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方法論記事

サイト指示された突然変異誘発のため生体外でそしてエシェリヒア属大腸菌の RNA 相互作用に代表される生体実験

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DOI:

10.3791/58996

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2019年2月5日

 ,  , 
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of Southern Denmark

この記事について

サマリー

サイト指示された突然変異誘発は、デオキシリボ核酸 (DNA) の特定の突然変異を導入する技術です。このプロトコルは、2 ステップでサイト指示された突然変異誘発を行う方法をについて説明し、3 ステップのポリメラーゼの連鎖反応 (PCR) ベースのアプローチは、興味の DNA のフラグメントに適用可能であります。

要約

サイト指示された突然変異誘発は小さな非コーディング リボ核酸 (スルナ) 分子と対象のメッセンジャー Rna (Mrna) の相互作用を調査するため DNA の特定の突然変異を導入するための技術です。さらに、サイト指示された突然変異誘発は RNA 特定の蛋白質の結合サイトにマップされます。突然変異の 2 ステップ、3 ステップ PCR によって基づく概要を説明しています。アプローチはすべての蛋白質と核酸と RNA 相互作用の研究に関連します。一言で言えば、テクニックが必要な遺伝と突然変異を PCR の製品を合成 PCR の 2 または 3 の手順をプライマーの設計に依存します。PCR の製品は、クローニングのため使用されます。ここでは、両方の 2 と 3 のステップ アプローチ、スルナ、岩国、mRNA、 csgD RNA、RNA 蛋白質の相互作用を調査するために突然変異を導入するとサイト指示された突然変異誘発を実行する方法をについて説明します。RNA の相互を調査するこの手法を適用します。しかし、技術は、すべての突然変異誘発の研究 (DNA 蛋白質の相互作用、アミノ酸置換/削除/追加など) に適用されます。非天然基地を除いて突然変異のあらゆる種類を導入することが可能だが、テクニックは下流のアプリケーション (例えば、クローニングとさらに PCR のテンプレート) の PCR の製品を使用できる場合のみ。

概要

DNA は、セルのすべての構造は、DNA のシーケンスにエンコードから、一般に、生きている細胞の設計図と呼ばれます。正確なレプリケーションおよび DNA 修復機構は、唯一の非常に低率の突然変異が発生し、コード化された遺伝子の正しい機能を維持するために不可欠であるを確認します。DNA シーケンスの変更は、RNA (塩基対の相補性と二次構造変化) やタンパク質 (アミノ酸、DNA (転写因子と制限酵素によって認識)、始まるさまざまなレベルで連続的な機能に影響を及ぼす酸の置換、削除、追加またはフレーム シフト)。多くの突然変異は遺伝子の機能を大きく影響しません、DNA の変異の巨大な影響があります。したがって、サイト指示された突然変異誘発は、すべてのレベルで特定の DNA のサイトの重要性を研究するための貴重なツールです。

このプロトコルでは、特定の突然変異を導入するために使用対象となる突然変異誘発方法について説明します。プロトコルは、2 つの PCR 戦略: 2 ステップ、3 ステップ PCR。2 ステップ PCR は望ましい突然変異が 5' 端または興味の DNA の 3' 末端に近い場合は該当する (< 端から 200 塩基対 (bp)) と 3 ステップ PCR はすべての場合に適用されます。

2 ステップ PCR のアプローチで 3 プライマーを (プライマー 1 と 3、前方および逆引き、それぞれ)、興味の DNA を増幅するプライマーの 1 つのセットを設計、単一のプライマーは突然変異を組み込む設計されています。3' 端に近い場合は突然変異変異を 5' 末端と前方方向に近い場合 (プライマー 2) プライマーの導入変異が逆向きに必要です。最初の PCR のステップでは、プライマー 1 + 2 または 2 + 3 はそれぞれ 5' 末端もしくは 3' 末端、近くの小さな断片を増幅します。結果として得られる PCR の製品はプライマー 1 または 3、(図 1 a) の興味の DNA の変異を PCR の製品の結果を 2 つの手順でプライマーとして使用されます。

