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方法論記事

極薄ポリジメチルシロキサン マイクロ流体チップを用いた保水ライブ線虫個人の固定化

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DOI：

10.3791/59008

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2019年3月19日

 ,  , 
1Department of Radiation-Applied Biology Research, Takasaki Advanced Radiation Research Institute, National Institutes for Quantum and Radiological Science and Technology (QST-Takasaki)

この記事について

サマリー

生きている線虫のターゲット照射を許可する一連の固定化メソッドが確立されている保水性を持つチップの最近開発された超薄型ポリジメチルシロキサン マイクロ流体を使用して、個人。新規チップ上への固定化してイメージング観測に適しています。詳細な治療とチップのアプリケーション例を説明しています。

要約

イオンビーム育種および生物学的には放射線、広く、これらの方法のマイクロビーム照射は生物に放射線感受性のサイトを識別する強力な手段を表します。本稿では、線虫の生きている個人のターゲットを絞ったマイクロビーム照射のため開発されたチップ上への固定化方法のシリーズについて説明します。特に、我々 は以前麻酔の詳細を説明するためにc. の elegansを必要とせず個人を固定するために開発ポリジメチルシロキサン (PDMS) マイクロ流体チップの治療。ワーム シートと呼ばれる、このチップは弾力性のあるマイクロ チャネル拡大することを許可して弾力性により、動物に優しく包まれます。また、PDMS の自己吸着能力により動物で密封できるチャンネル、動物はプッシュされないチャネルにエンクロージャの薄いカバー フィルム付きワーム シートの表面を覆うことによって。カバー フィルムを回して、簡単に動物を収集できます。さらに、ワームのシートは保水性を示し、 c. の elegans個人ライブ条件下で長時間観察を受けることができます。さらに、シートはのみを検出するイオン粒子がように動物を囲むシートを通過する炭素イオンなどの重イオン応用線量を正確に測定でき、厚さ 300 μ m です。動物を囲むために使用カバー フィルムの選択は成功した長期的な固定化のため非常に重要な適したカバー フィルムの選択を行い、いくつかの映画の中で推奨されるものを示した。チップのアプリケーション例として紹介したマイクロビーム照射と同様に、ワーム シートのマイクロ流路を囲む動物の筋活動のイメージング観測。これらの例は、ワーム シートが生物学的実験の可能性を大きく拡大していることを示します。

概要

がんの診断と治療、生物学的アプリケーションとイオンビーム育種、放射線、x 線、ガンマ線、重イオンビームなどが使用されています。多くの研究と技術開発は、現在放射線1,2,3の効果に着目します。マイクロビーム照射体内放射線感受性のサイトを識別する強力な手段である生物4。高崎高度な放射線研究所の国立機構量子放射線科学と技術 (QST-高崎) は重イオンビームを用いた顕微鏡下で細胞に照射する技術を開発されました。マイクロビーム5、線虫4,6線虫、カイコ7、メダカなどのいくつかのモデル動物のターゲットを絞ったマイクロビーム照射を可能にする方法を確立しています。学(メダカ)8。線虫のc. の elegansのターゲットを絞ったマイクロビーム照射では、歩行などのプロセスにこれらのシステムの役割を識別するために役立つ、頭部の神経リングなど、特定の地域の効果的なノックダウンをことができます。

マイクロビーム照射4を許可する線虫麻酔を必要とせず個人のチップで固定する方法をしました。さらに、以前の研究4で使用されているマイクロ流体チップを改善するために最近開発したワーム (材料の表を参照) のためのシートと呼ばれる水和剤、イオン不可解、ポリジメチルシロキサン (PDMS) マイクロ流体チップ線虫 c. エレガンス個人9を固定します。これらは極薄の柔らかいシートの構成 (厚さ 300 μ m = 幅 = 15 mm 長さ = 15 mm) (20 または 25) ストレート マイクロ チャンネルで複数 (深さ = 70 μ m 幅 = 60 μ m または 50 μ m 長さ = 8 mm) 表面 (図 1の D)。マイクロ チャネルが開いているし、同時にそれらで囲む複数の動物を許可する (図 1E)。シートは弾力性のあるマイクロ チャネル (~ 10%、図 1F) によって拡大することを許可して弾力性により、動物に優しく包まれます。また、PDMS の自己吸着能力により動物で密封できるチャンネル、動物はプッシュされないチャネルにエンクロージャの薄いカバー フィルム付きワーム シートの表面を覆うことによって。カバー フィルムを回して、簡単に動物を収集できます。

