心臓の細胞治療幹細胞 DNA の完全性を評価します。

サマリー

ここでは、幹細胞移植前の DNA の完全性の評価分析のため実験のセットアップの詳細な説明を提供します。

要約

幹と幹細胞由来細胞様々 な変性疾患の再生治療として大きな可能性があります。DNA は、幹細胞を含むすべてのセル内の遺伝データの倉庫との整合性はその再生能力の基本。幹細胞移植のための必要な数を達成するためにラボでの急速な伝播を受けます。加速された細胞の成長は活性酸素、カルボニル、アルキル化剤など、蓄積した代謝物による DNA の完全性の損失につながります。これらの細胞を移植生着不全と悪化の器官の再生になります。また、突然変異、dna、細胞老化細胞の DNA 損傷リードを移植とおそらく、生命を脅かすがんなどの病気。したがって、移植細胞の適合性を評価するための品質管理法のための即時の必要性があります。ここでは、幹細胞移植前の DNA の完全性の評価手順のプロトコルを提供します。

概要

実験的ならびに臨床的細胞移植することができます心^{1,2,3,4,5 を失敗して左心室収縮性能を改善して適度に示します ,6,7,8,9}。最近の進歩は、心血管の再生のための機会をさらに魅力的な開いています。体細胞に多能性を誘導し、異なる心臓系統、重要な心筋細胞 (CM)^10、にこれらの誘導多能性幹細胞 (iPSC) を区別するためにリプログラミング因子の強制発現が含まれます^11,12,13。 人工的に生成された Ips と iPSC 由来 CM (iPS CM)、などを含むすべてのセルの遺伝性材料の DNA です。DNA に格納されている遺伝命令は、成長、開発、および細胞、組織、器官、生物の機能を決定します。DNA ではない不活性です。細胞の代謝、活性酸素、カルボニル、窒素種などとアルキル化剤は原因 DNA の in vitro および in vivo で^14,15,16,17を傷つけることができます。重要なは、重要な頻度のすべてのセルで直感的に DNA 損傷が発生します。これらの損傷が修正されていない場合それは DNA の突然変異、細胞の老化、DNA ・細胞の整合性、および多分、生命を脅かす癌を含む疾患の損失に します。したがって、DNA の整合性を維持する任意のセル、特にクリニックの巨大な潜在性を持つ Ips に不可欠です。

数量やゲノムの DNA の分離の整合性を評価する高価な機器は市場で利用できます。ただし、セルを孤立させることがなく細胞内 DNA の整合性を評価するためにシンプルでコスト効率の良い方法もありません。さらに、ユーザーによる DNA 分解 DNA の隔離は、これらのメソッドを使用して主な欠点の 1 つです。単細胞ゲル電気泳動 (コメット試験法として知られている)^18,19と γH2A.X 反応⁸テクニックは、DNA 損傷を評価するための研究所の根本的なアプローチ。これらの 2 つの方法では、高価な機器や DNA 整合性^8,20,21を分析するゲノム DNA の分離は必要ありません。全体のセル; これらの技術で実行されましたので、サンプル準備の間に DNA、RNA、タンパク質分解のユーザー誘導は、これらのプロトコルには影響を与えません。ここでは、DNA 損傷と幹と幹細胞由来細胞における DNA 損傷応答を査定する、彗星法と γH2A.X 反応の両方を実行するステップバイ ステップのプロトコルを提供します。また、これらの 2 つのアプローチを組み合わせて、移植細胞の適合性を評価するために使用できます素朴な評価を提案します。

コメットアッセイ、または単一セルの電気泳動のゲル、細胞での DNA 切断を測定します。低融点アガロースに埋め込まれた細胞は、スーパー コイル DNA を含むフォーム ユーグレナグラシリスに分離します。彼らの巨大なサイズとマトリックス蛋白質とその活用のため、そのまま DNA は制限された移行を持っているに対し電気泳動に断片化された DNA と壊れた dna の小さな断片はアガロースゲル細孔に移行します。蛍光顕微鏡下でステンド グラスの DNA のパターンは、彗星を模倣します。彗星の頭にそのままな DNA が含まれていると尾を断片で構成され、壊れた dna。DNA 損傷の割合は、そのまま DNA (彗星頭部) 強度を基準にして損傷した DNA (彗星の尾) の蛍光強度が測定できます。図 1に示すように、パラメーター テール モーメントを計算できます。

