方法論記事

マイクロアレイを用いてがん細胞型に及ぼす微小環境への影響を調知る

DOI：

10.3791/58957

⸱

2019年5月21日

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1Department of Biomedical Engineering, Knight Cancer Institute, Oregon Health and Science University, 2Quantitative Imaging Systems LLC

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ここで提示される方法の目的は、マイクロ環境マイクロアレイ(MEMA)を作製し、培養細胞の表現型に対する何千もの単純な組み合わせ微小環境の影響を調べるために使用する方法を示すことです。

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

細胞の表現型に対する微小環境の影響を理解することは、生体内の微小環境における可溶性成長因子とマトリックス関連タンパク質の両方の複雑な混合物による困難な問題である。さらに、インビトロでの微小環境のモデリングに容易に利用可能な試薬は、通常、不完全に定義され、バッチからバッチの変動に苦しむタンパク質の複雑な混合物を利用します。マイクロ環境マイクロアレイ(MEMA)プラットフォームは、単一のアッセイにおける細胞表現型への影響について、マイクロ環境タンパク質の数千もの単純な組み合わせの評価を可能にします。MEMAはウェルプレートで調製され、個々のリガンドをアレイされた細胞外マトリックス(ECM)タンパク質を含むウェルを分離することができます。各印刷されたECMとの可溶性リガンドの組み合わせは、ユニークな組み合わせを形成します。典型的なMEMAアッセイには、細胞が単一のアッセイでさらされている2,500を超えるユニークな組み合わせ微小環境が含まれています。試験ケースとして、乳癌細胞株MCF7をMEMAプラットフォーム上でメッキした。このアッセイの分析は、これらの細胞の増殖および増殖を増強および阻害する因子を同定した。MEMAのプラットホームは非常に適用範囲が広く、癌の研究を超えて他の生物学的質問と使用するために拡張することができる。

概要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

2次元(2D)単層におけるプラスチック上の癌細胞株の培養は、がん研究者にとって依然として主要な主力の1つである。しかし、微小環境は、細胞の型示しに影響を与える能力のためにますます認識されています。癌において、腫瘍微小環境は、成長、生存、侵侵入、および治療1、2への応答を含む複数の細胞行動に影響を与える知られている。従来の単層細胞培養は、通常、微小環境の影響を欠き、市販の精製基膜抽出物を含む細胞を成長させるより複雑な3次元(3D)アッセイの開発につながっている。しかし、これらの精製行列は、通常、使用が複雑であり、バッチ変動3や複雑な組成3などの技術的な問題に苦しむ。その結果、細胞表現型3に影響を与える可能性のある特定のタンパク質に機能を割り当てるのは困難な場合があります。

これらの限界に対処するため、微小環境マイクロアレイ(MEMA)技術を開発し、微小環境を細胞外マトリックス(ECM)と可溶性成長因子タンパク質の単純な組み合わせにまで削減する4,5.MEMAプラットフォームは、細胞の挙動に影響を与える主要な微小環境因子の同定を可能にします。配列形式を使用することで、何千もの微小環境因子の組み合わせを1回の実験でアッセイすることができます。ここで説明するMEMAは、約2,500の異なるユニークな微小環境条件を尋問する。ウェルプレートに印刷されたECMタンパク質は、細胞を培養できる成長パッドを形成します。可溶性リガンドは個々のウェルに添加され、細胞が露出する各異なるスポットにユニークな組み合わせ微小環境(ECM +リガンド)を作成します。細胞は数日間培養され、次いで固定され、染色され、これらの特定の微小環境の組み合わせへの曝露の結果として細胞表現型を評価するために画像化される。微小環境は単純な組み合わせであるため、細胞の主要な現象的変化を駆動するタンパク質を特定するのは簡単です。MEMAは、細胞の運命決定と治療4、5、6、7への応答を駆動するものを含む、複数の細胞表現型に影響を与える因子を同定するために正常に使用されている。これらの応答は、単純な2D実験で検証することができ、腫瘍微小環境の複雑さをより完全に要約する条件下で評価することができます。MEMAプラットフォームは、良好なプノチピックバイオマーカーが利用可能である場合、様々な細胞タイプおよびエンドポイントに非常に適応可能です。