囲まれてされているとき、または収集される場合、チャネルは、ワームを傷つけることはありません。さらに、シートは、本質的に疎水性である PDMS から作られていますが、保水性は素材に親水性を付与によって達成することができます。保水性と厚さは、ワームのシートの良好な特性です。保水容量長期安静後の動物の脱水を防ぐことができますができ実施される長期観察。

さらに、9を前述のよう、シートは、のみ 300 μ m 厚い、動物を囲むシートを通過する (水に約 1 mm の範囲) と炭素イオンなどの重イオンを許可します。これにより検出されるイオン粒子と応用の線量を正確に測定します。さらに、ワームのシートは再利用することができますして経済的なためします。従来の注入法で囲まれた動物が死んだ時とチャネルから取得できません。彼らの卵は、チャネルを詰らもことができます。これはチップを使用できなくなります。チップは、したがって、基本的には使い捨てと費用便益比が悪い。

本稿で述べる一連の生きている線虫のチップの固定化のためのメソッド ワーム シートを使用して、個人。動物のオンチップ固定後 3 h の歩行分析を通じて適切なカバー フィルムを評価しました。さらに、撮像観測とマイクロビーム照射のためのオンチップ固定化の例を示した。

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プロトコル

1 系統およびメンテナンス

  1. 実験の目的に応じて線虫および大腸菌(食品) の適切なひずみを選択します。
    注: 本研究では野生型 N210線虫(図 2A) が一般に使わし、HBR4:goeIs3 [pmyo-3::GCamP3.35::unc-54 - 3' utr、unc-119(+)] V11アッセイをイメージングのみ採用します。エシェリヒア属大腸菌OP50 はc. の elegansのための食糧として使用されました。いくつかの変異、コイル形状 (図 2B) unc-119(e2498) III変異などの異常なボディ形状もストレート マイクロ チャネル (図 2C) で囲むことができます。
  2. 6 cm シャーレ一晩インキュベート (37 ° C)エシェリヒア属大腸菌10.を前述のように広がり線虫培 (NGM) 10 mL の 20 ° C にc. の elegansを維持します。可能であれば、胚段階から線虫の発育を同期します。
  3. 飽食の大人動物程度の幅で孵化後約 3-4 日を使用して 50-60 μ m、ワーム シート マイクロ流路のサイズに最適であります。

2. チップの固定化のため緩衝液の選択

  1. 水和剤ワーム シート、実験の目的によって、緩衝液を使用します。
    注: 以前9に PDMS マイクロ流路チップはずっと上チップの固定化のための適切なバッファー ソリューションが定義されており、次の緩衝溶液は、固定後は動物の運動に効果がないように示されていた: S 基底バッファーソリューション (5.85 g, 塩化ナトリウム 1 mL コレステロール (エタノールで 5 mg/mL) の 1 M pH 6.0 リン酸カリウム、H2O 1 L に 50 mL、オートクレーブによる滅菌)10 M9 リン酸緩衝液 (5 g の塩化ナトリウム NaCl の大規模な量を含む、KH2PO4の 3 g、6 g の Na2HPO4、1 M MgSO4、H2O 1 L に 1 mLオートクレーブによる滅菌)10、洗浄緩衝液 (1 M リン酸カリウム pH 6.0 の 5 mL、1 mL の 1 M CaCl2、1 M MgSO4、0.5 g pf ゼラチン、H2O 1 L に 1 mL オートクレーブによる滅菌)12ゼラチンを含む、と純水9。本論文では洗浄緩衝液が使用され S 基底緩衝液はセクション 3 で別のカバー フィルムを使用してチップを固定化を評価するため採用のみ。
  2. 濡れせず従来のマイクロ流体チップ用洗浄緩衝液、チップのマイクロ チャネル中の水分を維持するための最も効果的な手段を提供し、 c. の elegans個人 (の乾燥を防止すること関係なく、マイクロ流体チップのヌレ性)。

