オープン ソース ソフトウェア パイプラインによる寒天培地に固定化活性汚泥粒子径・形状を測定

サマリー

サイズと活性汚泥粒子の形状は、さまざまな方法を用いて測定される重要なパラメーターです。代表でないサンプリング、最適イメージ、および主観的な解析パラメーターの不確かさが生じる。これらのエラーを最小限に抑えるため、測定を容易にするオープン ソース ソフトウェア パイプラインを含むすべての手順を指定するプロトコルを提案します。

要約

それらの治療の排水などの実験的バイオリアクターには、粒子サイズと形状は、重要なパラメーターにはが含まれています。たとえば、サイズおよび活性汚泥フロックの形、マイクロ スケールでの条件が指定でき、浄水汚泥のどれだけ定着にも直接影響します。

粒子のサイズと形状は、両方の 'シンプルな' 誤解の測定値です。多くの微妙な問題、頻繁に非公式なプロトコルと放置は、サンプリング、イメージング、および粒子を分析するときに発生します。サンプリング メソッドは、バイアスされることがあります。 または統計的十分な電力が供給されません。サンプルそのものでは不十分な維持可能性があります。 または固定中に変更を受けます。十分な品質のイメージができない場合があります。重なり合った粒子像、被写し界深度、倍率、様々 な騒音がすべて悪い結果を生みます。不十分な指定された分析は、手動閾値処理と領域分割によって生成されるよう、バイアスを導入できます。

手頃な価格とスループットが再現性と望ましいです。手頃な価格、高スループット方法がより頻繁に粒子計測、粒子の数千人を含む多くの画像を生成できます。安価な試薬、共通の解剖顕微鏡および自由に利用できるオープン ソースの解析ソフトウェアを使用するメソッドでは、反復可能なアクセス可能な再現できる、部分的に自動化の実験結果をことができます。さらに、このようなメソッドの製品は整形済み、ラボ内で解析と実験室間のデータ共有の両方を緩和、データ分析ソフトウェアで容易に理解できる、明確に定義をすることができます。

このような製品を生産するために必要な手順を詳しく説明するプロトコルを提案するなど: サンプリング, 試料調製及び寒天、デジタル画像集録、デジタル画像解析および実験固有図生成の例で固定、分析結果。我々 はまた、このプロトコルをサポートするオープン ソースのデータ解析パイプラインを含まれています。

概要

このメソッドの目的は、バイオリアクター、活性汚泥フロックと好気性顆粒¹を含む特にそれらの粒子のサイズと形状の分布を決定する明確で反復利用と部分的に自動化された方法を提供するには^,2この方法の後ろの理論的根拠は、手頃な価格、シンプルさ、スループットを高めると、既存社内プロトコルの^3、4、再現性、他の粒子計測を容易にし共有を容易にすると。データの比較。

粒子測定分析 - の 2 つの広範なカテゴリ、光散乱⁵としてそのような資質を使用して直接撮像および推論の方法があります。推論方法を自動化し、スループットが大きく、装置は高価です。さらに、推論方法は粒子⁶の同等のサイズを正確に判断できます中、に、彼らは、形状詳細情報⁷を行いません。

図形データのための必要性、我々 は直接画像に本手法を基づいています。いくつかの高速イメージング メソッドが存在する場合、高価な商用ハードウェアまたはカスタム ビルド ソリューション^8,9が伝統的に彼ら必要。一般的な手頃な価格のハードウェアと、スループットの低下に苦しんでいるが多くの分析¹⁰に必要な最小値よりもはるかに多くの粒子画像を生成するソフトウェアを採用する私たちの法を開発しました。

既存のプロトコルでは、重要なサンプリングおよび画像取得手順を指定できません。他のプロトコルは、(アドホック閾値¹¹) などの主観的なバイアスを導入する手動の手順を指定できます。自由に利用できる解析ソフトウェアと組み合わせてサンプリング、固定化、イメージの取得手順を指定する明確に定義されたメソッドには、ラボ内で画像解析と実験室間の比較を強化します。このプロトコルの主要な目的は、ワークフローと同じサンプルの別の研究室から再現可能な結果につながる必要がありますツールを提供することです。

