす、ボリュームのアレイ コイルを取り外して表面コイルを接続します。
6. 大胆な処理
- T2 Star_FID_EPI ファイルを開き、画像表示T2 Star_FID_EPI 画像を読み込みます。FunControllerと呼ばれる、機能のコント ローラーの起動時のウィンドウを開きます。
- この処理] タブで [機能イメージング ウィンドウ] と刺激プロトコル定義 (期間との交代/オフ期間、パラダイムに対応するを使用)。
- プロトコルのウィンドウ (600 のフレームを持つデータセット) を選択、 [期間] タブと、タブオフ期間反転属性タブをクリックで 20 の 40 の値を挿入し、選択する左にスライダーを刺激状態、値1。
- 前処理のウィンドウで面内メジアン フィルターの前処理と後処理のためのメディアン フィルター (2 D、3 D)をクリックします。
- [実行] タブをクリックして、オーバーレイ ルックアップ表を調整するカーソルをドラッグします。活性化された脳の領域 (図 4 b) を視覚化します。
7. プロトン MRS 買収
- 表面コイルを正しい位置、ラット頭部の位置を変更します。磁石の内部磁石中心で水平と位置しながら左のバレル皮質直上表面コイル (図 5 a) を置くことができるように (約 30 ° 時計回り) の頭を回転させます。
- 表面コイルを置いて、テープ (図 5 b) を用いたラット脳の修正、(前後の動き、回転なし、帆のない摩擦) に帆が正しく動いているかをチェック、空気パフ システムがオンに。その後、スイッチをオフにメイン スイッチで。
- 空気パフ システムがオンのとき、ベッドが磁石の中に帆が正しく動いていることを確認してください。その後、スイッチをオフにします。
- ラットはローカリゼーション シーケンスを使用して正しく配置されますを確認します。パラメーターを次のように設定: TE = 2.5 ms;TR = 100 ms。平均 = 1;繰り返し = 1;スライス = 1 mm画像サイズ = 256 x 256;FOV = 50 × 50 mm;スキャン時間 = 12 s 800 ms。
- 命令名ウィンドウにローカライザーシーケンス タブをドラッグし、スキャン プログラムを実行する続行] タブをクリックします。
- 脳定位が正しければ、命令名ウィンドウでT2_TurboRAREシーケンス タブをドラッグし、スキャン プログラムを実行する続行をクリックします。以前の大胆な fMRI の獲得とともに、これらの解剖学的画像は夫人の S1BF に、ボクセルの正しいローカライズになります。
注: T2_TurboRARE パラメーターが 14 スライス、スライス、FOV あたり 2 mm 2.5 × 2.5 cm、TE = = 100 ms、TR = 5,000 ミリ秒、マトリックス 128 x 128、シーケンス時間を = = 2 分 40 秒。 - S1BF エリアの中央にボクセル (高さ 2 mm、長さ 2.5 mm、深さ 3 mm) を配置、命令名ウィンドウにレーザーシーケンスのタブをドラッグします。
- T2 画像 (図 6) のゾーンをローカライズするのにラットの脳アトラスと BOLD 法強化を使用します。編集済みスキャン命令を開く調整「プラットフォーム」タブをクリックしてします。揺れるタブをクリックし、それを調整する少し受信コイルのインピー ダンス (電子負荷) を変更します。チューニングが完了する命令エディターを終了し、編集された命令に変更を適用する [適用] タブをクリックします。
- B0地図を記録し、シムをスキャンして、そして地元のシムを実行に進みます。
