3 D 文化として成長した神経幹細胞は神経膠腫の生物学を勉強するための強力なツールを構成します。パラフィン包埋による神経膠腫細胞の 3次元構造を維持しながら免疫を実行するプロトコルをご紹介します。このメソッドは、幹細胞性など神経分化神経膠腫 neurosphere 特性評価できます。
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方法論記事
パラフィン埋め込まれた 3 D 神経膠腫 Neurosphere 文化に免疫組織化学による神経膠腫におけるバイオ マーカーの評価
この記事について
サマリー
要約
神経膠腫におけるタンパク質発現の解析、その病理学の研究ではいくつかの側面に関連しています。多くの蛋白質は、バイオ マーカー、診断、予後、分類、腫瘍の進行の状態や細胞分化状態のアプリケーションとして記載されています。これらのバイオ マーカーの分析また神経膠腫患者および神経膠腫モデルから生成された腫瘍細胞 (NS) の特性評価に便利です。腫瘍の NS は、そこから派生し、ミラー神経膠腫の生物学をすることができますより正確に腫瘍のさまざまな機能を評価するために貴重な生体外モデルを提供します。腫瘍 NS のバイオ マーカーを分析する詳細な方法について述べるここ NS パラフィン埋め込まれた腫瘍の免疫組織染色 (IHC) を使用します。
概要
神経膠腫は、プライマリ1世界保健機関によると彼らの表現型と遺伝子型の特性によって分類される中枢神経系腫瘍です。この分類には、バイオ2の魅力的なソースを表すドライバー変異の有無が組み込まれています。バイオ マーカーは、生物学的特性、測定および薬理学的治療的介入3レスポンスと同様、正常および病的プロセスを示す評価することができます。バイオ マーカーを検出することができます腫瘍、神経膠腫由来細胞のさまざまな側面での生物学的特性を有効にします。神経膠腫のバイオ マーカーなどが変異イソクエン酸脱水素酵素 1 (IDH1) 変異体酵素より良い予後4に関連付けられている低学年の神経膠腫の特徴です。変異 IDH1 TP53 と α サラセミア ・精神遅滞症候群 X リンク (ATRX) との組み合わせで発現される-4,5サブタイプの特定神経膠腫を定義する変異を不活化します。ATRX 不活性化突然変異はまた小児の悪性グリオーマ2,6の 44% で発生し、積極的な腫瘍とゲノム不安定性6
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プロトコル
ここで説明するすべての方法は、制度的動物ケアおよび使用委員会 (IACUC) ミシガン大学によって承認されています。
1. 脳腫瘍神経幹細胞に由来するマウス モデルの生成
- 解剖手順の前に神経幹細胞メディアの準備 (NSC メディア: 1 x B27 サプリメント、1 つ x N2 の補足、1 x normocin、および 1 x 抗生物質/抗真菌遺伝子組換えヒト EGF や 20 ng/mL の濃度で basic FGF によって補足で DMEM/f12 キー)。NSC メディアの 300 μ L で 1.5 mL チューブを記入し、後でのために予約します。
- 大きい腫瘍を持つマウスを選択します。
注: プラスミッドまたはウイルス注入ルシフェリンをエンコードする場合、腫瘍のサイズは発光によって監視できます。大きな腫瘍は、> 106光子/s/cm2/sr の発光を持ちます。 - イソフルランの過剰摂取とマウスを安楽死させる: イソフルランとティッシュ ペーパーを注入し、炎症を防ぐためにマウスとの直接接触を避ける euthanization チャンバー内の組織をご紹介します。ペダル反射 (通常 5-10 分) を表示しない、マウスまで待ちます。マウスの首をはねるし、Calinescuらで説明するように、脳を解剖13
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結果
腫瘍の開発を監視および評価、腫瘍が NS を生成に必要なサイズに達した場合、生物発光を用いた腫瘍によって放出される発光を行った。これにより、(図 1Aと1 b) ホタルルシフェラーゼの発光信号で子犬と腫瘍の進行の伝達効率に関する研究。腫瘍の大きさは、1 x 107光子/s/cm 2/sr (図 1B) の信号を達すると、脳は NS 世代の処理ことができます。このシステムのもう一つの利点は、遺伝子配達および腫瘍の生成に使用されるプラスミドに異なる蛍光蛋白質のコーディング シーケンスを追加できることです。蛍光ランプ (図 1C) を搭載した解剖顕微鏡を使用して挿入された遺伝子の発現を確認するし。Wt IDH1 (
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ディスカッション
