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方法論記事

移行, 侵略, と不死化妊娠初期絨毛細胞の増殖を評価する生体外の試金

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DOI：

10.3791/58942

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2019年3月5日

 ,  ,  , 
1Department of Obstetrics, Gynecology and Reproductive Sciences, Yale School of Medicine

この記事について

サマリー

ここでは、3 つの生体外の試金を使用して絨毛細胞における細胞運動を評価するため非常にアクセス プロトコルを提案: スクラッチ アッセイ、transwell 浸潤アッセイと細胞増殖アッセイ。

要約

細胞運動は胎盤発育、妊娠初期に絨毛トロホブ ラストの重要なプロパティです。適切な栄養の移行と侵略の意義が母体の血管の不十分な栄養膜浸潤と関連付けられる子癇前症と子宮内の成長の制限など妊娠障害によって実証します。残念ながら、メカニズムの理解、胎盤を移行するから開発されるトロホブは制限。スクラッチのアッセイによる細胞遊走の in vitro 解析は、絨毛渡り鳥容量を規制する要因を識別するに便利なツールです。ただし、本法だけでは変えられた細胞の移動につながる携帯電話の変更を定義しません。このプロトコルは、まとめて使用して絨毛細胞運動を評価する 3 つの異なる体外の試金を記述する: スクラッチ アッセイ、浸潤能の測定と拡散の試金。ここで説明されているプロトコルは、刺激に応じて細胞運動を定量化する他の細胞で使用するため修正されるかもしれません。これらのメソッドは、細胞運動に貢献し、潜在的なメカニズムで細胞変化の徹底的な検査を提供する個々 の要因を識別するために研究者を許可します。

概要

胎盤発育、妊娠、母体と胎児の健康に影響を与えるの確立の重要なステップです。ただし、このプロセスが発生するメカニズムの基礎は完全には理解されていません。細胞遊走は妊娠成立と胎盤の機能に貢献する重要な生物学的プロセスです。胚盤胞移植後, 栄養外胚葉は絨毛トロホブ、絨毛膜絨毛の表面をカバーし、ガスと栄養の交換に関与していると絨毛から移行を外トロホブ (EVTs) に区別します。母体の脱落膜と血管系1に侵入します。EVTs の移行は母体らせん動脈を改造して胎児の成長2をサポートする子宮循環を確立するために不可欠です。妊娠中に不十分な栄養膜浸潤異常胎盤の発育結果し、子癇前症、妊娠高血圧症候群や子宮内の成長の制限、早産3などの妊娠合併症に貢献するかもしれない 4。したがって、絨毛運動に影響を与える要因を理解することは、通常胎盤に必要な経路を決定するのに不可欠です。

胎盤絨毛細胞の移行は、細胞、成長因子、サイトカイン、ホルモン、血管新生因子5などの複雑なネットワークによって制御されます。体内の胎盤を勉強の制限のための in vitro アッセイを利用したラインは絨毛運動に寄与する要因を特定することが重要されている絨毛細胞を不死化。傷や浸潤アッセイは、絨毛細胞移行6,7、8に個々 の分子の役割を定量的に評価するため広く使用されています。ただし、タンデム移行の変化を細胞侵襲性の変更によって引き起こされるかもしれない方法を調査するために便利ですが、これらの 2 つの試金は細胞遊走の変更の率に貢献するかもしれない追加のメカニズムを説明しません。たとえば、移行に利用できるより少ないセル細胞増殖率を削減可能性があります。

ここでは、スクラッチ、細胞増殖、細胞浸潤アッセイを使用して栄養移行を評価するための定量体外法について述べる。スクラッチのアッセイで制服傷は単層の細胞で作成され細胞のギャップを埋めるための移動は、創傷サイズの自動、タイムラプス イメージングと創内の細胞の密度で測定します。セル拡散の試金はセルの既知の開始量と比較して各時点でのセルの比率の計算に基づいています。細胞浸潤アッセイの細胞が細胞外マトリックス コート細胞培養挿入室 (例えば Transwell) 上にシードし、化学誘引物質への応答における細胞外マトリックスを介して侵入する細胞数がカウントされます。

