方法論記事

MRNA の構造変化を誘導培養と細胞の形で使用して小分子を調査するには

DOI：

10.3791/59021

⸱

2019年1月30日

 ,  , 
1Calibr, The Scripps Research Institute, 2Department of Integrative Structural and Computational Biology, The Scripps Research Institute

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

RNA を対象とした小分子の存在下で興味の mRNA シーケンスの二次構造を決定するプライマー拡張 (形状) を用いて分析両方生体外でそして細胞の選択的 2'-水酸基のアシル化の詳細なプロトコルします。この記事で紹介しました。

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

RNA を対象とした低分子化合物の医薬品開発の過程でターゲット RNA シーケンスとの相互作用によって構造変化の解明が望まれます。我々 ここの提供、詳細な体外とセルの選択 2' ヒドロキシル アシル化はプライマー拡張によって脊髄性筋萎縮症 (SMA) の生存の実験的な薬の存在下で RNA の構造変化を研究する (形状) プロトコル分析運動ニューロン (SMN)-C2 と SMN2 遺伝子の mRNA のエクソン 7。体外形 SMN2 エクソン 7 を含む 140 のヌクレオチドの RNA シーケンスは T7 RNA ポリメラーゼによる転写、召-C2 の存在下で折り返されているおよび軽度 2'-ああアシル化試薬 2-methylnicotinic 酸 imidazolide (NAI) によって後で変更します。この 2'-オハイオ-NAI 付加がさらに32P 標識プライマー拡張による、ポリアクリルアミドゲル電気泳動 (ページ) による解決。逆に、細胞の形で 2'-オハイオ州のアシル化では、細胞が召 C2 バインド細胞 RNA をその場で行われます。PCR と次世代シーケンスが、形状による突然変異のプライマー拡張と共に、SMN2 遺伝子のエクソン 7 の mRNA シーケンスはそれから増幅されます。2 つの手法を比較すると、体外の形状はよりコスト効果の高い方法で、結果を可視化する計算力を必要としません。ただし、in vitro RNA の SHAPE 派生モデルは、RNA 結合タンパク質とのすべての相互作用の損失の可能性が高いため、携帯電話のコンテキストの二次構造から逸脱するが時々。セルの形状は放射性物質職場を必要としないし、携帯電話のコンテキストでより正確な RNA 二次構造が得られます。さらに、細胞の形状は通常適用体外に比べると次世代シーケンサーを利用してより大きな範囲の RNA シーケンス (~ 1,000 ヌクレオチド) 形状 (~ 200 のヌクレオチド)、通常のページの分析に依存しています。SMN2 mRNA のエクソン 7 の in vitro およびセル内の図形が派生した場合に備えて RNA モデルは互いに似ています。

概要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

プライマー拡張 (形状) を用いて選択 2'-水酸基のアシル化は、興味の RNA シーケンス中の各ヌクレオチドの動態を測定し、単一ヌクレオチド分解能1二次構造の解明の方法です。図形の方法論の in vitro 条件2,3,4 (定義されたバッファー システムで浄化された RNA) の両方生きている哺乳類セル5,6セカンダリを調査するために開発されています。中程度の長さの RNA シーケンスの構造 (通常 < セル内の図形の 1,000 ヌクレオチドと < 体外形の 200 のヌクレオチド)。これは RNA と相互作用する低分子代謝物2,4,7,8が結合する受容体 RNA の構造変化を評価し、機械的操作の研究特に便利RNA を対象とした薬剤開発9,10中分子。

RNA を対象とした創は、異なるアプローチと戦略13,14,15 を介して、大学の研究室で注目と製薬業界11,12を最近集めています。、16。臨床使用のための小さい分子の RNA を対象とした最近の例は、2 つの構造的に異なる実験薬、LMI 07017 , RG 791618,19、脊髄性筋萎縮症 (SMA)、約束を示したフェーズ II 臨床試験20の結果。両方の分子が 2 mRNA ターゲット生存運動ニューロン (SMN) の実証し、SMN2 遺伝子6,17,21のスプライシング プロセスを調節します。以前、体外との RG-7916 召 C26として知られているアナログの存在下で標的 RNA の構造変化の検討でセルに図形の応用を示した。

