方法論記事

心臓の細胞治療幹細胞 DNA の完全性を評価します。

DOI：

10.3791/58971

⸱

2019年1月25日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, School of Engineering, School of Medicine, University of Alabama at Birmingham

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

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ここでは、幹細胞移植前の DNA の完全性の評価分析のため実験のセットアップの詳細な説明を提供します。

要約

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幹と幹細胞由来細胞様々 な変性疾患の再生治療として大きな可能性があります。DNA は、幹細胞を含むすべてのセル内の遺伝データの倉庫との整合性はその再生能力の基本。幹細胞移植のための必要な数を達成するためにラボでの急速な伝播を受けます。加速された細胞の成長は活性酸素、カルボニル、アルキル化剤など、蓄積した代謝物による DNA の完全性の損失につながります。これらの細胞を移植生着不全と悪化の器官の再生になります。また、突然変異、dna、細胞老化細胞の DNA 損傷リードを移植とおそらく、生命を脅かすがんなどの病気。したがって、移植細胞の適合性を評価するための品質管理法のための即時の必要性があります。ここでは、幹細胞移植前の DNA の完全性の評価手順のプロトコルを提供します。

概要

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実験的ならびに臨床的細胞移植することができます心1,2,3,4,5 を失敗して左心室収縮性能を改善して適度に示します ,6,7,8,9。最近の進歩は、心血管の再生のための機会をさらに魅力的な開いています。体細胞に多能性を誘導し、異なる心臓系統、重要な心筋細胞 (CM)10、にこれらの誘導多能性幹細胞 (iPSC) を区別するためにリプログラミング因子の強制発現が含まれます11,12,13。 人工的に生成された Ips と iPSC 由来 CM (iPS CM)、などを含むすべてのセ....

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プロトコル

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1. コメットアッセイ

  1. 試薬の準備
    1. 低融点アガロースの低融点アガロースの 500 mg を 100 mL の DNA - に/水の RNA 無料します。Agarose が溶けるまで電子レンジでボトルを加熱します。37 ° C の水浴必要になるまでにボトルを置きます。
      注:さらに、DNA の巻き戻しの時間といくつかの電気泳動の要因23agarose 濃度の影響を検討した Azqueta et al., を参照してください。
    2. SYBR グリーン DNA 在庫の染料の解決の作業 × 1 を入手する 1: 10,000 の割合でトリス EDTA (TE) バッファーに色素を薄くしなさい。この染料は、光に敏感な暗い場所でそれを保存します。
    3. セル換散バッファー 100 mL の溶解バッファーを解散 (2.5 M の NaCl、0.1 M の EDTA、10 mM トリス、1% トリトン X-100) 脱イオン水 (ディ H2O)。10.0 に pH を調整する 10 M NaOH を追加します。4 ° C にバッファーをクールします。
    4. アルカリ DNA 巻き戻し/電気泳動の実行バッファーを解散・ ディ ・ H2o. クール 4 ° C にバッファーにおけるアルカリ溶液 (0....

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結果

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ひと誘導多能性幹細胞の培養や DNA の完全性の測定として使用された DNA 損傷とテール モーメント コメットアッセイによって分析されました。iPS 細胞は、低融点アガロースに埋め込まれているされ、ガラス スライド上に配置。セルは、スーパー コイル DNA を取得する、アルカリ溶液に続いての換散バッファーと扱われた。ユーグレナグラシリス、electrophoresed し、彗星が DNA 色素 (図 1 a~ D) によって想像されたもの。彗星は、彗星アッセイ プラグイン (図 2 a・ C) を使用して、ImageJ で分析した。

ヒト iPS 細胞は、DNA 損傷を誘発して肯定的な制御として使用する Doxo と扱われました。

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ディスカッション

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DNA の完全性は、細胞の完全性を描いています。損傷 DNA と細胞ストレスが多いし、最終的にその整合性を失います。幹と幹細胞由来の細胞が移植を目的として伝達されているの整合性は、その目的の機能を実行するセルのプリンシパルです。損傷 DNA と細胞移植生着不全率と細胞8,20のパフォーマンスになります。したがって、細胞移植前に DNA の検査、必要な品質制御プロトコルです。ここで 2 つの費用効果が大きいアプローチ、すなわち、彗星アッセイと γH2A.X 蛍光 DNA 損傷と幹と幹細胞由来細胞の質を評価するためにラベル付けについて述べる.

細胞の老化の主な原因は、細胞の DNA 損傷の蓄積と考えられています。コメット ・ アッセイを使用して、アリ ・ ベイカーらは22若いや老齢のひと皮膚繊維芽細胞における DNA 損傷を分析しました。以前は、我々 の DNA は、ダメージ フリー心臓移植を示されている前駆細胞の p53.......

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開示事項

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著者が明らかに何もありません。

謝辞

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この作品は、国立心臓、肺、血液研究所助成金 RO1-HL-99507、によって部分で支えられた HL-114120 UO1 HL-134764 (j. 張) に、HL138023、HL 131017、アメリカ心臓協会の科学的な開発補助金 17SDG33670677 (R. Kannappan) します。

....

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
0.25% トリプシンコーニング25200056
8 ウェルチャンバースライドMillicellPEZGS0816
AccutaseStemcell Technologies7920細胞剥離液
Alexa Fluor 488 AffiniPure
Donkey Anti-Rabbit IgG		Jackson Immuno
Research Laboratories		711-545-152
(RRID: AB_2313584)
ウシ血清アルブミンSigma-AldrichA7906
Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG JacksonImmuno
Research Laboratories		711-165-152
(RRID:AB_2307443)
DAPISigma-AldrichD9564
Gibco B-27 Supplement, Serum Free,Gibco17504-044
Matrigel growth factor reducedCorning354230
mTeSR1Stemcell Technologies85850
PhalloidinA488Life TechnologyA12379
リン酸化ヒストン H2A.X (Ser139) AntibodyCell Signaling Technology2577 (RRID: AB_2118010)
RPMIGibco11875-093
SYBR グリーンI核酸ゲル染色剤Sigma-AldrichS9430
Triton X-100Fisher scientificBP151-100
UltraPure 低融点Agarose Invitrogen16520050
VectashieldVector LaboratoriesH-1000退色防止
剤

参考文献

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  1. Bolli, R., et al. Cardiac stem cells in patients with ischaemic cardiomyopathy (SCIPIO): initial results of a randomised phase 1 trial. The Lancet. 378 (9806), 1847-1857 (2011).
  2. Makkar, R. R., et al.

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タグ

Gamma H2AXDNAiPSCellProfiler

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