スクラッチのアッセイは、細胞の移動に影響を与えるどのように異なる環境条件を決定するために使用可能性がありますシンプルで効果的なツールです。増殖と浸潤アッセイは、続いて細胞増殖と細胞移動の全体的な変化に侵襲性の寄与を決定する使用されるかもしれない。総称して、これらの試金は細胞の運動性に貢献するかもしれない生物的プロセスの堅牢な測定を提供します。2 つの不死化妊娠初期絨毛細胞ラインは説明アッセイ、Swan.71 (Sw.71)、HTR-8/SVneo9,10で使用されました。ただし、これらの試金はキー変調器の細胞の遊走・浸潤を識別する他の細胞型での使用にも最適化可能性があります。

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プロトコル

1. セル準備

  1. 湿度 95%、5% CO2、37 ° C で標準的な成長媒体に T-75 フラスコ細胞を維持します。
    注:これらの実験で使用される細胞が不死妊娠初期絨毛細胞線 Swan.71 (Sw.71) と HTR-8/SVneo9,10。DMEM/F - 12 10% 熱不活化ウシ胎児血清 (FBS)、ピルビン酸ナトリウム 1.0 mM、10 mM HEPES、0.10 mM MEM 非必須アミノ酸、100 単位/ml ペニシリン、100 μ g/mL ストレプトマイシンを添加した Sw.71 細胞が維持されました。HTR-8/SVneo 細胞が 5% 添加 RPMI 1640 年に維持された熱は、FBS を不活化します。
  2. 90-100% の合流点に到達するまでをレプリケートするセルを許可します。無菌培養流フードを使用すると、10 ml の滅菌 1 リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) x のフラスコと洗浄の細胞からメディアを吸い出しなさい。
  3. PBS の吸引し、1 x (0.05%) 5 mL を追加トリプシン-EDTA をフラスコに加えて、細胞がトリプシンによって覆われていることを確かめます。すべての細胞がフラスコ (約 5-10 分) の下から取り外すまで湿度 95%、5% CO2、37 ° C で維持研究所インキュベーターにフラスコを配置します。
  4. トリプシン-EDTA を非アクティブ化するフラスコに予め温めておいた成長媒体の 10 mL を追加します。

2. スクラッチ試験

  1. 手順 1.4、48 h で 100% 合流点を達成するために 24 ウェル プレートにセルの適切な数の種子を次します。
    注:さまざまな異なるプレート レイアウトとスクラッチの分析を実行することが可能です。傷メーカー ツールで許可井戸の最大数は、96 ウェル形式です。
  2. 次の日 (スクラッチ試験前日)、メディア フェノールレッド無料のメディアに変更、必要に応じて補足熱不活化、炭のデキストラン剥奪の FBS を含みます。
    注:他の研究は、低濃度 (1% など) の FBS とメディアの使用を推奨しています。このプロトコル11での代替として使用することができます細胞増殖を抑える。
  3. スクラッチのアッセイの日、各ウェル内のメディアに必要な治療を追加して 30 分のための細胞を前処理します。輪郭を描かれた実験利用車両 (1 x PBS) と 100 nM デキサメタゾン 1x PBS で希釈しました。
  4. 制服の傷を作成するには、傷のメーカー ツールのピンに滅菌 10 μ L ピペット チップを置きます。井戸の最初の行にヒントを下げ、ピペット チップ井戸の反対側に達するまで傷メーカーのトラックに沿って板を移動します。
    1. プレートを継続的に井戸の直径方向傷定数を確保するためプレートの底に接触するピペット チップをできるように開始位置に移動します。削除し滅菌 10 μ L ピペット チップを交換して、井戸の次の行に、ヒントを下ろします。
  5. 手順 2.4 を繰り返してすべての井戸の傷についています。
    注:傷メーカー ツールを使用できない場合は、手動で 10 μ L ピペット チップと井戸の中心を削って傷を作成できます。
  6. メディアを慎重に吸引し、1x PBS で 2 回細胞を優しく洗ってください。次の最終的な洗浄補われたフェノール レッド無料、ストリップまたは所望の治療または (で 2.3 の手順の指示) の車両と低 FBS メディアを追加します。
    注:1x PBS で洗浄をデタッチするセルの原因となりますので、HTR-8/SVneo 細胞を洗浄する補われたフェノール レッド メディアする必要があります。
  7. 自動化された傷井戸を含む 24 ウェル プレートを置き、コマ撮像素子 (材料表参照) 湿度 95%、5% CO2、37 ° C で維持研究所インキュベーターに収容されています。画像は、セル創傷治癒 (例えば、すべて 2 h 72 h) を完了するように必要に応じて定期的に井戸します。
  8. 自動、コマ撮像素子に関連付けられているソフトウェアによって傷の密度と幅を計算 (材料の表を参照してください)。開始の傷のサイズを基準にして創傷サイズの変化率を計算するため、100% に等しい 0 時傷幅を設定してください。時間 0 で傷のサイズによって各後続の timepoint で傷のサイズを分割し、100 倍率 (図 1) を取得します。