原則として、図形は公平な方法で過剰自己クエンチング アシル化試薬の存在下での RNA シーケンスの各ヌクレオチドの 2'-オハイオ州のアシル化率を測定します。アシル化試薬はの短い半減期の水で、安定しない (例えば、 T1/2 = 17; 1-メチル-7-nitroisatoic 無水または 1 M 7、2 methylnicotinic 酸 imidazolide 〜 20 分または NAI の s)22とのアイデンティティへの鈍感拠点23。各ヌクレオチドのダイナミクスの正確な評価に変換することができます柔軟な拠点の 2'-オハイオ州のグループのより有利なアシル化でこの結果します。具体的には、塩基対の塩基配列が通常ないなど 1 M 7 の 2'-ああ変更試薬に対になっていないものに比べて反応が弱い。

RNA テンプレートおよび 2'-オハイオ州のアシル化が起こるのソースを見て、形状一般的に in vitro およびセル内の図形に分類することができます。培養形状を使用して精製 T7 RNA の転写し、実験デザインで携帯電話コンテキストを欠いています。セルの形で RNA テンプレート転写と 2'-オハイオ州のアシル化の両方の生きている細胞内で発生します。したがって、結果は細胞における RNA の構造モデルを要約することができます。セルの形状生体形状のように文学24の生きているセルに図形の呼ばれています。この実験は動物では実行されない、ため精度のセルに図形としてこの実験私たちと呼ばれます。

In vitro およびセル内の図形のプライマー拡張段階の戦略も異なっています。体外形で逆のトランスクリプションは Mg2 +の存在下で 2'-オハイオ州のアシル化の位置で停止します。32P 標識プライマー拡張したがってポリアクリルアミドゲル電気泳動 (ページ) のバンドとして表示されます、バンドの強度はアシル化率1に比例します。セルの形で逆のトランスクリプションは、2'-オハイオ州でのランダムな突然変異を生成します Mn2 +の存在下での位置を付加します。各塩基の変異率は深さ次世代シーケンシングのでキャプチャできるし、塩基の分解能で形反応性が計算できます。

セル内の図形の潜在的な問題が低信号対雑音比 (すなわち、2'-オハイオ州のグループの大半は修正されていない、変更されていないシーケンスは、次世代シーケンシングの読み取りの大部分を占めている間)。最近、2' オハイオ州を豊かにする方法は、RNA を変更、生体内と同様に形状 (icSHAPE) をクリックすると呼ばれるチャン研究所25によって開発されました。この濃縮法は弱い小分子 RNA 相互作用、特にトランスクリプトーム尋問などの研究に有利であるかもしれない。