画像解析処理を正規化し、離れて使用に適した明確に定義された、適切にフォーマットされたファイル¹²にこのパイプラインで生成されるデータを記録人気データ分析パッケージ^13,で¹⁴実験を緩和(カスタム図生成) などの特定の分析と実験室間の共有促進のデータ。

このプロトコルは、粒子形状データを必要とする、推論のメソッドへのアクセスを持っていない、独自の画像解析パイプラインを開発し、他のユーザーとデータを簡単に共有したいしたくない人のため特に勧め

プロトコル

1. 粒子解析のためのサンプルを収集します。

1. 統計分析¹⁰の十分な粒子が生成されます特定の原子炉のサンプル ボリュームを決定 (> 500) 粒子の重複を回避しながら。
   1. 混合液のサンプルあたり 0.5 ~ 2 mL の範囲が 250 と 5,000 mg/L の間中断された混合液固体 (MLSS) と汚泥サンプルのために十分であると仮定します。
   2. それ以外の場合、0.5、2、および 5 mL のサンプル (ステップを通じて 2.7 1.2) を使用して 3 つのテスト寒天プレートを準備します。
   3. (もしあれば) を視覚的に推定最高サンプル ボリュームが 1.1 の手順に記載されている条件を満たします。
   4. 0.5 mL サンプルの粒子がまだ重なっている場合は、追加 0.5、1、および 2 mL に 0.5 mL のサンプルは、2.1 のステップの前に薄くならなければならない度合いを判断してリン酸緩衝生理食塩水で希釈した 3 つの 0.5 mL サンプル 1.1.2 と 1.1.3 の手順を繰り返します。
      注: 手順 1.1 − 1.1.4 実験につき一度のみ実行必要がありますまたは原子炉の内容変更以降の測定値は、もはや基準を満たしているような場合に、1.1 ステップします。
2. グラブ 〜 40 mL ビーカーまたは 50 mL の遠心管、軽く混合し、すぐに十分に混合されたグラブの断固としたなサンプル ボリュームを 15 mL 遠心管に注ぐによって原子炉の十分に混合された部分からの代表的なサンプルを取得します。1.1.4 の手順によって決定される、必要に応じてサンプルを希釈します。
   注: プロトコルがここで一時停止にすることができ、サンプルは、最大 48 時間まで冷蔵 (4 ° C) の下で保存されるかもしれない。サンプルは凍結しないでください。
   注意: 一般的な保存媒体 (例えば、ホルムアルデヒド/ホルムアミド) は適していません。オープン コンテナーとの組み合わせで、板の表面積の大きい潜在的不完全に換気された顕微鏡のセットアップと、光源からの熱は、画質に少し利益のため不必要に危険な条件を生成します。

2. ステンド グラス、固定化粒子の寒天を準備します。

1. 各サンプルに 1% (w/v) メチレン ブルーの 5 μ L を追加し、キャップし、優しく混ぜるを 3 回以上で反転します。サンプルを室温で 30 分以上は、少なくとも 5 の染色を許可します。
2. 脱イオン水で 7.5% (w/v) 寒天のサンプルあたり約 10 mL を準備します。
   注: 寒天が前もって生産し、滅菌される場合無期限に格納されます。アガロースは代えることができるが、イメージは大幅に向上しません。
3. 電子レンジまたは水浴を使用して寒天を溶かし、使用前にわずかに冷却することができます。寒天が完全に溶け、簡単に注ぐことを確認します。寒天の固体球は質の悪い画像を生成、異なる染色されます。
4. 6.5 および 9 mL の間に総管容積をもたらす遠心管に十分な溶かされた 7.5% (w/v) 寒天を転送します。
5. 遠沈管を要約し、優しくミックスに、少なくとも 3 回を反転します。
6. 自分自身の事からまたはフード キャップを指差しながらキャップを開きます。完全な滑らかなコーティングと視覚的に均一な粒子を達成するために皿を軽く揺動中 100 mm プラスチック シャーレにチューブ内を注ぐ。
   注意: 寒天から熱管にわずかな間隙が生じる。これは頻繁に聞こえるヒスノイズが生成され、熱い寒天の小さな小滴を放出する可能性があります。
7. 寒天が固化するまで、少なくとも 5 分間室温で冷却するプレートを許可します。
   注: プロトコルはここで一時停止可能性があります。メッキ ストア反転し、封印されていた (例えば、密封ビニール袋やパラフィン フィルム) 48 時間まで冷蔵 (4 ° C)。