3. 浸潤能の測定

  1. 次の手順 1.4、6 ウェル プレート 90 %48 h. で合流し 37 ° C、5% CO295% の湿度設定研究所インキュベーターで維持する細胞に到達する細胞を許可するセルの適切な数の種子。
  2. 次の日は、フェノールレッド無料メディアに、必要に応じて補足熱不活化、炭のデキストラン剥奪の FBS を含むメディアを変更します。
    注:セルは、実験的なデザインによってこの時点で前処理することができます。
  3. この時、10 mg/mL の細胞外マトリックスのバイアルを配置 (材料の表を参照) で、氷や冷蔵庫で一晩解凍しましょう。
  4. 次の日、前クールな浸潤アッセイ供給 24 ウェル プレートを配置することによって、細胞培養挿入、遠心チューブ ・ ピペット チップ細胞外マトリックスを操作する前に、少なくとも 2 時間冷蔵庫 (4 ° C) で。
  5. ティッシュ文化フードの冷蔵装置を使用して、10 mg/mL の細胞外マトリックスを最終濃度 5 mg/mL のフェノール レッド フリー、血清フリー メディアで 1:1 希釈します。
    注:常に在庫と氷に希釈した細胞外マトリックス。メディアに細胞外マトリックスの比率は、試金で使用される細胞ラインのプロパティに基づいて調整できます。
  6. ティッシュ文化フードの冷蔵装置を使用して、24 ウェル プレートに配置されている (表の材料を参照) の挿入に希釈した細胞外マトリックスの 100 μ L を追加します。マトリックスは任意の気泡のないレベルであることを確認します。24 ウェル プレートを含むマトリックス コートの場所を強化するマトリックスを許可する 37 ° C でインキュベーターで挿入します。
  7. 浸潤アッセイ用細胞を準備、1 ml の 1x PBS のセルを洗浄、吸引、PBS、各ウェルに 1 x トリプシン-EDTA を 500 μ l 添加を追加します。すべてのセルが、プレートの下から取り外すまで湿度 95%、5% CO2、37 ° C で維持研究所インキュベーターで 6 ウェル プレートを配置します。
  8. 一度セルをデタッチ、trypsinized 細胞の各ウェルにフェノール レッド フリー、血清フリー メディアの 500 μ L を追加します。
  9. 微量遠心チューブとスピン ・ ダウン 4 ° C で 400 × gで 5 分間に剥離細胞の 1,000 μ L を転送します。
  10. メディアを吸引し、フェノール レッド フリー、血清フリー メディアの細胞を再懸濁します (ボリューム、細胞の濃度によって決まります)。自動セルのセルを数える (材料の表を参照) をカウンターし、細胞懸濁液 1 mL あたり 5 x 10 の5セルの最終的な集中のための音量を調整します。
    注:検定と顕微鏡を使用もセルをカウントする可能性があります。
  11. 浸潤能の測定に使用される 24 ウェル プレートの井戸に完全な成長媒体の 600 μ L を追加します。
    注:追加走化性因子や治療法は、井戸 (下院) の完全な成長媒体に追加可能性があります。アウトラインの実験車両 (1 x PBS) や下院に 1x PBS で希釈した 100 nM デキサメタゾンを追加しました。
  12. 場所、塗装は浸潤アッセイに使用する完全な成長媒体を含んでいる各ウェルに挿入します。200 μ L の 1 x 10 の5セルの合計はそれぞれのプレコート セル挿入 (上院) の上にセルを追加します。
    注:この試金のための否定的なコントロールとして (セル) のないフェノール レッド フリー、血清フリー メディアの等量は参院に追加できます。
  13. 24 h の湿度 95%、5% CO2、37 ° C で維持研究所インキュベーターで 24 ウェル プレートを配置します。
    注:不死化妊娠初期絨毛細胞の 24 時間の潜伏期間は最適化され、さらにテストを他の細胞に必要な潜伏期間を決定する必要があります。
  14. 一晩インキュベート後、細胞外マトリックスを乱すことがなく上下チャンバーから残りのメディアを吸引します。その後、慎重に細胞外マトリックスを削除するに必要な回数だけ拭き取り綿棒挿入の上の部分から細胞外マトリックスと細胞の非侵略を取り外します。
  15. 各洗浄は、井戸の上部と下部室に PBS を追加、1 × pbs 3 x を挿入します。各洗浄した後、PBS を吸い出しなさい。
  16. セルの挿入に 4 ° C で 30 分間 100% 氷冷メタノール中にインサートを配置することによって接続を修復します。最終洗浄後、洗浄は 1 × PBS と削除 PBS で 3 x を挿入します。20% エタノールで 0.2% クリスタル ・ バイオレットと 10 分のため挿入に接続されている細胞を染色します。
  17. 脱イオン水で 3 x を洗浄し、最終的な洗浄後の脱イオン水を吸い出しなさい。
  18. 室温で 1 時間風乾を挿入します。鉗子とカミソリの刃を使用して、挿入の下の膜を慎重にカットし、下面にしてスライド ガラスにマウントします。、室温で乾燥するメディアをマウントを許可します。
  19. 20 × 対物を光学顕微鏡を使用するサンプルごとの侵略セルの少なくとも 4 のユニークな画像を取得します。各画像内のセルの合計数をカウントし、サンプルを制御し、データ (図 2) をプロットするセルの数を正規化します。