この記事で詳細に説明してパラフィン埋め込まれた神経膠腫、NS で免疫組織化学を実行する汎用性と再現性のある方法脳原で成長している腫瘍細胞の特性の 3 D 構造を維持します。この手法は、ガラスやプラスチック表面にメッキのセルを使用して次の利点を所有している: 私) NS; の 3 D 構造の保全ii) 蛋白質の表現の分析前に細胞解離のストレスの回避iii) 遺伝子組み換え腫瘍蛍光スペクトルの間で染色可能に NS から内因性蛍光式の焼入・ iv) 長期貯蔵。
この手法の重要なステップは、セルが再分散ゆくが、固まっていないようにアガロースで中断されたことを確認することです。この手法の 1 つの制限は、細胞培養と NS IHC プロシージャを汚す前に処理に関連する時間のかかる手順です。第 2 の制限は、このメソッドを実行するために必要な細胞数が多いです。セルの数はより小さい 1 x 10 の6セル、各セクションでフィールド ビューの NS クラスターあたりもほとんどのセルがありません。したがって、それは神経膠腫細胞培養の成長の遅い場合最適セル数に到達.......
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開示事項
著者が明らかに何もありません。
謝辞
この作品は、M.G.C.; に R21 NS091555 R01 NS074387 ・ ストローク (NIH/NINDS) 助成金 R37-NS094804 国立健康/国立研究所の神経疾患に支えられNIH/NINDS 付与 R01 NS076991、R01-NS082311、および R01 NS096756 P.R.L.;NIH/NINDS R01-EB022563;1UO1CA224160;脳神経科リアの M.G.C. と P.R.L.; 幸せな心RNA 生物医学助成金 F046166 M.G.C. F.M.M. にはサポートによって、F31 NIH/NINDS-F31NS103500。J. p. は、フルブライト アルゼンチン スポーツ省と教育フェローシップによって支持されました。
....アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| コーティングされたミクロトームブレード HP35 | Thermo Scientific | 3150734 | |
| ミクロトーム RM 2135 | ライカ | MR2135 | |
| ホルマリン溶液、中性緩衝、10% | Sigma-aldrich | HT501128-4L | |
| ウサギポリクローナル抗 ATRX、 | Santa Cruz Biotechnology | sc-15408 | IHC、1:250 希釈 |
| ウサギポリクローナル抗 Ki-67 | アブカム | Ab15580 | IHC、1:1000希釈ウサギ |
| ポリクローナル抗OLIG2 | ミリポア | AB9610 | IHC、1:500希釈ヤ |
| ギポリクローナル抗ウサギビオチン結合 | ダコ | E0432 | IHC、1:1000希釈ベ |
| クタステインエリートABC HRPキット | ベクターラボラトリーズ | 株式会社PK-6100 | |
| ベタゾイドDABクロモゲンキット | バイオケアメディカル | BDB2004 L /価格まで12/18 | |
| N-2 サプリメント | サーモフィッシャー | 17502048 | |
| N-27 サプリメント | サーモフィッシャー | A3582801 | |
| アキュターゼ®細胞剥離液 | バイオレジェンド | 423201 | |
| アガロース LE | ゴールドバイオ | A-201-1000 | |
| ジェネシー社 | オリンパス 15 ml | 21-103 | |
| ネシー社 | TC-75 処理フラスコ | 25-209 | |
| ジェネシー社 | TC-25 処理フラスコ | 25-207 | |
| DMEM/F12 | ギブコ | 11330-057 | NSメディア |
| HBSS | GibcoTM | 14175-103 | 平衡塩溶液 |
| C57BL / 6 | コニック | B6-f | C57BL / 6マウス |
参考文献
- Louis, D. N., et al. The 2016 World Health Organization Classification of Tumors of the Central Nervous System: a summary. Acta Neuropatholica. 131 (6), 803-820 (2016).
- Hochberg, F. H., et al.
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再版と許可