3. 実体顕微鏡とデジタル カメラを用いた粒子画像を取得します。

1. 10 倍 20 倍の倍率にことができる顕微鏡のステージに表向きで覆いを取られたプレートを配置します。LED 照明スタンドや照明板などの機器を使用しても、拡散光でサンプルを下から照らします。
2. イメージ キャプチャ ソフトウェアを開き写真顕微鏡の光パスを設定ことを確認カメラ リストから適切なカメラをクリックします。
3. 複数のパーティクルは、大規模な明確に定義されたエッジを持つフォーカル プレーンでソフトウェアで表示されるように、顕微鏡を調整します。10-20 倍の倍率を使用すると、比較的深い焦点面を維持しながら粒子を測定します。
   1. 一時的に寒天プレートを削除し、マイクロメータをステージに配置します。マイクロメータの目盛が絞った画像キャプチャ ソフトで表示されるまでは、良い焦点を調整します。
   2. キャリブレーションされていない場合は、現在の倍率のマイクロ比ピクセルを記録します。
      1. クリックして、ズームを 100% に設定ズーム > 実際のサイズし、オプション > 調整、0 〜 200 μ m の卒業式を中心とした垂直のバーで、マイクロメータの長軸に沿ってメイン ビューポートで赤い校正バーを配置。[調整] ダイアログ ボックスで、現在の拡大率と 200 μ m の実際の長さを入力します。
   3. 場合既にメニュー バーから [表示倍率を調整し、選択現在の倍率レベルし校正を確認します。
      1. 選択測定 > ライン > 任意ライン。0 卒業とマイクロメータの軸の交点をクリックします。200 と長い軸の交差点を再度クリックします。A 正しいキャリブレーションが約 200 を表示する必要があります μ m を削除します。 行クリックし、del キーを押して、確認ボックスではいを押します。
         注: カメラのキャリブレーションを選択するための指示は、このハードウェアに使用されるソフトウェアに固有です。同様の機能は、他のイメージング ソフトウェアで利用可能なする必要があります。目標は、正確な粒子サイズ計測用画像のミクロン比するピクセルを決定します。
4. 寒天プレートを交換し、イメージング ソフトウェアの最大の詳細を達成するために良いフォーカスを調整します。
5. イメージング ソフトウェアを調整最大の画像品質を実現します。
   1. カメラのサイドバーのビット深度パネルでラジオ ボタンを選択して、許容される最大値にビット深度を増加します。カメラのサイドバーの色/グレーパネルで該当するラジオ ボタンを選択してグレースケール画像を取得するソフトウェアを設定します。
   2. 露出とヒストグラムの任意の開いているサイドバーのパネルを折りたたみます。1.0 に利得の減少し、ビューポートで、ヒストグラム ボックスの両端にクリップされていない分布とヒストグラムが表示されるまで、鮮明な画像が表示されるまで、露出を増やします。
   3. 避けるためのヒストグラムと露出不足を調整します。カメラのサイド ・ バーのヒストグラム パネルでだけで最低値外にヒストグラムの左端と右端だけで最高値外にスライドさせます。
6. として、圧縮されていない TIFFイメージのメタデータ内の倍率情報などを使用して、イメージを保存、ファイル > 名前を付けてダイアログ ボックス、TIFF 形式を選択して、キャリブレーション情報を保存ボックスを確保することチェックされます。
   注: は空間のキャリブレーションも含め、画像メタデータを保存取得プログラムによって異なります。フィジー¹⁵、パイプラインによって使用される基になるソフトウェアは、最も一般的な変種を理解しています。記録するための重要な情報は、ピクセルの高さ、幅、および関連するユニットです。
7. どちらかモバイル ステージを使用して、プレート自体を手動で移動または板; 下交互に左から右へと一つとして右から左に移動するパスを次以前の画像を重複しない別のエリアを選択します。またとして知られている ' 芝刈り機検索パターン '。3.6 のステップを繰り返してよりは優れている、少なくとも 500 の視覚的に推定される粒子をキャプチャするための十分なイメージは生成されます。
   注: 代替パターン (例えば.、円、ランダム) が許容されるが、報告する必要があります。デジタル ステッチ生成を介してモザイクの組み合わせに対して複数の重複画像を取得大幅ダウン ストリームの処理やステッチからの人工物を妨げる結果として得られるファイルのサイズは導入してもよいし、推奨されていません。
8. 潜在的なフォロー アップ用画像解析後までプレートを保持します。最終的なイメージング後、生物系廃棄物の適切な破棄します。