3. チップ上への固定化に適したカバー フィルムの選択

  1. とおりの異なるカバー フィルムを準備します。透明、以下をカット、取り扱いの容易さに基づいて適切なサイズ (つまり10-15 mm の幅と 30 〜 50 ミリメートルの長さ) に生体適合性のカバー フィルム: 130-170 μ m 厚いカバーガラス、125 μ m 厚ポリエステル (PET) フィルム、および ~ 130 μ m 厚のポリスチレン (PS)映画。
  2. 3 h のオンチップ固定化次のように別のカバー フィルムを使用してを実行します。4.1-4.6 のステップに基づいて, 各カバー フィルムを使用してワーム シートに大人動物 (孵化後 3.5 日) を洗浄 ≥10 を囲み、3 h のまま。
  3. 比較のために、次のとおり無料運動の 3 h を許可します。場所 ≥10 3 mL を含む 3.5 cm プレートに大人動物を洗浄する新鮮な NGM、蓋をして、3 時間を残します。
  4. 5.1 5.3 の手順に従ってチップの固定の 3 h の直後に動物を収集します。ワームのシートからカバー フィルムを外し、それぞれの動物に緩衝液のドロップを追加します。プラチナ選択を用いた液滴の水泳の動物をピックアップし、3 mL を含む 3.5 cm プレートに転送する食べ物 (アッセイ プレート) がなくても新鮮な NGM。
  5. 動物を収集すると、自由な動きの 3 時間後。それぞれの動物に緩衝液のドロップを追加します。NGM 板上液滴中で水泳の動物をピックアップし、プラチナ ピッカーを使用してくださいアッセイ プレートに転送しています。
  6. カバー フィルムの運動 (歩行法) に及ぼす影響を評価します。
    1. アッセイ プレート、カウントに転送後、少なくとも 5 分 ' 体の曲がりの (20 の間隔で体前葉地域のベンドの数としてかわる)13の顕微鏡の下で手動で。
    2. 実施運動アッセイを 5 回独立して各カバー フィルムのため。
      注: 代表の結果に示すように実験、10 動物が各実験で複数の動物囲まれた同時に以前の研究13カウントのみ 5 つの動物と比較して評価しました。
    3. グループごとに、それぞれの実験で 10 の動物の体の曲がりの数の平均値を計算します。チップ上への固定化の効果を評価するための 5 つの独立した実験から値を平均します。0.01 と 0.05 の有意水準で表計算ソフトで統計学的に一方向の分散分析 (ANOVA) テストを使用してデータを分析します。
      注: は、これらの実験に基づき、高い酸素透過性を持つ PS カバー フィルムふさわしいとみなされた (代表的な結果を参照してください)。これらの PS 膜はワームのシートに含まれています。動物とワームのシートに長期固定で覆われて窒息する傾向があったので、低酸素透過性のあるペット フィルムが適したものはありません。また、一連の手順の中にカバー フィルムが壊れないことが重要です。ガラス カバー従ってまたふさわしくなかった (代表的な結果を参照してください)。