注: B0マップの次のパラメーターを使用: 最初のエコー時間 = 1.65 ms;TR = 20 ミリ秒、平均 = 1;反転角度 = 30 °;エコー間隔 = 3.805 ms;スライス = 58 mm画像サイズ = 64 x 64 x 64;FOV = 58 x 58 x 58 mmスキャン時間 = 1 m 24 スキャン インナーシム 920 のさんは、次のパラメーターを使用: ボクセル選択励起蒸気ガウシアン パルス;テ = 5 ms。混合時間 = 10 ms。取得期間 = 204.8 ms;帯域幅 = 10,000 Hzドウェル時間 50 μ s を =。地元のシムでは、次のパラメーターを使用して: 水の抑制、取得期間を蒸気 = 1,363.15 ms;ポイント = 4,096;Hz の帯域幅 = 3,004.81 Hzppm で帯域幅 = 10 ppm;ドウェル時間 = 166.40 μ s;スペクトル分解能 = 0.37 Hz/ポイント。レーザーのパラメーター: エコー時間 = 19.26 ms;TR = 2,500 ミリ秒;平均値 = 128 または 32;スキャン時間 = 5 分 20 秒または 1 分 20 秒。獲得ポイント = 4,096 です。 - 1H-MRS を実行します。
- 1休息期間中に最初の H 夫人買収を開始 (4 x 32 レーザー スキャン + 128 レーザー スキャン; 2,500 ミリ秒ごとスキャン)。
- 記録された最初のものと比較し、ラットがレーザー買収時に動かないことを確認する別のローカリゼーション シーケンス (5.3 1 つで説明されている手順と同じ) を取得します。
- ウィスカ活性化レーザー シーケンス中に1H-MRS を実行 (4 x 32 レーザー スキャン + 128 レーザー スキャン; 2,500 ミリ秒ごとスキャン)の空気パフ システム (パラダイム = 20 活性化と 10 の残りの s)。
- もう一度、ラットが移動するかどうかを確認するローカリゼーション シーケンスを実行します。
注: スキャンと休憩/有効期間数適応および変更できる、常にローカリゼーション シーケンスを定期的に行い、ラットが移動されていないことを確認します。
- 初期位置にベッドをもたらす、表面コイルを削除およびラットをベンチに戻る。アチパメゾールを麻酔を反転し、それを目覚めさせるネズミの背中の皮膚のひだに注入します。
8. プロトン MRS 処理
- LCModel ソフトウェアを開き、正しいデータ型 (自由誘導減衰ファイル) を選択し、右のファイルを選択する適切なタブをクリックします。これが完了したら、 [ok]タブをクリックします。
- 数量コントロール パラメーター ステップ バイ ステップを最適化します。
- [タイトル] セクションで、手動でタイトルを入力し、該当するフィールドに必要な値を手動で入力して十分な ppm の範囲 (例えば4.0 を 0.2 ppm) を定義します。
- 基本ファイルセクションで選択し、正しく高分子ベースラインに合わせて必要なファイルをダウンロード (ソフトウェアのプロバイダーによって提供されることができます)。
- 定義し、入力制御パラメーターをロードします。保存の準備すべての便利なファイルの種類を事前のプロセス (テーブル コンパクト テーブル。PS = 必要な PostScript 出力;CSV スプレッドシート; の形式を =座標プロットの座標を =)。LCModel 定量化を開始する、[ RunLCModel ] タブをクリックします。
- 統計を生成する選択した代謝産物を定義します。
注: LCModel 代謝物の定量を提供し、Cramér ラオの下界 (CRLB) と呼ばれる値によってエラーを予測します。値、CRLB と < 15 は最適な数量として考慮されます。CRLB 25 > は、信頼性の低い値を示します。
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結果
このプロトコルは、磁石で直接右ひげ刺激によって得られる脳賦活時の代謝変動の定量化できます。
本研究では大胆な fMRI の全体的な目標だったひげ刺激に対するだった効率的なアクティブな S1BF 領域を可視化して1H fMRS ボクセルを正しく検索することを確認します。ウィスカの活性化のために構築されたデバイスは効率的です。確かに、右のひげを自家製空気パフ システム、刺激されたとき肯定的な大胆な信号が体性感覚バレル フィールドの S1BF とも呼ばれます左バレル皮質 (図 4 b) の検出されました (n = 8)。背景のみが右半球で検出されたに対し、8 のうちラットの左のバレル皮質の肯定的な信号強調が検出されました。ひげ刺激に対するなし BOLD 法が実行されたときは、左または右 S1BF、信号強調認められなかった.