3 ステップ PCR のプライマーの 1 つのセットは (プライマー 1 と 4 は、前方および逆引き、それぞれ) 興味の DNA を増幅するため設計されています 4 プライマーが設計されています、相補性を重複で特定の突然変異を組み込むように、プライマーの 1 つのセット(プライマー 2 と 3 は逆し、転送、それぞれ)。手順 1 と 2、1 + 2、3 + 4 のプライマーが 5' と 3' 端を増幅します。ステップ 3 で結果として得られる PCR の製品からステップ 1 と 2 つのテンプレートとして使用し 1 + 4 のプライマーで増幅します。したがって、結果として得られる PCR の製品は望ましい突然変異 (図 1 b) と興味の DNA です。

変異する DNA は、任意のダウン ストリーム アプリケーションの使用できますが、このプロトコルはクローニング ベクトルに DNA を再結合する方法について説明します。クローニングの使用クローン作成の容易さなどいくつかの利点がありますとベクターの機能に応じて実験用途。この機能は RNA 相互作用研究のためよく使用されます。RNA 相互作用研究のための別のテクニックは別 RNA1,2または蛋白質3,の4との複合体の RNA の構造を探るします。ただし、構造プローブのみ実行される体外サイト指示された突然変異誘発と後続のクローニングが生体内での相互作用研究の許可。

サイト指示された突然変異誘発は、ここで示す RNA 相互作用研究のため広く使用されています。ただし、キーメソッドについて 2- または 3 ステップ PCR は DNA のどの部分に適用され、従って RNA 相互作用の研究だけでなく限られました。

技術とその用途を例示、 csgD、 エシェリヒア属大腸菌(E. 大腸菌) の mRNA の転写後調節に重要な領域の評価を使用します。エシェリヒア属大腸菌、csgDで狙われてる小さな非コーディングの RNA、岩国、Hfq、CsgD2,4、5の発現を抑制する蛋白質と協力。技術を使用して、 csgDと、岩国基地ペアリング地域とcsgDの Hfq 結合部位に変異を導入します。得られた DNA は、その後の実験に適したベクターにクローンを作成します。技術の下流のアプリケーションには、生体内および生体外での実験が含まれます。図では、例 1 の西部のしみのアッセイを用いた生体内の特徴は、例 2 は電気泳動の移動性シフト試金 (EMSA) を使用して生体外の特徴です。両方のケースでそれは図解方法サイト指示された突然変異誘発は興味の遺伝子の生物学的結論を出すために他の技術との組み合わせで使用できますです。

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プロトコル

1. ベクトルの選択

  1. 下流の実験を実行するベクトルを選択します。任意のベクトルは、この 2 と 3 ステップ PCR 法に適用されます。
  2. ベクトルの選択に基づき、適切な制限の酵素のクローニングのためを選択します。

2. プライマー設計は、サイトを指示しました。

  1. 2 段または 3 段のいずれかの PCR 戦略の間に決定 (2 ステップは、突然変異だけ < 200 興味の DNA の両端から bp)。2 ステップ PCR のステップ 2.2 に移動し、3 ステップ PCR ステップ 2.3 を参照してください。
  2. 2 ステップ PCR のためのプライマーを設計します。
    1. 軒の出を 1 と 3 と 5' 興味の DNA を増幅するプライマーの設計には、選択したベクトルにクローンを作成する必要に関連する制限の認識サイトが続く 4 ヌクレオチド (例えば、ATAT や agct 2008 年 7) が含まれています。
    2. 目的のサイトで遺伝を紹介し、フランクの両側に 10-15 相補的なヌクレオチドと突然変異 2 プライマーを設計します。プライマーの 5' 端に突然変異が導入された場合は逆を行うまたは 3' 端に突然変異が導入された場合の転送。
  3. 3 ステップ PCR のためのプライマーを設計します。
    1. 軒の出を 1 と 4 と 5' 興味の DNA を増幅するプライマーの設計には、選択したベクトルにクローンを作成する必要に関連する制限の認識サイトが続く 4 ヌクレオチド (例えば、ATAT や agct 2008 年 7) が含まれています。
    2. 2、目的サイトで遺伝を紹介し、両側に 10-15 相補的なヌクレオチドによる突然変異の側面 3 プライマーを設計します。プライマー 2 と 3 が逆に補完。