4. 測定、粒子のシルエットを分析

1. 必要な画像解析ソフトウェア パッケージをインストールします。
   1. フィジーをインストール (」の手順に従って、国立衛生研究所の ImageJ v1.52e の拡張バージョン: https://imagej.net/Fiji/Downloads
   2. 次の手順に従って、存在しない場合、git をインストール: https://git-scm.com/downloads
   3. ¹⁶git リポジトリのクローンを作成してから粒子解析コードを取得します。
      1. コマンド ・ ラインで入力してコードの最新バージョンを取得します。
         git のクローン https://github.com/joeweaver/SParMorIA-Sludge-Particle-Morphological-Image-Analysis.git
         1. クローンしたリポジトリの最上位のディレクトリで見つかった README.md テキストファイルの指示解析コード次をインストールします。
            注: は、それが自動的にコードの最新バージョンを取得、最寄り、git を使ってです。Git を使用できない場合もコードのリリース ページに zip ファイルとしてダウンロード可能です: https://github.com/joeweaver/SParMorIA-Sludge-Particle-Morphological-Image-Analysis/releases
   4. 省略可能なパラメーターと共に、処理されるディレクトリを列挙したテキスト ファイルを編集します。パラメーターの例一覧例/分析サブディレクトリを参照します。
2. コマンドラインで入力して分析を実行します。
   < フィジー パス > \ImageJ-win64.exe - コンソール - マクロ SParMorIA SludgeParticle_Morphological_Image_Analysis < paramsfile >
   ここで < フィジー パス > は ImageJ win64.exe が置かれているディレクトリ、< paramsfile > 解析セットアップを記述するテキスト ファイルの場所
   注: にインストールされているオペレーティング システムのフィジーをによって実行可能ファイルの名前は異なる場合があります。数や画像のサイズに応じて分析時間に数分をかかることがあり、自動的に実行されます。
3. 品質管理チェックを実行します。
   1. 指定された出力ディレクトリのオーバーレイ サブディレクトリ内にある品質管理ファイルを調べます。スプリアス、不在、および不十分なキャプチャされた粒子、すべて背景が合わない場合、影付きのアウトラインとして明らかに画像に注意してください。このような例については図 3を参照してください。粒子データは実験に固有解析図生成の準備が整いました。
4. 注意ファイルおよび/または粒子を無視 Id 解析コードで指定することによって全体の板または個々 の粒子を拒否します。例/関連する R と Python コードのリポジトリの修正を参照してください。
5. 各イメージは、指定された出力ディレクトリの結果サブディレクトリに整頓された¹²コンマ区切り形式のテキスト ファイルに格納されているために、画像解析結果を用いた実験の特定の数値を生成します。結果ファイルを読み取る方法の例の例/数字/R と例/数字/Python サブディレクトリを参照してください。