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プロトコル

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1. 体外の形状

注:プロトコルは、公開されたプロトコル1から変更されます。

  1. RNA テンプレートを準備してください。
    注:T7 転写用のテンプレートには、合成二本鎖 DNA (dsDNA)、EcoRI/病原制限の endonuclease の部位、PCR、pET28a などの一意のペアを運ぶ大腸菌ベクトルどちらか挿入によって増幅を命じられました。Pcr のためのプロトコルを次に示します。
    1. 以下の材料を混ぜて: 50 μ L の PCR マスター ミックス (材料の表を参照)、10 μ M の各プライマーの 2 μ L (シーケンスの表 1を参照)、200 2 μ L とジメチルスルホキシド (DMSO) の 3 μ L H2o. 因数 2 PCR に 41 μ dsDNA テンプレートの ngチューブ (各チューブは、50 μ L の反応混合物を含んでいる)。
    2. 熱 cycler を次のように設定: ステージ 1) 95 ° C、30 秒。段階 2) 95 ° C、20 s;ステージ 3) 56 ° C、20 s;ステージ 4) 72 ° C、20 s;30 サイクルのステージ 2 に戻ってステージ 5) ループステージ 6) 72 ° C、3 分。・ ステージ 7) 無限次のステップまで 4 ° C に保持します。
    3. ゲルのスライスの抽出による PCR 増幅を浄化 (材料の表を参照してください、製造元のプロトコルを使用)。10 mM トリス (pH 8.0) を含むトリス EDTA (TE) バッファーの 35 μ l 製品 DNA を溶出と 1 ミリメートルの EDTA、屈する 0.1 – 0.5 μ g/μ L のテンプレート。0.10 μ g/μ L に浄化された DNA のテンプレートを正規化します。
      注:必要に応じて、テンプレートの品質は、0.10 μ g の DNA と「1.8% の agarose ゲル電気泳動分析があります。目的のテンプレート DNA の単一のバンドは、ゲルの予定です。
    4. T7 転写反応 (容量 40 μ L) を PCR チューブに以下の資料を追加することによって設定: 反応バッファー、ATP、GTP、utp ケーブルは、T7 酵素の 4 μ L の 4 μ L の 4 μ L CTP の 4 μ L の 4 μ L x 10 の 4 μ L (材料の表を参照)、ステップ 1.1.3 (0.4 μ g) から精製 PCR 増幅の 4 μ L とピロ炭酸ジエチルエステル (DEPC) の 12 μ L-処理水。4 x 上下ピペッティングで混ぜます。4-16 h、サーマルサイクラー、37 ° C の定温器の 37 ° C で孵化させなさい。
      注:1.1.4 のステップで反応が進行中 1.1.6 のステップの設定を開始します。
    5. DNase の 2 μ L を追加、4 x、上下ピペッティングで混ぜるし、, 15 分ミックス 2 の等量のための 37 ° C でトリス-ホウ酸塩-EDTA (TBE) x-尿素サンプル バッファー (材料の表を参照してください)。不活化する 3 分の 70 ° C で加熱します。
    6. RNase フリーのボトルにミックス 40% アクリルアミド/bisacrylamide 溶液 75 mL (29:1、材料の表を参照してください)、尿素、180.2 g と 50 mL 10 x TBE バッファー (RNase フリー材料の表を参照)。尿素のすべての結晶を溶解するまでの軌道シェーカー (250 rpm) でボトルを入れて (2 h までかかることがあります)。DEPC 処理水と 500 mL にボリュームを調整します。0.2 μ m の膜を用いたソリューションをフィルター (材料の表を参照してください)。
      注:このプロセスで避ける鏡面を使用して、攪拌棒は RNase の混入を防ぐために。ソリューションは、4 ° C で 1 年間保存できます。
    7. 適切なサイズ (16.5 cm × 24 cm) を純水と 70% の 2 つの電気泳動ガラス プレートをきれい拭く紙の部分を使用してエタノール。2.0 mm スペーサー (シリコーン表面プレートは内側に直面している) のペアでプレートを合わせ、テープで板の端を密封します。二重テープ漏れを防ぐためにプレートのコーナー。