3. 野生型 DNA のクローニングのための pcr

注: PCR の詳細については、6を参照してください。

  1. 1 + 2 (2 ステップ PCR) または 1 + 4 (3 ステップ PCR) のプライマーを用いて PCR6を実行し、表 1に PCR プログラム PCR 製品 I. 使用を入手する野生型 DNA をテンプレートとして使用します。
  2. Agarose のゲルの電気泳動で PCR を検証します。
    1. 1 x トリス酢酸エチレンジアミン酸 (EDTA) (妙) バッファーの 100 mL あたり寒天 2 g を追加することによって、agarose のゲル溶液 (2%) を作る。電子レンジで沸騰させることによって、アガロースを溶解します。臭化エチジウム DNA 染色染料を追加 (の最終的な集中に 〜 0.5 μ G/ml) に agarose のゲルの可視化のためのソリューション。
    2. Agarose のゲルをキャスト、電気泳動部に配置し、負荷 (DNA 読み込み染料と混合) PCR サンプルとサイズがわかっている DNA の梯子。バンド適切に区切られ、紫外線 (UV) テーブルでまたはイメージング システム ゲルのバンドを可視化するまで、75 W、45 分間またはサンプルを実行します。
  3. ゲル抽出キット (材料表) の PCR の製品の浄化し、分光光度計 (材料表) の浄化された DNA の濃度を測定します。
  4. 使用されるステップ 5 まで (トリス EDTA (TE) バッファー-長期ストレージ) に-20 ° c または 4 ° C (dH2O-短期記憶) で浄化された DNA を格納します。

4 PCR、DNA のサイト指示された突然変異を導入するには

  1. 2 ステップ PCR のための PCR (3 ステップ PCR のステップ 4.2 を参照)
    1. 突然変異は、5' 端または 2 + 3 の突然変異が、3' 場合は、終了し、野生型 DNA の PCR の製品 II を取得するテンプレートとして使用する場合、1 + 2 のプライマーを用いて PCR6を実行 (PCR プログラムのテーブル 1を参照)。
    2. 3.2.1、3.2.2 ステップのようにアガロース電気泳動で PCR を検証します。
    3. ゲル抽出キット (材料表) の PCR の製品の浄化し、分光光度計 (材料表) の浄化された DNA の濃度を測定します。
    4. ストアは、-20 ° c (TE バッファー) でまたは (dH2O) の 4 ° C で使用されるステップ 5 まで DNA を精製しました。
    5. PCR6突然変異が、5' 末端もしくはプライマー 1 突然変異 3' 末端にあり、野生のタイプ III の PCR の製品を取得するテンプレートとして DNA を使用して場合 II プライマー 3 と一緒にプライマーとして PCR の製品を使用してを実行 (PCR プログラムのテーブル 1を参照)。
    6. 3.2.1、3.2.2 ステップのようにアガロース電気泳動で PCR を検証します。
    7. ゲル抽出キット (材料表) の PCR の製品の浄化し、分光光度計 (材料表) の浄化された DNA の濃度を測定します。
    8. 精製した DNA をステップ 5 まで (TE バッファー) に-20 ° c または 4 ° C (dH2O) の店。
  2. 3 ステップ PCR のための PCR
    1. 別の反応で 1 + 2、3 + 4 のプライマーを用いて PCR6を実行し、野生型 DNA を PCR の製品を取得するテンプレートとして使用する II および III (PCR プログラムのテーブル 1を参照)。
    2. 3.2.1、3.2.2 ステップのようにアガロース電気泳動で Pcr を検証します。
    3. ゲル抽出キット (材料表) の PCR の製品の浄化し、分光光度計 (材料表) の浄化された DNA の濃度を測定します。
    4. ストアは、(TE バッファー) に-20 ° c または 4 ° C (dH2O) の DNA を精製しました。
    5. 1 + 4 のプライマーを用いて PCR6を実行し、(同じ反応) でテンプレートとして両方の PCR の製品は II および III の 2-5 ng を使用して PCR 製品 IV (PCR プログラムのテーブル 1を参照)。
    6. 3.2.1、3.2.2 ステップのようにアガロース電気泳動で PCR を検証します。
      注: 珍しくない (時々 減らせる少ないテンプレートを使用して) いくつかの不正なバンドを取得します。ただし、不適切な PCR の製品は正しく大きさで分類されたバンドはゲル抽出と場合無視できます。
    7. 正しい場合は、ゲル抽出キット (材料表) の PCR の製品を浄化し、分光光度計 (材料表) で浄化された DNA の濃度を測定します。
    8. 精製した DNA をステップ 5 まで (TE バッファー) に-20 ° c または 4 ° C (dH2O) の店。