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プロトコル

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注:MEMA プロセス全体の概要 (推定時間を含む) は、図 1に示すフロー図に概説されています。このプロトコルは、8ウェルプレートにおけるMEMAの製造について詳しく述べています。プロトコルは、他のプレートまたはスライドに適合してもよい。

1. タンパク質、希釈剤、染色バッファーの調製

  1. EPM、リガンド、サイトカインのバイアルを室温(RT)と短時間遠心分離機に平衡化します。製品データシートに示されているように、適切なRTバッファの適切なボリュームを追加します。在庫濃度に関するメーカーの推奨事項に従ってください。
    注:リガンドとEPMの在庫と最終濃度の完全なリストは、表1および表2に記載されています。リガンドとEPMの両方は、通常、標準的な2日間培養アッセイで生物学的効果を引き出す製造業者が推奨する範囲の最高濃度で使用されます。汚染を避けるために層流の下で穏やかに、バイオセーフティキャビネットでタンパク質を扱う。
  2. RTで1時間の穏やかな揺れでバイアルをインキュベートします。これは、変性を引き起こす可能性がありますので、渦タンパク質をしないでください。
  3. アリコートタンパク質は長期保存のため、すべてのアリコートは、繰り返し凍結/解凍サイクルで分解を避けるためにのみ単一の使用です。凍結乾燥タンパク質は、必要になるまで-80 °C(特に指定がない限り)に保管してください。(i) タンパク質名、(ii) 準備日、(iii)ロット/バッチ番号、(iv)サプライヤー、(v)カタログ番号、(vi)濃度、(vii)容積、(viii)調製機など、将来の参照のためにすべてのメタデータを収集するように注意してください。
  4. 20%(v/v)グリセロール、10mM EDTA、200mMトリス-HCl、pH 7.2を含む希釈剤バッファーを調製し、濾過殺します。このバッファを無菌に保ち、RTに保存してください。
  5. リン酸緩衝生理食液(PBS)に2%(w/v)BSA、1mM MgCl 2、および0.02%NaN3を含む染色バッファーを調製する。フィルターを取り、4 °Cで保存します。

2. ECMソースプレートの調製

  1. 印刷するECMタンパク質のアリクォートストックを取り除き、氷上で解凍します。メタデータ追跡用のすべてのロット番号を記録します。
  2. 解凍されたタンパク質のチューブを穏やかにフリックして、適切なリサスペンションを確保し、遠心分離機でスピンダウンします。
  3. 無作為化された384ウェルソースプレートを作成する液体処理ロボットで使用するECMプリント混合物(EPM)と蛍光線を作ります。
    注:384ウェルソースプレートは、タッチピンアレイプリンタで使用され、8ウェルプレートで印刷されたアレイを作成します。
    1. 各EPMおよび受託者のためのラベル1.5 mLマイクロセントリフュージチューブ。
    2. 125 μL の希釈バッファー (ステップ 1.4 を参照) を適切な体積の ECM ストックと組み合わせて各 EPM を準備し、PBS で合計 250 μL の総体積まで混合物を持ち込みます。各EPMチューブの最終濃度は、1x ECMタンパク質、5 mM EDTA、10%グリセロール、および100mMトリスになります。
    3. 蛍光繊維を製造元が指定した適切なバッファーに溶解して調作し、250 μLを標識された受託チューブに移します。