4. 拡散の試金

  1. 次の手順 1.4、自動化された細胞カウンターを使用してフラスコから細胞をトリプシンをカウントし、標準的な成長媒体によくあたり 2 × 105セルの密度で 6 ウェル プレートにシードします。
  2. 37 ° C、5% CO2、湿度 95 %4 h または細胞が付着するまで維持研究所インキュベーターにセルを配置します。
  3. フェノール レッドに変更メディアは、空きメディア、必要に応じて補足熱不活化、炭のデキストラン剥奪の FBS を含むと所望の治療を追加します。アウトラインの実験車両 (1 x PBS) または 1x PBS で希釈した 100 nM デキサメタゾンを追加しました。湿度 95%、5% CO2、37 ° C で維持研究所インキュベーターで 6 ウェル プレートを配置します。
  4. メディアを削除し、新しいメディアと治療すべて 48 h を置き換えます。
  5. 24、48、72 h 治療以降後 1 ml の 1x PBS のセルを洗浄し、トリプシン-EDTA の 500 μ L を各ウェルに追加します。セルがプレートから戸建まで、インキュベーターで 6 ウェル プレートを配置します。
  6. 細胞をプレートからデタッチ、補われたトリプシンを非アクティブ化する - フェノールレッド フリー メディアの 500 μ L を追加します。
  7. 別々 のチューブでトリパン ブルーの 5 μ L に細胞をトリプシンの 5 μ L を追加し、ピペッティングで混ぜます。
  8. 自動化された細胞カウンターを使用して重複の各ウェルからセルをカウントします。
  9. (図 3) の時間の関数としてプロットの各時点とウェルあたりの細胞数を平均します。

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結果

不死化妊娠初期絨毛細胞株 Sw.71 および HTR-8/SVneo は、絨毛細胞移行12グルココルチコイドのロールを確認するこれらの実験で使用されました。グルココルチコイドは、彼ら最近示されている絨毛の機能を変更する代替治療に使用される12の場合がありますので、これらの実験で使用されました。両方の細胞が車両 (1 x PBS) または 100 と扱われたすべての実験のため合成糖質コルチコイド製剤デキサメタゾン (Dex) の nM。巻きの密度とサイズは、自動、タイムラプス イメージング システムを使用して 72 時間ごとの 2 h を測定しました。画像と異なる縦長でスクラッチの分析から得られた結果の例を図 1に示します。両方の処置のための 0、8、18 h の縦長サンプル画像 (図 1 a) を提供されています。傷密度と傷の大きさはサンプル車両制御 (Veh...