5. 野生型と選択したベクターに DNA の突然変異のバージョンの再結合

注: 次の手順の詳細については、7を参照してください。

  1. ダイジェスト PCR 産物を精製は、I と III (2 ステップ PCR) から IV (3 ステップ PCR) から関連する制限酵素の使用および/または。
    1. 各制限の酵素、30-60 分の 37 ° C で PCR の製品のダイジェスト 200 ng の 1 μ L 消化バッファー x 1 の 20 μ L で。
  2. ゲル抽出キット (資材表) を用いたゲル抽出による消化液の PCR の製品を浄化する、分光光度計 (材料表) の浄化された DNA の DNA 濃度の測定、-20 ° c (TE バッファー) でまたは (dH2 で 4 ° C 保存O) ステップ 5.6 に使用されるまで。
  3. 精製されたベクター関連の制限の酵素と消化し、ベクトル再イベントを減少するアルカリホスファターゼを扱います。アルカリホスファターゼと PCR の製品を扱うことはありません。
    1. 消化バッファーを各制限酵素の 1 μ、1 μ L アルカリホスファターゼ、30-60 分の 37 ° C でベクターのダイジェスト 1,000 ng の x 1 の 30 μ L で。
  4. 廃棄物の DNA (ノーカット ベクトルとカットされた DNA など) から別の消化ベクトル 3.2.1、3.2.2 ステップのようにアガロースゲル電気泳動を使用して。
  5. ゲル抽出キット (資材表) を用いたゲル抽出によって消化されたベクトルを浄化、分光光度計 (材料表) の浄化された DNA の DNA 濃度の測定 (TE バッファー) に-20 ° c または 4 ° C (dH2O) で保存までステップ 5.6 を使用しました。
  6. 表 2に指定された反応と消化のベクトルに消化液の PCR の製品を縛る。
  7. 2 h または 16 ° C で一晩室温でインキュベートします。
  8. ライゲーション反応を受信者ひずみ (例えば、エシェリヒア属大腸菌K12) を変換します。
    1. 外径600株を成長 = 0.3-0.5 と転送 1 mL 文化リガーゼの反応として多くの 1.5 mL チューブに。
    2. 3,500 x gで 5 分で回転し、上澄みを廃棄します。
    3. 200 μ L の変換バッファー (0.1 グラム/mL のポリエチレング リコール 3350、5% ジメチル硫酸塩および 20 mM MgCl2ホストゲノム スープ (LB) の 10 mL) で細胞を再懸濁します。
    4. Ligation の反作用を追加し、30 分間氷の上にチューブを置きます。
    5. 42 ° c. で 2 分間熱衝撃を与える
    6. 1.5 mL チューブにポンドの 1 つの mL を追加し、37 ° C で少なくとも 45 分の抗生物質耐性の形質発現を許可
    7. 3,500 x gで 5 分で細胞をスピン、培養上清 1 mL を破棄し、残りの上清に細胞を再懸濁します。
    8. 適切な抗生物質で板の細胞をプレートし、37 ° C で一晩インキュベート
  9. 形質転換体 (例えば、ベクトルと挿入特定のプライマーを用いた PCR) によって DNA 挿入の統合の成功とベクトルをかくまっているを識別します。
  10. サンガーによる DNA のシーケンスの検証シーケンス。
    注意: は、5.9 のステップのシーケンスの同じプライマーを使用しないでください。