4. チップ上への固定化

注: ワーム シートが汚れないように使い捨て、滅菌手袋を着用ください。

  1. 実験机や顕微鏡のステージ上に、下部のカバー フィルムとして使用するための蛍光を持たない PS またはガラスのカバー フィルムなどの薄い透明なシートを配置します。フラット ピンセットを使用して下部カバー フィルムにそっとワーム シートを配置します。
    注: で 60 μ m のマイクロ チャンネル (大人孵化後 3-4 日に適した)、シートをワームの他で 50 μ m ワイド チャンネル (若い大人大人の段階で孵化と小さな体の突然変異体の後 3 日間に適した) シートも使用できます。使用される動物のサイズに基づいて適切なシートを選択します。
  2. 動物を収集するためにプラチナ ピッカーを使用して顕微鏡下で培養プレートから個人アダルト線虫を拾います。複数の動物が必要な場合は、プロセスを繰り返します。
  3. 食品 (細菌) を削除する動物を洗います。
    1. 6 cm 非投与 (撥水) ペトリ皿の表面に緩衝液の少なくとも 3 つの滴 (5 μ L 滴) を配置します。
    2. プラチナ選択を用いた液滴に動物を転送できスイミングですべての食品を除去するために。2 つの独立した水滴で 2 回洗って、別液滴の動物を洗浄します。
      注: それは実験を行う前にそれをすぐに実行できるようにするこの手順を実行する必要です。
  4. ワームのシートの表面に緩衝液の 2-3 μ L をドロップします。ペトリ皿上における液滴から洗浄動物を拾う、ワーム シート上の液滴。
  5. マイクロ流路中に従うよう動物を囲みます。フラット ピンセットを使用してワーム シート上 PS カバー フィルムを置き、湿度 (前述4,9) を維持するために他にシートの端から端までチャネルを優しく押します。
    注: 動物は、チャネルでランダムに囲まれます。動物を含んでいる小滴は、複数のチャネルにわたって延長されて広く液滴の結果シートを覆うことによってワームのシートにまたがっています。各動物は、これらのチャネルのいずれかで囲むことができます。チップの固定化のためワーム シートの使用に関する重要な点は、広範囲にわたって複数のチャネルが利用できることです。
  6. マイクロ チャネルで動物を囲み、直後に顕微鏡下で頭部の動きをチェックして生きているを確認 (例えば1 x または 2 x 倍率)。
  7. 4.6 のステップを行うと同時に動物の位置を記録し、紙 (補足ファイル 1) の専用シートには、次に注意してください: 動物は囲まれているチャネル数それぞれの動物のチャンネル (左、右、中央) に位置頭の方向。
  8. 動物の頭に対応する矢印の方向で、チャネルの各動物の位置をマークするには矢印を描画します。
    注: チャネル番号 (例えば1、5、10、15、20、25) マイクロ流路 (図 1B) の左と右の端に近いワーム シートの表面に刻まれています。専用シートで、この情報を迅速に配置する動物プロセスをより効率的に行うができ、以降の手順の中に放射能漏れを防止にも役立ちます。

5. ワームのシートからの動物のコレクション

  1. 固定後すぐにフラット ピンセットを使用してワームのシートからカバー フィルムを削除します。
  2. 動物を囲むマイクロ チャンネルに 10-15 μ L 緩衝液をドロップし、顕微鏡下滴で泳ぐから動物を観察します。
    注: 動物はせず独自の付加的な圧力、ヘルプ、またはプッシュ新たな液滴で水泳を開始します。ちょうどその上にいくつかのバッファーは、チャネルから泳ぐように十分です。動物は、それが破損した場合極めて 7.9 の手順で照射すること 4.2 4.5 の手順で固定化プロセスによってこれはまれな液滴で泳ぐことができるかもしれません。さらに、動物は、それが削除されたときにカバー フィルムにアタッチしたままは、チャネルの代わりにカバー フィルム上に滴を追加します。
  3. プラチナ選択を用いた液滴に泳ぎに動物をピックアップし、アッセイ プレートの上に置きます。

6. イメージング観測用ワームのシートのアプリケーション

注: のワームのシートは、顕微鏡観察に広く使用できます。チップは水を保持することができます、内蔵固定9の 3 時間後にc. の elegans個人の運動は影響しません。さらに、チップ自体には蛍光、蛍光アッセイでの使用に適してはありません。蛍光イメージングの試金のためのサンプル アプリケーションがあります。

  1. 蛍光顕微鏡を選択し、それぞれのキャプチャ画像や動画を顕微鏡にデジタル カメラやデジタル ビデオ カメラをマウント (図 3A)。
    注: 顕微鏡の作動距離 (WD) は対物レンズの仕様に応じて 0.2 mm 以上 (図 3B、Cを参照)。このペーパーで使用される蛍光顕微鏡システムの仕様は、材料表に表示されます。観測の目的に依存するためただし、仕様は例に限られていないまたは/およびユーザー。
  2. 線虫 c. エレガンスの蛍光緊張を選択し、セクション 1 で説明されているように維持します。
    注: 体壁の筋の収縮を観察する必要があるかどうか (代表的な結果を参照)、若い大人 HBR411c. の elegans、カルシウム インジケーターすべての体壁筋細胞の GCaMP3.35 を表現するレポーターの遺伝子を使用するを使用します。ワーム シートのマイクロ チャネル (50 または 60 μ m) の幅よりも細く若い大人 (孵化後 3 日) を使用することが重要です。クリアランスの小さい程度を意味、動物曲げることができます少し、クロール、中に、筋肉の収縮や拡張を観察することが可能となってカルシウム イオン インジケーターを使用します。
  3. セクション 4 の固定の手順に従って動物の囲い込みを行います。
  4. 動物 (例えば、緑色蛍光蛋白質標識系統) 蛍光顕微鏡を用いた蛍光スポットを観察、顕微鏡にデジタル カメラを使用して画像をキャプチャします。
    注: 顕微鏡観察方法 (蛍光観察を含む) から以前に確立された方法14,15,16に従うし、顕微鏡システムの仕様によって異なります観測の目的。
  5. 画像カルシウム イオン波伝播体壁の筋の収縮と拡張 HBR4 みみず (ビデオ 1) などの動的な活動を観察するためビデオ集録を使用します。