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ディスカッション
チトクロム酸化酵素染色9を使用して観察することができます 4 皮質層内の領域であり、主として記述されていたをされているので、その組織がよく知られているバレル皮質、体性感覚皮質またはバレル フィールドの S1BF とも呼ばれます10,11。1 つの vibrissa は、約 19,000 ニューロンが12列で編成されています 1 つのバレルに接続されます。ウイスカー-バレル皮質経路は、いくつかの利点を持っています。最初に、アクティブにする磁石内 MRI 対応空気パフ システム、(S1BF 領域の最も大きい部分にはボクセルの MRS が実行されるすべてのひげのサイズにおよそ対応することを確認する簡単に手作りすることができますを使用して内に圧迫され vibrissa の最大の刺激を可能にする帆)。第二に、右ウィスカ活性化左のバレル皮質の活性化につながるし、この脳領域の高感度表面コイルの使用を可能にする体性感覚野に位置します。第三に、...
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開示事項
著者が明らかに何もありません。
謝辞
この作品は、ANR 10 LABX 57 の参照およびフランス語-スイスの ANR FNS 付与参照 ANR-15-CE37-0012 LabEx トレイル グラントによって支えられました。著者はリアン Trotier の彼の技術的なサポートをありがちましょう。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 0.5 mL 注射器(針付き | Becton, Dickinson and Company, USA | 2020-10 | 0.33 mm (29 G) x 12.7 mm |
| 1H 分光法 表面コイル | ブルカー、エットリンゲン、ドイツ | T116344 | |
| 7T Bruker Biospec system | ブルカー、エットリンゲン、ドイツ | 70/20 USR | |
| Arduino Uno ベースのパルス装置 | カスタムメイド | ||
| アチパメゾール | Véトキノール、SA、フランス | V8335602 | アンチセダン、4.28 mg |
| 呼吸マスク | カスタムメイド | ||
| 眼軟膏 | TVM laboratoire、フランス | 40365 | オクリーゲル 10 g |
| インダクションチャンバー | カスタムメイド | 30x17x15 cm | |
| インレットフレキシブルパイプ | ガーデナ、ドイツ | 1348-20 | 直径 4.6 mm、長さ |
| 3mイソフルランポンプ、モデル100シリーズ気化器、クラシックT3 | Surgivet、ハーバード | WWV90TT | OH 43017、米国 |
| イソフルラン、吸入用液体 | Vertflurane、Virbac、フランス | QN01AB06 | 1000 mg / mL |
| KD科学シリンジポンプ | KD sientific、ホリストン、米国 | Legato 110 | |
| LCModelソフトウェア | LCModel Inc.、オンタリオ州、カナダ | 6.2 | |
| メデトミジン塩酸塩 | Vétoquinol, S.A., France | QN05CM91 Domitor, 1 mg/mL | |
| 絆創膏のマイクロポアロール | 3Mマイクロポア、ミネソタ州、米国 | MI912 | |
| マイクロポアロール | 、ミネソタ州、米国 | MI925 | |
| 生理学的パラメータのモニタリングシステム | SA Instruments, Inc, Stony Brook, NY, USA | モデル 1025 | |
| NaCl | フレゼニウス・カビ、ドイツ | B05XA03 | 0.9 % 250 mL |
| アウトレット フレキシブルパイプ | ガーデナ、ドイツ | 1348-20 | 直径 4.6 mm、長さ 4m |
| パラビジョン ソフトウェア | ブルカー、エットリンゲン、ドイツ | 6.0.1 | |
| 末梢静脈内カテーテル | テルモ、渋谷、東京、日本 | SP500930S | 22 G x 1", 0.85x25 mm, 35 mL/min |
| ラットヘッドコイル | ブルカー、エットリンゲン、ドイツ | ||
| ソディックヘパリン、注射液 | Choai、サノフィ、パリ、フランス | B01AB01 5000 IU/mL | |
| ソレノイド制御バルブ、プランジャーバルブ 2/2 ウェイ 直動式 | ブルケルト、ドイツ | 3099939 | モデル タイプ 6013 |
| テルモ 2 ml シリンジ | テルモ、渋谷、日本 | SY243 | 21 g x 5/8" 針 |
| テルモ 5 mL シリンジ | テルモ、渋谷、Tokyo, Japon | 05SE1 | |
| Wistar RJ-Han rats | Janvier Laboratories, France |
参考文献
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