結果

生成されたファイル
図 1に示すプロセス分析画像ごとの 2 つのファイルが生成されます。最初のファイルはコンマ区切り値 (CSV) テキスト ファイル個々 の粒子に対応するそれぞれの行、列エリア、真円度、堅牢性など様々 な粒子のメトリックを記述して ImageJ マニュアル¹⁷で定義されています。例/データ ディレクトリ、補足情報として CSV ファイル例にはが含まれます

図 1:グラフィカルなワークフローのプロトコルの 4 つの主要な手順を説明します。

ディスカッション

画像解析システムはかなり堅牢な QC の手続きして、悪いイメージを削除、サンプリング、プレートの準備、および画像の取得の固有の問題に適切な注意ができる両方のデータの精度との割合品質管理を通過した画像。

サンプル濃度
代表的なサンプルを撮影されていると仮定すると、最も重要なステップは、十分な粒子が粒子が重なってないので集中し、代表⁹と解析の効率化のために存在していることを確認することです。

これは合計の懸濁物質が広い範囲にわたって約 0.5 ~ 2 mL の混合液に対応したが、実験固有の決意が必要かもしれません。過度に集中の例は過度に - 希釈、適切な粒子濃度が参考として図 5に示すように。染色は粒子濃度によっても影響を受けます。下希釈可能性があります最適な閾値の十分なコントラストを持つ粒子を作り出さない間、過剰希釈が過度にステンド グラス、ぼやけて粒子で起因できます。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
10% 漂白剤溶液	クロロックス	31009	ワークスペースの消毒用。
キャップ付き15mL遠心分離チューブ	Corning	430790	サンプルあたり。
50 mL 三角フラスコ	Corning	4980-50	他の容器は、> 40 mLのサンプルを含み、
500 mL Kimax Bottle	Kimble-Chase	14395-50	または、寒天処理に十分な
寒天	BD	214010	Solid、7.5% ゲルを調製する
データ分析ソフトウェア	N/A	N/A	RまたはPythonをお勧めします
脱イオン水	N/A	/A	汚れや寒天を準備するのに十分です。利用できない場合は、タップしても問題ありません。
デスクトップコンピュータ	N/A	N/A	画像分析はCPUを集中的に使用するものではなく、2017年頃の「普通の」デスクトップコンピュータであれば十分です。
外付けハードドライブ	Seagate	STEB5000100	完全には必要ではありませんが、画像の数とサイズを考えると非常に便利です。2 TB 以上のストレージを推奨します。
FIJI	NIH	バージョン1.51d	バージョンはImageJコアです。プラグインは執筆時点で更新されています。利用可能場所:https://imagej.net/Fiji/Downloads
GIT	オープンソース	バージョン2.19.1以降	利用可能:https://git-scm.com/
画像キャプチャソフトウェア	ToupView	バージョン3.7.5177	と互換性のあるものなら、カメラが付属している場合があります。TIFF画像を空間キャリブレーションデータとともに保存できるようにする必要があります。
メカニカル(X/Y)ステージ	OMAX	A512	完全には必要ありませんが、画像取得に大いに役立ちます。
メチレンブルー	フィ	ッシャーM291-100	固体、1%w / v溶液を調製します。 サンプルあたり5 uL溶液。
顕微鏡カメラ	OMAX	A35140U	顕微鏡に対応したデジタルカメラなら何でも。10倍の倍率でピクセルあたり少なくとも5umを提供し、カラーチャネルごとにピクセルあたり少なくとも8ビットのダイナミックレンジを提供する解像度が推奨されます。
光学ステージマイクロ	メーターOMAX	A36CALM1	または、空間キャリブレーションには十分です。
ペトリ皿、100 mm	フィッシャー	FB0875712	サンプルあたり1個。
PPE	N/A	N/A	標準的な白衣、手袋、眼鏡。
Sparmoriaマクロ	NCSU	バージョン0.2.1github	リポジトリで入手可能:https://github.com/joeweaver/SParMorIA-Sludge-Particle-Morphological-Image-Analysis
ステレオ/解剖顕微鏡	ニコン	SMZ-2T	は、10〜20倍の倍率を提供し、内蔵カメラまたはCCDの取り付けポイントのいずれかでデジタル写真を許可する必要があります。