7. マイクロビーム照射用ワームのシートのアプリケーション

注意: コリメート マイクロビーム照射システム5がいくつか重イオン粒子高崎イオン加速器の高度な放射線アプリケーション (ティアラ) 施設のために設置されたさまざまなアジマス フィールド サイクロトロンから加速を使用できます。QST 高崎 (図 4A)。ビーム終了 (図 4B) の下で照射用自動ステージがあります。このシステムを使用してのc. の elegansの重イオンマイクロビーム照射するための手順は次のとおりです。

  1. マイクロビーム照射施設のためのカスタムメイド アルミ フレームに複数の動物を囲むワーム シートを探し、照射 (図 4C) 用自動ステージを設定します。
  2. (すなわちフレームにワームのシートで囲まれた動物)、照射サンプルを上げるすぐ下 (~ 2 mm) ビーム終了自動ステージ (図 4D) の下にある顕微鏡からモニター画像に基づきます。
  3. 縦位置で後、動物および細胞培養の対象となる照射カスタムメイド ソフトウェアを用いたマイクロビーム照射対象それぞれの動物を探します。マイクロ流路で囲まれた各動物ステップ 4.7 ・ 4.8 (補足のファイル 1を参照) に記載されている専用のシートを参照し、チャンネルの左と右の端の近くのチャネル番号を確認します。
  4. レーザー マウス操作照射ソフトウェア x 自動ステージを制御および Y 方向梁の真下に動物を配置するは、リモート コントロール システムを使用して終了します。
  5. 大体曲顕微鏡からの投影を見て、照射面積はサンプルや対象とする動物の照射位置にカーソルを移動の自動ステージの下にあります。
  6. 大まかな位置決め後終了し照射室を閉じるし、演算子を照射を避けるために隣接する制御室に移動します。
  7. コンソールを使用して、動物の特定の領域の照射に対応する 2 つの照射方法のイオン粒子の数は、イオン カウンター システムにリンクされているセットです。
    注: これはコリメート マイクロビーム照射装置でプラスチックのシンチレータと光電子増倍管で構成されます。
  8. 照射制御室から (図 4E) 照射室のモニターに映し出される同じイメージである自動ステージの下にある顕微鏡からモニター画像に基づいて動物の位置を微調整します。
  9. 照射用ソフトウェアの照射ボタン クリックによりマイクロビーム照射の対象します。
    注:図 4Fに示す例では、我々 は頭部で咽頭をターゲットし、マイクロビーム炭素イオンの適切な数と照射します。本体と照射のソフトウェアにリンクされているイオン カウンター システムを使用してサンプルを通るイオン粒子の数が数えられる、ため照射は目的イオン粒子数の配信後停止します。
  10. 専用シートに記録されたそれぞれの動物を検索し、それぞれの動物にターゲットを絞った照射を実施します。7.8 および 7.9 の手順を繰り返して、すべての動物が照射されています。
  11. 照射後すぐに照射室に入るし、自動照射段階を下げます。自動ステージ上にあるフレームのカスタムメイドのサンプルを削除します。
  12. 5.1 5.3 の手順で説明するように、動物を収集します。
  13. 研究の目的に応じて、ターゲットを絞った照射の効果を評価するために行動や分子の解析を行います。
    注: 手順 3.6 で説明した歩行分析、運動4,9に照射の効果を評価するための効果的な方法です。