    8. 、ビーカー内のステップ 1.1.6、10% アンモニウムの過硫酸塩溶液 2.0 mL、テトラメチルエチレンジアミン (TEMED) の 100 μ L からアクリルアミド溶液 200 mL RNase フリーのピペット チップ 30, 傾きを急速に攪拌によるベンチトップ カバーの部分にプレートと混ぜて注ぐプレートの隙間からソリューションです。任意の気泡を持ち上げ、ベンチトップ表紙フラット プレートを置くプレートをタップします。すぐに櫛を挿入し、1 時間、少なくとも重合ゲルを聞かせてください。
      注:ゲルが次の日に使用する場合は、ラップの大きい部分で湿らせたペーパー タオルとラップの部分とゲルの上部を隠蔽します。フラット 4 ° C で横になっているところ
    9. テープを削除し、電気泳動スタンド プレートをクランプします。櫛を削除し、上部と貯水池の底に十分な 1 x TBE バッファーを追加します。事前・ w ・ 20 に 30 分のためのゲルを実行します。
      注:必要に応じて、目的の RNA のコンテンツは ~ 90% 以上、分取用ゲルの代替ミニ ゲルが使用できます。
    10. タンクの液体で二回、上下にピペッティングによる読み込み井戸のそれぞれを洗ってください。1.1.5 ステップイン井戸から原油の RNA を追加します。キシレン cyanol FF 染料 (水色) ゲルの長さ (~ 60 分) の約 3 分の 2 の通過するまで、20 W でゲルを実行します。
      注:井戸の高さの 3 分の 1 以上をロードすることを確認 (必要に応じて複数の井戸を使用)。
    11. 金庫の 1: 10,000 の希釈で 1 x TBE バッファーのゲルを浸すゲルに対して十分な大きさのコンテナー内 (材料の表を参照) を染めます。80 rpm で 5 分間軌道シェーカーにコンテナーを置きます。
    12. UV 光の下で目的の RNA バンドを識別し、素早くきれいなかみそりの刃を使用してゲルの細い帯をカットします。1.7 mL チューブに 1-2 ゲルのスライスを配置します。
    13. 受動的な溶出によるゲルのスライスから RNA を回復します。各管に十分な溶出・降水ミックス (スライスあたり ~0.3 mL) を追加: 0.3 M NaOAc (pH 5.2) 2.5 M 1 mM EDTA 水溶液 0.1% ドデシル硫酸ナトリウム (SDS) DEPC 処理水で。16 h のための 4 ° C でゲル splice(s) を含むチューブを回転させます。
      注:通常の回復率はこの手順で 〜 75% です。収量を高めるため削除し溶離液を収集し、溶出バッファーの同じボリュームを追加この手順を繰り返します。
    14. 新しい 1.7 mL チューブの溶離液を組み合わせます。冷たいエタノール × 2.5 を追加、6 回、液体を混合するチューブを反転し、-80 ° c 少なくとも 1 h でチューブを置きます。
    15. 10,000 x gと 4 ° C で 10 分間遠心ピペットで上澄みを慎重に取り外します。80% を追加することにより RNA の餌を洗ってエタノール (チューブあたり 1 mL) 10,000 x gと 4 ° C で 10 分間遠心して、15 の渦
    16. 上澄みを除去し、上下に 10 回ピペッティングによる RNase フリーの水とミックスの 5 分追加 50 μ L の RNA ペレットを風乾します。0.10 μ g/μ L の RNA 濃度を正常化します。-80 ° C で浄化された RNA を保存します。
      注:過剰 RNA ペレットを乾燥しないでください。
    17. 必要に応じて、希釈、RNA の品質を分析し、1 μ L (100 ng) 2 x TBE 尿素サンプルバッファーの 5 μ L の水とミックスのステップ 1.1.16 に 5 μ L からの RNA の。その後、3 分および 6 %tbe 尿素ミニ ゲルの負荷の 70 ° C で熱。
      1. 染色手順 1.1.11 で 180 V 1 h. 実行のためのゲルを実行します。イメージング システムの uv ジェルを視覚化します。シングル バンドが必要な長さで期待されます。
  2. 32P 標識プライマーを準備します。
    1. 次の材料を混合することによって反応を設定: γ-32P ATP の 10 μ L (~1.5 mCi、〜 25 μ M、参照テーブルの材料)、2 μ L の逆のトランスクリプション (RT) プライマー (表 1のシーケンスを参照してください 100 μ M)、2 μ L の 10 x T4 ポリヌクレオチド キナーゼ (pnk 式)反応バッファー、T4 PNK の 1 μ L (材料の表を参照)、および RNase フリーの水の 5 μ L。37 ° C 1 時間インキュベートします。