3. 液体ハンドラを用したソースプレートの作成

  1. EPM の位置をランダム化し、使用するアレイ プリンタ ピン ヘッド用に最適化された 384 ウェル プレート レイアウトを設計します。各ウェルの行 1、列 1 の位置に印刷するように、fiducial の配置を設計し、配列の向きを支援します。
    注:堅牢なデータを確保するために、各 ECM の合計 14-15 レプリケートが使用されます。結合の均一性の評価のための堅牢な添付ファイルをもたらすコラーゲンまたは別のECMの追加の複製を含めます。対象の EEC の数に応じて、レイアウトで複数の 384 ウェル プレートを使用する必要がある場合があります。
  2. EPMチューブを液体ハンドラに移し、冷却されたチューブラックでチューブを4°Cに保つか、コールドルームにある液体取り扱いロボットを使用します。
  3. 液体ハンドラのソフトウェアを使用して、各EPMの15 μLを転送するプログラムを実行し、384ウェルソースプレート内の事前指定ウェルにフィデューシャルを転送します。
  4. ピペットPBSは、印刷プロセス中に湿度を高め、乾燥から保護するために、任意の未使用の井戸にピペットPBS。
    注:4 x 7 ピン ヘッド用に最適化され、コラーゲン I ブロックと PBS を含む 384 ウェル ソース プレート セットの例については、図 2を参照してください。
  5. シールプレートを、印刷する準備ができるまで4°Cに保ちます。

4. アレイ印刷ロボットを用いたMEMの印刷

注:プロトコルの次の部分は、MCF7細胞の増殖および増殖に対する異なる微小環境タンパク質の影響を調査するためのMEMAの調製および使用について具体的に説明する。しかし、プロトコルは、異なるリガンド、EEC、および細胞を使用して、他の細胞株および目的のエンドポイントを研究するように容易に適応させることができる。

  1. タッチピンプリンタを使用して、EPMとフィデューシャルスポットを8つのウェルプレートに印刷します。再現性を確保するために、各 ECM 条件の複数の反復を印刷します。
    注:    他のプレートフォーマットやスライドは印刷に使用できますが、最適なスポット形成を達成するためにバッファの最適化が必要になる場合があります。
    1. 4 x 7 プリント ヘッド構成に配置された 350 μm の直径ピンを使用して、MEMA の ECM を印刷します。8ウェルプレートの配列を20列35列で印刷し、合計で約700個のスポットを印刷します。より大きい配列はこれらの版で可能であるが、細胞結合および染色の両方の増加した端効果のトレードオフと来る。
  2. 印刷後は、使用の3日前までにデシケータにプレートを保管してください。

5. リガンド処理プレートの作成

  1. 関心のあるリガンドを含む96ウェルプレートレイアウトを設計します。一度に多くのMEMAプレートの処理を容易にするために、8ウェルMEMAと96ウェルプレートの間で液体を転送するために4つの間隔の先端を持つマルチチャンネルピペを使用することを可能にする間隔でこのプレートを設計します。
    注:このプロトコルでは、表2に記載されているリガンドの完全なセットが利用される。
  2. 氷の上でリガンドを解凍します。簡単にフリックし、各チューブをスピンダウン。
  3. 製造業者の推奨バッファー(通常はPBS)を使用して、200倍の作業ストックにリガンドを希釈します。
  4. 各200xリガンドストックのピペ10μLを96ウェルプレート内の対応ウェルに入れます。
  5. -20 °Cでプレートをシールして保管します。
    注:リガンド処理プレートをバッチで作成し、ダウンストリーム解析用のすべてのメタデータをキャプチャします。