8. 繰り返し使用するワーム シートの処理

注: ワーム シートをすることができます繰り返し使用に少なくとも 10 回9動物に影響を与える洗浄、次のように使用後正しく滅菌した場合。

  1. クリーニング
    1. 6 cm シャーレに使用されるワームにシートを配置し、シート全体に滅菌超純水の約 100 μ L をドロップします。
    2. パドルを用いたシートの表面の水手袋ほこり、細菌の食品や卵などの汚れを落とすために指のチャンネル レイアウト。
    3. 使い捨ておしりふきを使用して徹底的にワーム シートから水分を拭いてください。
  2. 滅菌
    1. ワーム シートを含むペトリ皿に 70% のエタノールの約 5 mL を注入し、汚れを洗浄する手袋をはめた指を使ってシートの表面をパドルします。
  3. 乾燥
    1. 70% エタノールでいっぱいシャーレからチップを取り外して、自然乾燥することができます。
  4. ストレージ
    1. 乾燥後、滅菌シャーレにワームにシートを配置、それをカバーします。シートは、70% エタノールでいっぱい滅菌シャーレにも格納できます。
      注: それは使用後は、カバー フィルムの処分が、再使用する場合は、それらをきれいようなワームのシートの方が良い。ただし、ひだをカバー フィルムで開発使用後不要になったチップは、動物の脱水の結果に準拠し、そのため交換が必要があります。

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結果

アクティブな極薄、水和剤の PDMS、マイクロ流体チップ (ワーム シート) を使用して正常にc. の elegans個体を固定可能性があります。プロトコル セクション 3 で説明したよう、ワーム シートのシールの別カバー フィルムの適合性を調べた。カバー フィルムのシール効果を評価、カバーガラスを使用してチップを固定後動物 3 h の運動を決定 (厚: 130-170 μ m)、PET フィルム (厚さ: 125 μ m) と PS フィルム (厚さ: ~ 130 μ m)、それぞれ。図 5に示すように、3 h、PS フィルムとワームのシートで囲まれた動物を自由に移動できる対照動物の運動 (体屈曲) の大きな違いはありませんでした。対照的に、運動はカバー ガラスで囲まれた動物に大幅減少しました。いくつかの動物は動物の液滴をカバーガラスに反発を示唆、閉じるシールを防止し、乾いている登場を減らされた運動性の結果として部分的に乾燥。PET フィルムを使用して囲まれた動物の運動性も有意に減少しました。...

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ディスカッション

水和剤 PDMS マイクロ流体チップを用いたライブ条件下でc. の elegansのチップの固定化が複数の動物の効率的なターゲットを絞ったマイクロビーム照射できます。処理と乾燥を防止する機能の使いやすさは、マイクロビーム照射のみならずいくつか行動アッセイのアプリケーションに適してこのシステムを作る。これらのワームのシートはすでに実用化されて、簡単に得ることができます。嗅覚のチップなどの従来のマイクロ チップは、動物と動物を収集するために困難に閉じたマイクロ チャンネルで卵の目詰まりなどの問題に関連付けられている、従ってそのようなチップにより、使い捨てになりがちコストを増加しています。対照的に、現在のワーム シート マイクロ チャネルが開いて動物を収集しやすきます。これらのワーム シートしたがってくり返し使えるより経済的します。

PDMS マイクロ流路チップの最近の技術革新は、構造の複雑さと多面的機能16,18,

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開示事項

著者が明らかに何もありません。

謝辞

著者は博士淳東谷麗の小林泰彦一郎横田と夫妻裕也服部線虫 c. エレガンスの貴重な議論のための治療に関する親切なアドバイスをありがちましょう。著者らは、線虫と大腸菌の菌株を提供する線虫の遺伝子センターをありがとうございます。照射実験とそのような支援、QST 高崎でティアラのサイクロトロンの乗組員に感謝しますこの原稿の下書きを編集して、博士スーザン ファーネスに感謝しますこの調査によってサポートされた部分で科研費 (許可番号 JP15K11921 および JP18K18839) 日本学術振興会から修士号を取得する