DNA 損傷は、ヒストン H2A のリン酸化を誘導します。DNA PK、ATR、ATM キナーゼ (γH2A.X) を Ser139 で X。リン酸化と H2A の募集。DNA 鎖切断に X は、DNA 損傷応答 (DDR) と呼び、DNA が破損している後急速に起こる。次のこのプロセス、細胞周期のチェックポイントを介した逮捕、DNA 修復プロセスが開始されます。DNA の修復が正常に完了した後、γH2A.X は脱燐酸化し、脱燐酸化酵素による不活化します。長時間、複数の DNA 鎖切断は、dna γH2A.X 巣の蓄積に 。これは、DNA 損傷と DNA の完全性の損失を修復する細胞のできないことを示します。DNA のこれらの γH2A.X の巣によって識別できます、セクション 2 のプロトコルを使用して DDR 巣の数を数えることができます。

プロトコル

1. コメットアッセイ

1. 試薬の準備
   1. 低融点アガロースの低融点アガロースの 500 mg を 100 mL の DNA - に/水の RNA 無料します。Agarose が溶けるまで電子レンジでボトルを加熱します。37 ° C の水浴必要になるまでにボトルを置きます。
      注:さらに、DNA の巻き戻しの時間といくつかの電気泳動の要因²³agarose 濃度の影響を検討した Azqueta et al., を参照してください。
   2. SYBR グリーン DNA 在庫の染料の解決の作業 × 1 を入手する 1: 10,000 の割合でトリス EDTA (TE) バッファーに色素を薄くしなさい。この染料は、光に敏感な暗い場所でそれを保存します。
   3. セル換散バッファー 100 mL の溶解バッファーを解散 (2.5 M の NaCl、0.1 M の EDTA、10 mM トリス、1% トリトン X-100) 脱イオン水 (ディ H₂O)。10.0 に pH を調整する 10 M NaOH を追加します。4 ° C にバッファーをクールします。
   4. アルカリ DNA 巻き戻し/電気泳動の実行バッファーを解散・ ディ ・ H₂o. クール 4 ° C にバッファーにおけるアルカリ溶液 (0.3 M NaOH、1 mM EDTA) 1 LPH を確認 > 13。
   5. プレコート彗星のスライド、スライド ガラスに 0.5% の agarose を数滴を配置します。Agarose のコーティングの薄層を形成する agarose がすぐに、別のスライドの平らな面を使用すると、広がった。
      注:スライドを使用する前に乾燥させます。
   6. IPS 細胞培養のため簡単に材料表を基底膜マトリックス コート (を参照) の iPS 細胞文化 mTESR1 培地の平板の confluency に到達するまで。
      注:ひと心臓線維芽細胞由来の iPS 細胞は、このプロトコルで使用されました。IPS 細胞誘導と培養条件のリプログラミングは私たち研究グループ^12,13,21からの最近の記事で説明されます。
2. サンプル準備
   1. 培を破棄し、セルを洗浄します。剥離のソリューションを使用してセルを分離 (材料の表を参照してください)。リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 細胞ペレットを洗浄し、1 x 10 の⁵セル/mL の PBS で細胞を再懸濁します。
3. サンプルのスライドの準備
   注:紫外光誘起細胞の損傷を避けるために低光の条件の下で次の手順を実行します。
   1. 細胞懸濁液のアガロース溶液の 90 μ L ミックス 10 μ L (1:10 の比率) 管内。Agarose が凝固するを防ぐために 37 ° C の水浴にチューブを置きます。
   2. 気泡を導入することがなくソリューションをミックスし、ピペットをプレコート彗星スライド 70 μ/スポット。ピペット チップを使用すると、拡散、薄膜層を形成する細胞 agarose 混合物。4 ° C、15 分にスライドを配置します。
   3. コンテナー内冷換散バッファーのスライドが完全に水没します。4 ° C 1 時間の暗闇に容器を置きます。
   4. 換散バッファーを冷アルカリ溶液に置き換えます。スライドが完全に水中に沈むかどうかを確認します。30 分間、4 ° C で暗闇の中、コンテナーを配置します。
4. 電気泳動
   1. 水平電気泳動槽にスライドを配置します。スライドが完全に水中に沈むまで冷たいアルカリ電気泳動バッファーでタンクを満たします。15 〜 30 分の 1 V/cm の電圧を適用します。
      注:合計電圧 = x 1 V 電極間距離
   2. コンテナーで完全に水没、冷たい・ ディ ・ H₂o. のスライド2 分後・ ディ ・ H₂O を削除し、新鮮な・ ディ ・ H₂O を繰り返しこの手順を追加します。
   3. 冷たい 70% エタノール ・ ディ ・ H₂O に置き換えます。ゆっくり 5 分を待つスライドを削除はない、それを傾けるし、それ風乾します。
   4. 一度乾燥、各スポットに 100 μ L の DNA 色素の希釈を追加します。室温で 15 分を待機します。落射蛍光顕微鏡で FITC フィルターを使用して、サンプルごとに合計で 50 に 100 の彗星の画像を取る。
5. 画像解析と結果の計算
   1. 彗星をスコアリングのため、国立衛生研究 (所 NIH) を使用して、彗星アッセイ プラグインで ImageJ (ImageJ をここでダウンロード: プラグインをダウンロードして https://imagej.nih.gov/ij/download.html;: https://www.med.unc.edu/microscopy/resources/imagej-plugins-and-macros/comet-assay/)。
      注:プラグインは、解析を実行するすべての詳細を含む PDF 命令が付属します。また、彗星の分析のスクリーン ショットは、図 2 a ~ Cに表示されます。コントロールとドキソルビシン (Doxo) の代表的な彗星画像-扱われた iPS 細胞と彗星の定量化図 3A-Cに表示されます。