6. MEMA上の細胞の培養

  1. 二重蒸留水(ddH2 O)で1%の非ファウリング遮断剤(材料の表)を含む非ファウリング遮断バッファーのウェルあたり2mLで20分間MEMをブロックします。
  2. PBSを使用してブロッキングバッファとトリプルリンスウェルを吸引します。乾燥を防ぐために、細胞めっきの準備ができるまで、PBSの最終体積を井戸に残します。
    注:MEMの細胞培養ステップのために2人のベンチワーカーを持つことは非常に有用です。1人のベンチワーカーは吸引ステップを実行でき、2人目は加算ステップを実行します。ピペット用の8ウェルプレートと一度に複数のウェルを吸引する2つのパスツールピペットを持つYスプリッターに一致するように間隔をあけた先端を持つ1 mLマルチチャンネルピペットを使用することをお勧めします。
  3. 10%の胎児ウシ血清(FBS)を含有するダルベッコの改変イーグル培地(DMEM)培地の2mL中の種子2 x 105 MCF7細胞。
    注:完全なMEMA実験の前に、MEMAスポットが目的の実験期間の終わりに高い細胞数を持つ(しかし、コンフルエントではない)ので、細胞数を最適化するために細胞滴定実験を行います。
  4. 2−18hの接着後、吸引培地を2mLの低成長培地(DMEMを0.1%FBSで置き換える)。
    注:減少した血清(例えば、0.1%FBS)または成長因子枯渇条件は、この時点で特定のリガンドの刺激的影響を分離するために使用することができる。
  5. 氷の上にリガンド処理プレートを解凍します。遠心分離機は1分間200 x gでプレートを解凍しました。
  6. 培養板の各ウェルから200μLの培地を処理プレート内の適切なウェルに移す。リガンドの体積を媒体と混ぜ合わせ、この混合物をMEMAプレートの適切な井戸に戻すために上下にピペを行います。
  7. 手で軽く揺れ、MEMAプレートをインキュベーターに戻します。37°Cおよび5%CO2でのリガンド/ECM組み合わせの存在下での実験の持続期間のための培養。
    注:典型的なMEMA実験は72時間実行されます。より長い期間の実験は、培地の置換とリガンドとの再処理を必要とする場合があります。
  8. パルスMEMAウェルは、100x 5-エチニル-2'-デオキシュリジン(EdU)で71時間で、最終的な濃度は10μMのインキュベートで、EdUを1時間37°Cおよび5%CO2で試験条件でインキュベートする。
    注:他の生細胞治療もこの時点で使用されてもよい。

7. MEMの固定と染色

  1. 72時間と任意の生細胞治療の後、井戸を吸引する。RTで2%パラホルムアルデヒド(PFA)のウェルあたり2 mLでMEMAを15分間固定します。
  2. PFAを吸引する。0.1%のニオニオニック界面活性剤のウェルあたり2 mLで15分間透過性を測定する。
  3. ニオニオニック界面活性剤を吸引し、PBSのウェルあたり2 mLで洗浄します。吸引PBS。0.05%ポリソルベート20(PBS-T)で2mLのPBSで洗浄します。
    注:MEMA表面は疎水性であり、染色および抗体のインキュベーションの前にPBS-Tで洗浄しないと、インキュベーションステップ中にウェルに空隙が形成され、染色アーティファクトが生じます。
  4. 吸引PBS-T.EdU検出反応試薬を添加する。RTで1時間インキュベートし、揺れ、光から保護します。1時間インキュベーション後、提供された市販のクエンチバッファーとのクエンチ反応。
    注:EdU検出および染色/抗体ステップは、コストを削減するためにウェルあたり1.5mLで行うことができます。
  5. クエンチバッファーを吸引し、汚れまたは抗体でインキュベートする前にPBS-Tで洗浄します。
  6. ヒストンH3K9me3(1:1,000)およびフィブリラリン(1:400)に対する抗体を使用してMEMAウェルをインキュベートし、2%(w/v)ウシ血清アルブミン(BSA)を含む染色バッファーで、1mM MgCl2および0.02%NaN3を4°Cで一晩使用する。
    注:完全なMEMAセットでそれらを使用する前に最適な濃度を決定するために抗体滴定を行います。
  7. 一次抗体または染色インキュベーションに続いて、PBSでウェル2xを洗浄し、PBS-Tで1回洗浄します。
  8. 二次抗体(ロバ抗マウスIgGおよびロバ抗ウサギIgG、両方とも1:300)および0.5 μg/mL 4'6‐diamidino‐2‐フェニリンドール(DAPI)を添加する。暗闇の中でRTで1時間インキュベートします。
  9. PBSのウェルあたり2 mLでウェル2xを洗浄し、最終的な2 mL PBSにそれらを残します。
  10. 光から保護された4°CでPBSで後のイメージングのために染色されたMEMをイメージングまたは保存してください。

8. MEMAのイメージング

  1. 適切な蛍光検出チャネルを備えた自動イメージングシステム上の画像MEMA。
  2. 結果の画像データをイメージ管理システムに出力します。セルをセグメント化し、CellProfiler8を使用して強度レベルを計算します。

9. データ分析

注:データ分析は、Raw CellProfiler 派生データの正規化、変動補正、および要約で構成されます。この例では、カスタム コードを使用する R 環境を使用して、すべての手順を実行します。ただし、任意の統計環境またはソフトウェア プログラムを使用して、同等のアクションを実行できます。分析用の R 環境のオープン ソース カスタム コードの例は、https://www.synapse.org/#!Synapse:syn2862345/wiki/72486 にあります。