      注意:適切な保護が手順 1.2-1.5 放射性物質のための権限のある職場であります。
    2. 65 ° C で 20 分の熱不活化1 分を 2 x TBE 尿素サンプル バッファーの 25 μ l の溶離液のミックスの 1,000 x g で脱塩カラムと遠心分離機にサンプルを追加します。.
      注:それはすぐに浄化する場合は、-20 ° C でラベル付けされた粗製品を格納します。
    3. 20 W 1 時間で 10% のアクリルアミドゲルを実行します。
      注意:1.2.1 歩ゲルから32P 標識プライマーを読み込み、上部の貯水池に放射能を出血を避けます。よくゲルの細い帯を確保するための高さの 3 分の 1 以上をロードしないでください (必要に応じて複数の井戸を使用)。下部タンクの液体は、高レベル放射性にすることができます。
    4. ゲル カセットのガラス板を外し、ラップの部分にゲルを置きます。気密のサンドイッチを作るゲルの上部をカバーするプラスチック製のラップを折る。タングステン酸カルシウム蛍光スクリーンにゲル サンドイッチを置き、イメージング機器を公開します。ゲルの端がいる規則的なライトで再びゲルをイメージします。
    5. 画像処理ソフトを使用して、2 つの画像をオーバーレイします。印刷されたイメージにゲルを合わせます。ゲルから目的のバンドをカットするのに新鮮なかみそりの刃を使用します。1.7 mL チューブに 1 に 2 ゲルのスライスを配置します。
      注:印刷されたイメージが実際のゲルと同じサイズを確認します。ゲルのスライスを切断した後にもう一度残りのゲルをイメージングによる配置を再確認します。
    6. 手順 1.1.13 に 1.1.16 32P 標識プライマーを回復します。0.4 mL チューブにソリューションの 1.0 μ L と 1.0 μ L ~ 100,000 cpm での放射能を取得する 1 x TE バッファーとプライマーの希釈します。RNA 2'-ああ改質反応までが、4 週間以上の精製された32P 標識プライマー-80 ° c を格納します。
  3. 小分子結合と RNA 2'-ああ修正
    1. 4 つのサンプルを準備するには、0.5 x TE バッファーの 32 μ L で 1.7 mL チューブ、80 ° C、2 分およびスナップのクールな少なくとも 1 分間氷の上で熱を 8 pmol RNA を追加します。
      注:RNA のおおよその分子量を計算する次の数式を使用: MW (拠点数) = 340 ダ x。
    2. 折りたたみ MgCl2、20 mM と 500 mM の NaCl 500 mM HEPES (pH 8.0) を含むミックス x 5 の 8 μ L を追加します。それぞれ 4 つの PCR の RNA の混合物の 9 μ L 分注チューブし、はラベルに #1-#4。#1 管、高濃度低分子溶液 (10 %dmso) #2 に 1 μ L に 10 %dmso の 1 μ L を追加 #3 に希釈した小分子溶液 (10 %dmso) の 1 μ L と #4 に水 1 μ L。
    3. 37 ° c で 30 分間熱 cycler で PCR チューブを孵化させなさい。
    4. 2'-ああ改質反応の前に 3 μ L の DEPC 処理水 0.5 M 実用的なソリューションをもたらすためにない原液 (2 M) の 1 μ L を希釈します。、遅滞ないチューブ #1、#2 と #3 に作業ソリューションの 1 μ L と #4 に 25 %dmso の 1 μ L を追加します。37 ° c 15 分のサーマルサイクラーで孵化させなさい。
    5. 100 μ L の溶出・降水ミックス (レシピの手順 1.1.13 を参照)、グリコーゲン (15 mg/mL)、2 μ L と 1.7 mL チューブに各 PCR チューブのすべての液体を転送を追加します。冷たい 200-証拠 EtOH の 0.34 の mL を追加し (3 倍ボリューム) 各チューブに。ミックス 5 s の場所ボルテックスによって少なくとも 1 時間-80 ° C のフリーザーのチューブ。
      注:この期間中に 1.5.1 の手順で使用する配列のゲルをセットアップを開始します。
    6. 14,000 x gと 4 ° C で 15 分間遠心します。RNA の餌を乱すことがなく上澄みを削除します。80% を追加することにより RNA の餌を洗ってエタノール (0.5 mL チューブあたり)、20,000 x gと 4 ° C で 15 分間遠心して、15 の渦上清をもう一度削除します。
      注:必要に応じて、放射性ペレット チューブの保持を確保するためガイガー カウンターを使用します。