2. DNA 損傷応答

1. サンプルと試薬の調製
   1. CM iPS 細胞培養、文化 iPS CM材料表を基底膜マトリックス コート (を参照) の confluency に達するまで RPMI 培 B-27 (CMM) とで培養皿をセルします。
      注:ヒト iPS 細胞由来心筋細胞は、このプロトコルで使用されました。心筋細胞 iPS 細胞分化のためのプロトコルは、私たち研究グループ^12,13,21からの最近の記事で見つけることができます。
   2. 商工会議所のスライドで iPS CMs をシードします。
      1. IPS CM 井戸から培養液を破棄します。3 回 PBS のセルを洗浄します。
      2. ウェルあたり 0.25% トリプシンの 1 mL を加えて 5 分チェック細胞の剥離を顕微鏡下でプレートの 37 ° C で孵化させなさい。トリプシンを停止する CMM の 1 mL を追加します。
      3. 細胞懸濁液が、15 mL チューブと 4 ° C、200 x gで 5 分間遠心します。培地を除去 CMM の 1 つの mL を追加し、細胞を再懸濁します。セルをカウントし、CMM の 1.6 mL で 20 x 10 の⁵セルを取得するセルの数を調整します。
      4. 種子も 8 も商工会議所のあたりの細胞懸濁液 200 μ L スライド (材料の表を参照してください)。井戸周りの細胞を拡散し 37 ° c. で孵化させなさい優しくスライドをタップします。
   3. IPS CM ドキソルビシン治療のため iPS CM 井戸から培養液を破棄します。PBS のセルを洗浄します。1 μ M のドキソルビシンと細胞を治療して PBS のセルを洗浄して 4 h の CMM 培地を吸引します。
   4. ブロック バッファーの準備 3 %bsa および 0.05% を含むウシ血清アルブミン (BSA) 溶液 10 mL トリトン X-100。10 mL のブロック バッファーを準備するには、準備された BSA 溶液 9 mL に通常ロバ血清 1 mL を追加します。
   5. 一次抗体溶液 1 μ L 抗家兎リン酸化ヒストン H2A を追加します。200 μ L のブロック バッファー (Ser139) 抗体 x。
   6. 二次抗体ミックス ブロック バッファーの 200 μ L に 1 μ L 各蛍光色素標識された抗家兎の二次抗体、DAPI、蛍光色素標識されたファロイジンを追加します。
2. 反応
   1. 3 回 PBS のセルを洗浄して、作りたての 4% パラホルムアルデヒド (PFA) の 200 μ L を各ウェルに追加します。部屋の温度で暗闇の中 20 分のセルを修正します。PBS のセルを洗浄します。
   2. PBS を削除し、室温で加湿チャンバー内でも、30 分のブロックごとにブロック バッファーの 200 μ L を追加します。ブロック バッファーを削除し、一次抗体溶液 200 μ L を追加します。常温で暗い、加湿チャンバー内で 45 分間インキュベートします。その後、PBS で 3 回洗浄します。
   3. PBS を削除し、二次抗体の組合せの 200 μ L を追加します。常温で暗い、加湿チャンバー内で 45 分間インキュベートします。その後、PBS で 3 回洗浄します。・ ディ ・ H₂O antifade でそれらをマウントする前に洗います。Coverglass を置き、4 ° C で暗闇の中でスライドを保存
   4. 落射蛍光顕微鏡を使用すると、図 4 aに示すように、1 サンプルあたりのランダム フィールドの 3 ~ 5 画像を撮影し、画像解析に進みます。
3. DDR 巣のカウント
   1. ダウンロードして CellProfiler²⁴ (http://cellprofiler.org) をインストールします。