  1. セグメント化されたイメージ データを前処理して正規化します。
  2. DAPI染色された核を使用してスポットセル数を決定します。
  3. セルを EdU+としてラベル付けする自動ゲート EdU 強度 。各スポットにおけるEdU+細胞の割合を用いて増殖を測定する。
  4. 中央値は、サイトレベルで細胞質汚れと核形態の測定値を要約します。
  5. データ品質を向上させるために、データに対する不要なバリエーション (RUV) 正規化の除去を実行します 9.
    注:このアプローチは、前述の9のように列として行とスポットを使用する配列を持つ行列として、各強度信号と形態信号に個別に適用されます。
  6. 空間的または強度に関連する効果を補正するために、配列行と配列列を独立変数として使用して RUV 正規化された残差に二変量ロース正規化を適用します。
  7. 正規化が完了したら、中央値は、レポート作成およびさらなる分析のために、各マイクロ環境条件の反復を要約します。

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結果

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細胞増殖および増殖に対する微小環境影響を簡素化し、細胞増殖および増殖を促進または阻害する条件を同定するために、乳癌細胞株MCF7は、プロトコルに記載されている8ウェルMEMAのセットに播種した。このアッセイは、合計2736の組み合わせ微小環境条件のために、48の異なるEPMと57の異なるリガンドに細胞を曝露しました。培養71時間後、細胞をEdUでパルスし、固定、透過化、DAPI、EdU検出に対する反応、抗フィブリリン抗体、および抗H3K9me3抗体で染色した。細胞を高含有量の顕微鏡で画像化した。画像はOmeroサーバー10にアップロードされ、CellProfiler8を使用してセグメント化され、R9で正規化および分析されました。以下に説明する結果は、DAPI シグナルと EdU シグナルに焦点を当てています。

MEMAの画像解析プラットフォームは、DAPIに基づいて所定のリガンドで処理された細胞に対して2Nおよび4N画分を示すDNA含有量プ...

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ディスカッション

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

「次元性」と文脈の重要性は、微小環境11との相互作用を通じて癌細胞の特性評価のツールとしてのインビトロ培養システムの開発の動機付け要因となっている11、およびインビトロの能力インビボ環境を模倣する文化システムは、これらの文化システムを改善するための探求の原動力です。しかし、インビトロシステムは、単純化されたモデル12にインビボ状況の複合体を蒸留する能力のために、正確に癌研究の重要なツールを残しています。

2D システムには EPM とリガンドを含めることができますが、従来は、組み合わせのパーチュバゲンの広いパネルを調べるためのスループット能力が欠けていました。一般的な市販の地下膜抽出物は、3Dで培養することができますが、タンパク質の慎重に定義されたパネルの証明を欠いています。市販の抽出物は、通常、不完全に定義された組成物に苦しんでおり、分析を混乱させ、有意なバッチ間変動3、13をもたらす可能性がある。