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ディスカッション

この手順は、絨毛細胞運動の計測違いに潜在的な貢献者として細胞増殖率を含めるアッセイ移行および侵略の使用に基づいています。一緒に使用すると、これらの生体外の試金は、絨毛の移行を調節する細胞の経路を識別するために使用することができますシンプルで効果的な方法です。前述のように、栄養膜細胞は、ホルモン、サイトカイン、成長因子、または絨毛運動に与える影響を決定する他の分子と扱われるかもしれません。また、絨毛運動の機能的役割を解明するための細胞から、ターゲット蛋白質が消耗されています。絨毛移行のキー変調器を識別する基になる妊娠合併症など妊娠中毒症、子宮内胎児発育制限と早産、胎盤の欠陥に関連する基本的なメカニズムの理解があります。

このプロトコルの正確な結果を取得するために必要ないくつかの重要なステップがあります。フェノール レッドは細胞培養媒体13で使用される濃度でエストロゲン様作用があるため細胞におけるエストロゲン受容体の好ましくない活性化を防ぐために実験的エンドポイントを用フェノールレッド無料メディアが重要です。Transwell 浸潤能の測...

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開示事項

著者が明らかに何もありません。

謝辞

著者は、博士 Gil Mor が Sw.71 細胞を提供することをありがちましょう。この研究は、南西にアルバート McKern 学者賞によって支えられました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
0.4% トリパン ブルー ステインサーモフィッシャー サイエンティフィック15250-061
0.5% トリプシン-EDTAライフ テクノロジーズ 15400-054
1.0 M HEPESAmericanBioAB06021-00100
10 mM MEM 非必須アミノ酸ライフ テクノロジー11140-050
100 mM ピルビン酸ナトリウムライフ テクノロジーズ 11360-070
24ウェルプレートトランズウェルインサートコーニング3422カーボネートフィルターを8 μm孔径
チャコール デキストランストリッピング FBSジェミニバイオプロダクツ100-119
Countess II 自動セルカウンターサーモフィッシャーサイエンティフィックAMQAX1000
クリスタルバイオレットシグマ アルドリッチC0775
サイトシール 60サーモフィッシャーサイエンティフィック8310-4
デキサメタゾン(Dex; 1, 4-プレグナジエン-9&α;-フルオロ-16&α;-メチル-11&β;, 17, 21-トリオール-3, 20-ジオン; ≥98% TLC)ステラロイドP0500-000
DMEM/ハム's F12Life Technologies11330-032
ウシ胎児血清Sigma AldrichF2442
IncuCyte 24ウェルImageLockプレートEssen BioScience4365IncuCyte Zoomイメージングシステムを使用する場合は、IncuCyte ImageLockプレートに細胞を播種します。これらのプレートには、プレートの底面に基準マーカーがあり、一定の視野で繰り返しイメージングするための基準として使用されます。
IncuCyteソフトウェアEssen BioScience2010A Rev2
IncuCyte ZOOMシステムEssen BioScienceN/AScratch assay Imaging は、プリセット「傷の傷」IncuCyte ZOOMシステムのパラメーター。他のタイムラプス顕微鏡も使用できます。
マトリゲル膜マトリックスベクトン・ディキンソン356231成長因子の低減、フェノールレッドフリー
マイクロスライドVWR International, LLC48311-7003
顕微鏡カバーガラスフィッシャーサイエンティフィック12-545-E
オリンパス IX71 倒立顕微鏡オリンIX71
ペニシリン (10,000 units/mL)/ストレプトマイシン (10,000 µg/mL)Life Technologies151-40-122
フェノールレッドフリー DMEM/Ham's F12Life Technologies11039-021
半自動創傷メーカーツールEssen BioScienceN/A
ズ ポリパス

参考文献

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