   2. 注:本研究における画像処理は、CellProfiler バージョン 2.1.1 を用いて行われた.他の所で使用された CellProfiler のためのチュートリアルを見つけることが (https://www.youtube.com/watch?v=PvhRL9xpduk & リスト = PL7CC87670239B4D10)。CellProfiler の新しいバージョンを使用している場合、パイプラインはマイナーな適応を必要があります。
   3. パイプラインのpunctae_gH2AX.cpipeをダウンロードします。ファイルを選択 >インポート>パイプラインファイルから、 punctae_gH2AX.cpipeを選択します。
   4. 分析 (図 5 a) は、入力モジュール/画像セクションのファイル一覧ウィンドウに γH2A.X の巣の得られたイメージを含むフォルダーにドラッグ アンド ドロップします。次に、図 5 a Lで示すように、指示に従います。
   5. 画像の次のパラメーターを設定します。
      1. ファイルの一覧に分析目的のイメージをドラッグします。入力モジュール、下の画像を選択 (図 5 aをモジュールの設定を参照)。入力モジュールのメタデータを選択します (図 5 bをモジュールの設定を参照)。入力モジュールでNamesAndTypesを選択 (モジュールの設定の図 5を参照)。
      2. グループは、なしを選択します。分析モジュールでColorToGrayを選択 (モジュールの設定の図 5を参照)。
   6. 分析モジュール、滑らかな選択 (図 5Eをモジュールの設定を参照)。
      注:この値は、画像の解像度によって最適化する必要があります。
   7. 分析モジュールでIdentifyPrimaryObjectsを選択 (図 5 階をモジュールの設定を参照)。
      注:全体の核が選択されていることを確認するこれらの値を最適化します。この手順の後、コンピューターは遅れることがあります。
   8. 分析モジュール、滑らかな選択 (モジュールの設定の図 5を参照)。
      注:この値は、画像の解像度によって最適化する必要があります。
   9. 分析モジュールでEnhanceOrSuppressFeaturesを選択 (図 5 Hをモジュールの設定を参照)。
   10. 分析モジュールでIdentifyPrimaryObjectsを選択 (図 5Iをモジュールの設定を参照)。
       注:Punctae が選択されていることを確認するこれらの値を最適化します。この手順の後、コンピューターは再度遅れることがあります。
       1. 分析モジュールでRelateObjectsを選択 (図 5 jをモジュールの設定を参照)。分析モジュールでClassifyObjectsを選択 (図 5 Kをモジュールの設定を参照)。分析モジュールでExportToSpreadsheetを選択 (図 5 Lをモジュールの設定を参照)。
       2. 画像解析を実行する左下のパネルに画像の分析をクリックします。分析が正常に完了にいくつかの画像が生成されます (図 6A-F)。
          注:今後の参考のためにこれらの画像を保存してください。
       3. 詳細な分析は生成され、コンピューター上の適切な場所に保存されている定量的データを含む .csv ファイルに注意してください。MyExpt_Imageと呼ばれるスプレッドシート、列 B および D はそれぞれ 5 およびより多くの punctae している核の数があります。核の合計数を取得するには、B と D の列を追加します。
   11. 2.3.3 - 2.3.8 (すべての分析の前にMyExpt_のファイル名を変更) すべてのイメージのためのステップを繰り返します。プロットは図 4に示すように、DNA の完全性を評価するため可能です。