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開示事項

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著者は何も開示していない。

謝辞

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この研究は、NIHコモン・ファンド・ライブラリー・オブ・ネットワーク・セルラー・シグネチャー(LINCS)助成金HG008100(J.W.G.、L.M.H.、J.E.K)によって支援されました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
プロトコルで使用されるAushon 2470Aushon BioSystemsArrayerロボットシステム
Nikon HCANikonHigh Content Imagingシステムは、Nikon Eclipse Ti Inverted Microscope
BioTek Precision XSリキッドハンドラーBioTek
EDTAInvitrogen15575-038
グリセロールSigmaG5516
Triton X100SigmaT9284
Tween 20SigmaP7949
Kolliphor P338BASF50424591
384 ウェル マイクロアレイ プレート、円筒形 ウェルThermo Fisherab1055
Nunc 8井戸皿サーモフィッシャー267062
パラホルムアルデヒド 16%溶液電子顕微鏡 科学15710
BSAフィッシャーBP-1600
アジ化ナトリウムシグマS2002
セルマスク分子プローブH32713
Click-iTEdU Alexa Fluor分子プローブC10357
DAPIプロモキネPK-CA70740043
アルカムR&Dシステム656-ALECM
カドヘリン-20(CDH20)R&Dシステムズ5604-CAECM
Cadherin-6 (CDH6)R &Dシステムズ2715-CAECM
Cadherin-8(CDH8)R &Dシステムズ188-C8ECM
CD44R &Dシステムズ3660-CDECM
CEACAM6R &D Systems3934-CMECM
コラーゲン ICultrex3442-050-01ECM
コラーゲン II 型ミリポアCC052ECM
コラーゲン III 型ミリポアCC054ECM
コラーゲン IV 型シグマC5533ECM
コラーゲン V 型ミリポアCC077ECM
COL23A1R&Dシステムズ4165-CLECM
Desmoglein 2R &D Systems947-DMECM
E-カドヘリン (CDH1)R &Dシステムズ648-ECECM
ECM1R &Dシステムズ3937-ECECM
フィブロネクチンR &Dシステムズ1918-FNECM
GAP43カムab114188ECM
HyA-500KR&DシステムズGLR002ECM
HyA-50KR &DシステムズGLR001ECM
ICAM-1R &Dシステムズ720-ICECM
ラミニンシグマL6274ECM
ラミニン-5Abcamab42326ECM
ルミカンR &Dシステム2846-LUECM
M-CAD(CDH15)R&Dシステムズ4096-MCECM
ニドゲン-1R &Dシステムズ2570-NDECM
オステオアドヘリン/ OSADR&Dシステムズ2884-ADECM
オステオポンチン(SPP)R &Dシステムズ1433-OPECM
P-カドヘリン(CDH3)R &Dシステムズ861-PCECM
PECAM1R &DシステムズADP6ECM
テネイシンCのR&Dシステムズ3358-TCECM
VCAM1R &DシステムズADP5ECM
ビトロネクチンR &Dシステムズ2308-VNECM
BiglycanR &Dシステムズ2667-CMECM
デコリンR &Dシステムズ143-DEECM
ペリオスチンR&Dシステムズ3548-F2ECM
SPARC/オステオネクチンR &Dシステムズ941-SPECM
トロンボスポンジン-1/2R &Dシステムズ3074-THECM
ブレビカンR&D Systems4009-BCECM
エラスチンBioMatrix5052ECM
FibrillinLynn Sakai Lab OHSUN/AECM
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WNT10AGenemed_Own90009リガンド
PTNRnD_Systems_Own252-PL-050リガンド
BMP3RnD_Systems_Own113-BP-100リガンド
BMP4RnD_Systems_Own314-BP-010リガンド
TNFSF11RnD_Systems_Own390-TN-010リガンド
CSF2RnD_Systems_Own215-GM-010リガンド
BMP5RnD_Systems_Own615-BMC-020リガンド
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GPNMBRnD_Systems_Own2550-AC-050リガンド
CXCL12RnD_Systems_Own 350-NS-010リガンド
IL15RnD_Systems_Own247-ILB-005リガンド
TNFRnD_Systems_Own210-TA-020配位子
IGFBP3RnD_Systems_Own675-B3-025配位子
WNT3ARnD_Systems_Own5036-WNP-010配位子
PDGFABRnD_Systems_Own222-AB配位子
AREGRnD_Systems_Own262-AR-100配位子
JAG1RnD_Systems_Own1277-JG-050配位子
BMP7RnD_Systems_Own 354-BP-010リガンド
TGFB2RnD_Systems_Own302-B2-010リガンド
VEGFARnD_Systems_Own293-VE-010リガンド
IL6RnD_Systems_Own206-IL-010リガンド
CXCL12RnD_Systems_Own351-FS-010リガンド
NRG1RnD_Systems_Own378-SMリガンド
IGFBP2RnD_Systems_Own674-B2-025リガンド
SHHRnD_Systems_Own1314-SH-025リガンド
FASLGRnD_Systems_Own126-FL-010リガンド
プロトコルTrizma塩酸塩緩衝液シグマT2069で使用されるリキッドハンドリングロボットを中心に設計されていますズアブズ

参考文献

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