6. 生体外でまたは生体内で実験のため構築されたベクトルを使用して

  1. 生体内で実験
    注: これは野生型・変異 RNA 転写後調節の特徴を表現するベクトルの使用例です。西部にしみが付くことの詳細は、「8」を参照してください。
    1. 適切な培地で構築されたベクトルを持つ大腸菌K12 株を成長し、必要な場合は、式を誘導します。サンプルを遠心分離によって収穫します。
    2. SDS のサンプルバッファー x 1 の細胞ペレットを溶解することによりナトリウム dodecyl 硫酸塩-ポリアクリルアミドゲル電気泳動 (SDS-PAGE) 用のサンプルを準備 (62.5 mM トリス塩酸 pH 6.8, 2.5% SDS 0.002% ブロモフェノールの青、5% β-メルカプトエタノール、10% グリセロール) と 5 95 ° C で沸騰分。
      注: それはゲルをキャストまたは市販プレキャスト ゲルを使用することが可能です。後者の結果は、図 3 (材料表) の提示で使用されました。
    3. 個別の井戸 (蛋白質の梯子を含む)、各サンプルの 107ロードセルし、タンパク質分離 (約 45 分) まで 200 V でゲルを実行します。
    4. 80 でセミドライ転送によるセルロース膜にタンパク質のしみ 1 h mA。
    5. 膜蛋白質 (例えば、5%-粉ミルク 1 x Tween 20 含有トリス緩衝生理食塩水 (TTBS) バッファーに溶解) の混合物をブロックします。
    6. 一次抗体 (1 x TTBS バッファーに溶解) (例えば、GFP、旗、または HIS タグ付きタンパク質) の興味の蛋白質をターゲットし、穏やかな攪拌で 1 時間インキュベートを追加します。
    7. 非連結の抗体を削除する 10 分の 1 x TTBS で膜を洗浄します。2 回以上を繰り返し。
    8. 一次抗体を対象とする (1 x TTBS バッファーに溶解) 二次抗体を追加し、検出を可能にする (例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ (HRP)-標識二次抗体。穏やかな攪拌で 1 時間インキュベートします。
    9. 非連結の抗体を削除する 10 分の 1 x TTBS の膜を洗浄します。2 回以上を繰り返し。
    10. (例えば、HRP 標識二次抗体を使用していた場合ルミノール由来の化学発光イメージング培養後) によって二次抗体と互換性のある技術と膜を視覚化します。
  2. In vitro 実験
    注: これは RNA 蛋白質の相互作用を特徴付けるための RNA 生体外のトランスクリプションのためのテンプレートとしてベクトルを使用しての例です。EMSA の詳細は、「9」を参照してください。
    1. テンプレートとして試験管内転写キット (材料表) のステップ 5 からベクトル T7 を使用して生体外のトラン スクリプトを確認します。
    2. 7 M の 4.5% 尿素変性ゲルのページによって RNA 転写産物を分離し、ゲルから直接透析チューブ (材料表) 電気溶出によって RNA を抽出します。
    3. RNA のラベル (例えば、γ-32P ATP とカイネティックス T4 ポリヌクレオチド キナーゼ (資材表) を使用して、列 (テーブルの材料) で再び浄化します。
      注意: 放射性物質を扱う前に局所放射線安全担当者とご相談ください。
    4. 結合バッファー (トリス、pH 8、100 mM KCl、1 mM MgCl2、1 mM ジチオトレイトール (DTT) 20 mM) x 1 の別の反応中のタンパク質の濃度の増加と標識 RNA をミックスします。
      注: 結果が発表される (図 4)、2 で 0 に 2 μ M Hfq 蛋白質 (モノマー濃度) のグラデーションと mRNA が混在した標識の csgD の nM。
    5. タンパク質と RNA 非変化のポリアクリルアミドゲルの交配の組合せをロードする前に交配させるし、200 V で 1.5 h のためのゲルを実行するを許可します。
    6. 6.1.3 のステップからラベリングと互換性のある手法でゲルを視覚化します。(例えば、によって phosphoimaging カイネティックスを適用した場合)。
    7. イメージング処理プログラムでシフトのバンドの相対強度を定量化し、グラフを使用してデータに曲線 (字) およびデータ解析ソフトウェア (材料表) に適合。近似曲線に基づき、解離定数 (Kd) はソフトウェアで自動的に決定されることができます。