結果

ひと誘導多能性幹細胞の培養や DNA の完全性の測定として使用された DNA 損傷とテール モーメント コメットアッセイによって分析されました。iPS 細胞は、低融点アガロースに埋め込まれているされ、ガラス スライド上に配置。セルは、スーパー コイル DNA を取得する、アルカリ溶液に続いての換散バッファーと扱われた。ユーグレナグラシリス、electrophoresed し、彗星が DNA 色素 (図 1 a~ D) によって想像されたもの。彗星は、彗星アッセイ プラグイン (図 2 a・ C) を使用して、ImageJ で分析した。

ヒト iPS 細胞は、DNA 損傷を誘発して肯定的な制御として使用する Doxo と扱われました。

ディスカッション

DNA の完全性は、細胞の完全性を描いています。損傷 DNA と細胞ストレスが多いし、最終的にその整合性を失います。幹と幹細胞由来の細胞が移植を目的として伝達されているの整合性は、その目的の機能を実行するセルのプリンシパルです。損傷 DNA と細胞移植生着不全率と細胞^8,20のパフォーマンスになります。したがって、細胞移植前に DNA の検査、必要な品質制御プロトコルです。ここで 2 つの費用効果が大きいアプローチ、すなわち、彗星アッセイと γH2A.X 蛍光 DNA 損傷と幹と幹細胞由来細胞の質を評価するためにラベル付けについて述べる.

細胞の老化の主な原因は、細胞の DNA 損傷の蓄積と考えられています。コメット ・ アッセイを使用して、アリ ・ ベイカーらは²²若いや老齢のひと皮膚繊維芽細胞における DNA 損傷を分析しました。以前は、我々 の DNA は、ダメージ フリー心臓移植を示されている前駆細胞の p53...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
0.25% トリプシン	コーニング	25200056
8 ウェルチャンバースライド	Millicell	PEZGS0816
Accutase	Stemcell Technologies	7920	細胞剥離液
Alexa Fluor 488 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG	Jackson Immuno Research Laboratories	711-545-152 (RRID: AB_2313584)
ウシ血清アルブミン	Sigma-Aldrich	A7906
Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG Jackson	Immuno Research Laboratories	711-165-152 (RRID:AB_2307443)
DAPI	Sigma-Aldrich	D9564
Gibco B-27 Supplement, Serum Free,Gibco		17504-044
Matrigel growth factor reduced	Corning	354230
mTeSR1	Stemcell Technologies	85850
PhalloidinA488	Life Technology	A12379
リン酸化ヒストン H2A.X (Ser139) Antibody	Cell Signaling Technology	2577 (RRID: AB_2118010)
RPMI	Gibco	11875-093
SYBR グリーンI核酸ゲル染色剤	Sigma-Aldrich	S9430
Triton X-100	Fisher scientific	BP151-100
UltraPure 低融点	Agarose Invitrogen	16520050
Vectashield	Vector Laboratories	H-1000	退色防止

剤