    7. RNase フリーの水の 5 分追加 9 μ L の RNA ペレットを風乾し、上下に 10 回ピペッティングで混ぜます。
      注:過剰 RNA ペレットを乾燥しないでください。すべての沈殿物は、このステップの終わりに解散する予定です。
  4. マーカー作製とプライマー機能の拡張
    1. 4 新しい PCR チューブに変更された RNA を転送し、ラベルに #1-#4 以前として。4 PCR チューブに 7 μ L の DEPC 処理水で 2 pmol コントロール RNA を追加し、ラベルを貼って #5-#8。すべての 8 つのチューブで標識プライマー (ステップ 1.2.6) の 2 μ L を追加します。65 ° C 5 分にアニールし、すぐに熱 cycler で 4 ° C まで冷却する熱します。
    2. RT バッファー x 5 の 4 μ L を追加 (材料の表を参照)、ジチオトレイトール (DTT、0.1 M) が 1 μ L と 8 つの PCR チューブ各 dNTP ミックス (10 mM) の 1 μ L。
    3. チューブ #1-#4 に 2 μ L の DEPC 処理 H2O を追加します。それぞれ、チューブ #5-#7 に ddATP (5 mM) の 4 μ L、ddTTP (5 mM) の 4 μ L および ddCTP (5 mM) の 4 μ L を追加しています。DdGTP (5 mM) の 1 μ L と 3 μ L の DEPC 処理水をチューブ #8 に追加します。4 回のピペットをミックスします。
    4. 熱 cycler で 1 分 52 ° C で加熱します。逆転写酵素の 1 μ L を追加 (材料の表を参照)、4 回上下ピペッティングで混ぜます。20 分の 52 ° C で反応を孵化させなさい。
    5. RNA を分解する管のそれぞれに 5 M NaOH の 1 μ L を追加します。95 ° C、5 分でチューブを熱します。
    6. 1 M HCl の 5 μ L を追加し、エタノールの沈殿物 (手順 1.3.5 と 1.3.6) を繰り返しますグリコーゲンおよび液体搬送を省略を除いて。
      注:「塩戦線」として知られているゲル真ん中にぼかし領域に 1.4.6 のステップを省略します。
    7. H2O の 5 分追加 10 μ L の DNA の餌を風乾し、2 倍の 10 μ L TBE 尿素サンプル読み込みバッファーと再溶解に 10 回上下ピペット。5 分の 70 ° C で熱は、ゲルにロードする前に氷のチューブを配置します。
  5. ページ解析
    1. 8% ポリアクリルアミドゲル シーケンスを準備する手順を 1.1.6 に 1.1.10 以下の変更: 8% アクリルアミド溶液を準備する 40% アクリルアミド/bisacrylamide 溶液 (29:1) 100 mL を使用し、シーケンスのゲルのガラス板 (例えば46 を使用57 cm) × 0.4 mm のスペーサーとします。
    2. 1.4.7 のステップからサンプルの 10 μ L をロードします。65 W 2 h または下部色素がゲルの 3/4 に到達するまでのゲルを実行します。
      注:必要な場合は、繰り返し-80 ° C でサンプルの残りの部分を格納します。
    3. スペーサーを削除し、ヘラを優しく挿入してトップ シリコーン ガラス プレートを取り外します。ゲルをカバーする大型のフィルター紙を置き、ろ紙に付着するゲルを許可するように優しく押します。下端から始まって、フィルター紙を持ち上げて一緒にガラス プレートからゲルを取り外します。
    4. 全体のゲル (濾紙上向き) をカバーするのに十分な大きさは、プラスチック製のラップの部分をろ紙と共にゲルを配置します。ろ紙面を下に、ろ紙/ゲル/プラスチック ラップ サンドイッチを乾燥ゲルに転送します。
      注意:放射性物質汚染を避けるためには、3 ~ 4 ゲル サンドイッチの間に大きいフィルター紙の複数個を使用し、乾燥ゲルします。
    5. 真空中で 1 h 70 ° C でゲルを乾燥させます。写真漂白蛍光体ストレージ画面カセットにゲル サンドイッチを転送します。4-16 h の画面にゲルの放射能を公開します。
    6. イメージング デバイスとスキャン中解像度 (30 分程度) と蛍光体ストレージの画面を配置します。
      注:笑顔のようなアーティファクトがゲル イメージに存在する場合、発行可能な品質に画像を処理する修正ソフトウェア (例えばサファ) を使用します。標準的なマーカーのレーンは 1 ヌクレオチドの 2'-ああ変更車線よりも長いであることに注意してください。