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結果

CsgD、二重ベクトル セットアップが選ばれたの転写後調節に関する RNA 相互作用を調査する: csgDを表現する 1 つ mRNA、別の小さな非コーディングの RNA、岩国を表現します。csgDはクロラムフェニ コール耐性とアラビノース誘導媒体コピーのプラスミッドである pBAD33 に複製され、岩国はイソプロピル β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) 誘導低コピー プラスミドであるミニの R1 pNDM220 に複製されたとアンピシリン抵抗。野生型csgDは PCR によって増幅されるプライマー 1 a と 4 a を使用して (4 a にはフラグ シーケンスが含まれています) 野生型岩国は PCR によって増幅される PCR 製品 IB を行うプライマー 1 b と 4 b を使用して PCR 製品 IA を生成します。3 ステップ PCR 戦略を用いてcsgDと岩国.の予測ベース ペアリング領域置換を導入2 つの最初の手順で...

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ディスカッション

サイト指示された突然変異誘発、さまざまなアプリケーションの広範な配列がありここでは、典型的な結果を in vivo と in vitro の実験からの手法を用いて生物学的結論の作り方の例として含まれていた。サイト指示された突然変異誘発は長い RNA 相互作用研究の黄金の標準をされています。技術の強みは下流の試金との遺伝子産物の機能の DNA の特定のサイトとその重要性についての結論を描画するための実験 (例えば、西部のしみまたは EMSA) 関連する変異導入の組み合わせで質問です。技術からほとんどを得るためにプライマーの設計を慎重に計画する必要がありますサイト指示された突然変異誘発を行うに決定するとき (例えば変異するサイト);必ず正しいオーバー ハングし制限のサイト/プライマー/テンプレートの特性に注意を払います。

このプロトコルで記述されている実際の突然変異誘発 PCR に依存しています。プロトコルの最も重要な部分は従ってこれのための条件です。Mg2 +濃度、DMSO 濃度およびアニーリング ・ ステップの温度の勾配を含む PCR の最適化のいくつかの方法...

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開示事項

著者は競争の興味を宣言しません。

謝辞

著者は、南デンマーク大学オープン アクセス ポリシー付与を感謝したいです。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
ウサギで産生された抗GroEL抗体メルクG6532一次抗体
Azure c200AzureNAゲルイメージングワークステーション
カスタムDNAオリゴメルクVC00021
DeNovix DS-11DeNovixNA核酸測定用分光光度計
DNAゲルローディング色素 (6倍)Thermo ScientificR0611
エチジウムブロマイド溶液 1 %Carl Roth2218.1
GeneJET ゲル抽出キットThermo ScientificK0691
GeneRuler DNA Ladder MixFermentasSM0333
Gerard GeBAflex-tube MidiGerard BiotechTO12電気溶出用透析チューブ
MEGAscript T7 転写キットInvitrogenAM1334
Mini-Sub Cell GT CellBio-Rad1704406水平電気泳動システム
モノクローナル ANTI-FLAG M2 抗体 マウスで産生メルクF3165一次抗体
マウス免疫グロブリンDako CytomationP0447HRP 標識二次抗体
NucleoSpin miRNAMacherey Nagel740971RNA 精製
NuPAGE 4-12% Bis-Tris タンパク質ゲルThermo ScientificNP0323BOXタンパク質分離用Bis-Trisゲル
Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer NewEngland BiolabsM0531SDNA ポリメラーゼ
PowerPac HC 大電流電源Bio-Rad1645052
Rabbit ImmunoglobulinsDako CytomationP0448HRP conjucated二次抗体
SeaKem LE AgaroseLonza50004
SigmaPlotSystat Software IncNAグラフおよびデータ分析ソフトウェアツール
T100 ThermalCycler Bio-Rad1861096PCR machine
T4 DNA ligaseNew England BiolabsM0202Ligase
T4 Polynucleotide KinaseNew England BiolabsM0201S
TAEバッファー(トリス-アセテート-EDTA) (50X)Thermo ScientificB49

参考文献

  1. Bouvier, M., et al. Small RNA binding to 5' mRNA coding region inhibits translational initiation. Molecular Cell. 32 (6), 827-837 (2008).
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  4. Andreassen, P. R., et al. sRNA-dependent control of curli biosynthesis in Escherichia coli: McaS directs endonucleolytic cleavage of csgD mRNA. Nucleic Acids Research. , (2018).
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