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
C. elegans 野生型Caenorhabditis Genetics Center (CGC) , Minnesota, USAN2野生型 C. elegans この研究で一般的に使用されている
C. elegans unc-119(e2498) III mutant strainCaenorhabditis Genetics Center (CGC) , Minnesota, USACB4845C. elegans株は、異常な体型を持つ突然変異体の例としてのみ採用されています 
C. elegans トランスジェニック株 HBR4Caenorhabditis Genetics Center (CGC) , Minnesota, USAHBR4このトランスジェニック C. elegans 株の遺伝子型は HBR4:goeIs3[pmyo-3::GCamP3.35:: unc-54–3フィートutr、UNC-119(+)]V。この株は、画像観察にのみ使用されました。
大腸菌株Caenorhabditis Genetics Center (CGC) , Minnesota, USAOP50E. coli strain used as food for C. elegans
Worm Sheet IR (50/60)Biocosm, Inc., Hyogo, JapanBCM17-0001Microfluidic chip with 25 straight 50/60-µこの論文のすべての実験と観察で使用されたm幅のチャネル 
ワームシート60Biocosm, Inc., 兵庫県, 日本BCM18-0001マイクロ流体チップ 20ストレート 60 & マイクロ;m幅チャネル。これは、20°Cで孵化してから3〜5日後の成虫に座ることができます。
ワームシート50Biocosm, Inc., 兵庫県, 日本BCM18-0002マイクロ流体チップ 20 ストレート 50 & マイクロ;m幅チャネル。これは、20°Cで孵化した後~3日後にyougの成虫に観察可能です。
マイクロカバーガラス松波硝子工業株式会社C030401カバーガラス(厚さ:130-170&マイクロ;m)は、プロトコル3
チレンフィルムBiocosm、株式会社、兵庫、日本のBCM18-0001 / BCM18-0002ワームシートのバンドルアイテム。PSフィリム(厚さ:~130 & マイクロ;m)プロトコル3のロコモーションアッセイで使用されます。
ポリエステルフィルムルミラー東レ株式会社ルミラー T60 (t 125 µm)PETフィリム(厚さ:125 & マイクロ;m) Protocol 3
IWAKI 60 mm/non-treated dishAGC Techno Glass Co., Ltd., Shizuoka, Japan)1010-060のC.elegansの注入に使用された未処理ディッシュ
。1010-035Protocol 3
Milli-QMerck, FranceUltrapure water
Kimwipe S-200日本製紙クレシア株式会社, 東京, 日本62020120 mm x 215 mm; 200 枚/箱
WormStuff Worm PickGenesee Scientific Corporation, CA, USA)59-AWPPlatina ピッカー C. elegans
研究用実体顕微鏡システムOLYMPUS CORPORATION, Tokyo, JapanSZX16本稿の電動フォーカススタンドで使用したすべての実験と観察に使用したマイクロスコープ
OLYMPUS CORPORATION, Tokyo, JapanSZX2-ILLBプロトコル3-8の明視野観察に使用しました。
対物レンズ(×1)オリンパス株式会社、東京、日本SDFPLAPO1×PFNA:0.15;WD:60ミリメートル。これは、プロトコル3-8の明視野観察に使用されました。
対物レンズ(×2)オリンパス株式会社、東京、日本SDFPLAPO2XPFCNA:0.3;WD:20ミリメートル。これ レンズはイメージング観察に使用されました。
水銀光源オリンパス株式会社、東京、日本U-LH100HG広い発光スペクトルにより、すべての一般的な蛍光色素を使用してさまざまな蛍光イメージング実験を行うことができます。
SZX16 蛍光フィルターユニット (YFP用高性能)オリンパス株式会社SZX2-FYFPHQEx: 490-500 nm;em:510-560。これは、HBR4株のイメージング観察に用いました。
デジタルカメラ ハイスピード EXILIMCASIO COMPUTER CO., LTD., TOKYO, JAPANEX-F1 Figure 1B, 1E, 1F, Figure 2A-C, and Video 1 は、このデジタルカメラを使用して取得しました。
Office 2013Microsoft Co. Ltd, Redmond, WA, USA統計分析に用いるEXCELソフト
株ポリス移動アッセイで使用 のロコモーションアッセイに使用)。 プロトコール1 いわき 35mm/無処理ディッシュ AGCテクノグラス株式会社、静岡県静岡県、日本)

参考文献

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