2. 細胞の形

  1. プライマー デザイン
    注:体外形とは異なり、セルの形状は、式カセットを設計する必要はありません。ただし、最適のプライマー セットを使用し、図形の前に評価する必要があります実験します。
    1. ブラスト ベース プライマー設計ツール (例えば、プライマー ブラスト) で、少なくとも 3 つの特異的プライマーのペアを生成します。ひと細胞における mRNA を研究、プライマーのペア特異性チェック パラメーターの参照データベースとして人間のゲノム (ないトランスクリプトーム) を選択します。200-1,000 塩基対 (bp) の範囲で私アンプリコンのサイズを選択します。
    2. RNase A とプロテアーゼ K の治療とスピン列ベースの方法で興味の 10 〜6セルからゲノム DNA を抽出 (材料の表を参照してください、製造元のプロトコルを使用)。0.1 μ g/μ L TE バッファーで浄化された DNA を正規化します。
    3. プロトコルと PCR テストは、1.1.1 と 1.1.2 の手順で実行されます。
      注:目的のプライマー セットは、1.8% の agarose のゲルの単一のバンドを得られるはず。
  2. セルの作製と 2'-ああ変更
    注:興味の mRNA の量を増やす、サイトメガロ ウイルス (CMV) プロモーター発現の正しいシーケンスのラムダバーミニは宿主細胞にトランスフェクションです。
    1. あらかじめ暖かい 10% 牛胎児血清 (FBS)、1 x 抗生の混合物でダルベッコ変更イーグル培地 (DMEM) 37 ° C でを含む培50% の confluency 培地のトランスフェクション前 24 h でシード 293 t 細胞。2% に媒体を変更 DMEM 抗生物質、トランスフェクション前 ~ 1 h なしで政府短期証券。
    2. 96 ウェル プレートの 1 に減らされた血清メディア (材料表参照) の 100 μ L に 10 μ g のラムダバーミニ プラスミドを追加します。ピペットのミックスに 4 回上下ソリューション。
    3. トランスフェクション試薬の 40 μ L を追加 (材料表参照) プレートのもう一つの井戸で低下した血清中メディアの 100 μ L に。ピペットを上下の混在させること 4 回。5 分間室温でインキュベートします。
    4. 全プラスミド ソリューションをトランスフェクション試薬サスペンションに追加します。ピペットを上下の混在させること 4 回。30 分間室温でインキュベートします。
    5. 全体の DNA を追加/トランスフェクション試薬の混合料理を通して媒体の表面に滴下します。6-12 h 37 ° C で孵化させなさい。
    6. 培地を吸引し、優しく (PBS、CaCl2 MgCl2、pH 7.4 では、参照テーブルの材料) リン酸緩衝生理食塩水 5 mL で 1 回洗浄します。3 mL のトリプシン溶液をセルを trypsinize します。5 分間室温でインキュベートします。
    7. 皿の底から細胞を分離するに優しく料理をノックします。培養液 6 ml のトリプシンを中和します。4 分の 300 × gで遠心し、メディアを取り出してください。
    8. 199 μ L の反応媒体で各サンプルに対して 10 〜6細胞を再懸濁します (1 %dmem で FBS) 96 ウェル プレートに細胞懸濁液を移すと。複合作業ソリューションの 1 μ L または 37 ° C で 30 分のすべての 3 つのコントロールで DMSO の 1 μ L と細胞をインキュベートします。
      注:3 つのコントロールのサンプルを含める必要があります: ナイ、ナイ、ナイと変性 RNA DMSO コントロール負の制御。
    9. 2 M ないの 10 μ L を NAI 陰性対照および変性制御 (DC) RNA を除いて、各サンプルに追加します。ピペットを上下の混在させること 4 回。15 分は軽く再中断セル 5 分ごとに板を振るは、37 ° C で孵化させなさい。
    10. 1.7 mL の管と遅滞なく 2 分の 400 × gで遠心分離機にセルを転送します。細胞ペレットを乱すことがなく上澄みを削除します。
    11. ための 0.4 mL を追加 (材料の表を参照してください)。15 の渦を均質化します。5 分間室温でサンプルをインキュベートします。
      注:サンプルは、次の手順に進むまで-20 ° C で保存できます。
  3. RNA の抽出
    1. ためのチオシアン酸イ オンの均質化試料のそれぞれにクロロホルムの 0.2 mL を追加します。2 分間室温で 15 s. 加温の渦。
    2. 12,000 × gと 4 ° C で 5 分間遠心トップの無色の水層には、RNA が含まれています。新しい 1.7 mL チューブに水溶液の ~ 380 μ L を転送します。
      注意:汚染を避けるための相間が不可でした。
    3. 江藤の 1.5 x のボリュームを追加 (~ 570 μ L)。15 の渦を混在させる s。
    4. RNA 分離スピン-列に 600 μ L の RNA の混合物を転送 (材料の表を参照してください)。15 s. 破棄の 12,000 × gで遠心分離機、溶離液。同じスピン列にすべての液体を通過するこの手順を繰り返します。
    5. RW1 バッファーの 0.35 mL を洗い流す (材料表参照) RDD バッファーに RNase フリーの DNase の 15 s. 追加 80 μ L の私を回すことによって (材料の表を参照してください)。20 分間室温でインキュベートします。
      注:すべての DNA 汚染を削除するが重要です。
    6. その後洗って 0.35 mL RW1 バッファーと 0.6 mL の 2 x RPE バッファーの列 (材料の表を参照してください) 15 の回転によって各ステップで s。列を乾燥するには、12,000 × gで 1 分で空のコレクション チューブとスピン列を遠心分離します。
    7. 列の中央に水の RNase フリーの 32 μ L を追加します。1 分間遠心 12,000 × g 30、孵化させなさい s 〜 30 μ L の精製した RNA 溶液を取得します。変性のサンプルの処理中には、-20 ° C でサンプルを置きます。
  4. 変性の RNA 制御の準備
    1. 場所 30 氷の上 1.7 mL プラスチック チューブに DC の μ L RNA のサンプルです。ホルムアミド 50 μ L と 300 mM HEPES (pH 8.0) を含む DC バッファーの 15 μ L を追加し、25 mM EDTA 管に。
    2. 95 ° c で 1 分間 RNA をすぐに変性する熱は、NAI 原液 (2 M)、ミックスして暖房のブロックにチューブを入れて 2 回フリックの 5 μ L を追加します。さらに 1 分間 95 ° C で、すぐに氷のチューブを置きます。
    3. ための 0.4 mL を追加します。2.3.1–2.3.4 の手順を繰り返します。
    4. 0.6 mL の 2 x RPE バッファーを洗い流す (材料表参照) 15 回転によって各ステップで s。列を乾燥するには、12,000 × gで 1 分で空のコレクション チューブとスピン列を遠心分離します。
    5. 列の中央に水の RNase フリーの 32 μ L を追加します。1 分間遠心 12,000 × g 30、孵化させなさい s 〜 30 μ L の回収 DC RNA 液を取得します。
  5. プライマー拡張
    1. RNase フリー水の 0.5 μ g/μ L に 2.3.7 2.4.5 から RNA 溶液を正規化します。たて 30 mM MnCl2∙4H2O パウダーから MnCl2ソリューションを準備します。
    2. PCR ストリップに各サンプルの RNA 溶液の 9 μ L を転送します。各チューブに 10 mM dNTP の 1 μ L と 2 μ M 遺伝子特定のプライマー (GSP) の 1 μ L を追加します。ピペットを上下の混在させること 4 回。熱 cycler で 5 分の 65 ° C で、氷の上を置く > 1 分。
      注:また、ランダム nonamer の 1 μ L は、GSP の置換で使用できます。
    3. 各 PCR チューブに RT バッファー x 10 の 2 μ L の混合物を追加 (材料の表を参照)、30 mM MnCl2と 100 mM DTT の 2 μ L 4 μ L。4 x ミックスへ上下のピペットします。2 分 42 ° C で孵化させなさい。
    4. 逆転写酵素の 1 μ L を追加 (材料の表を参照してください)。4 x ミックスへ上下のピペットします。42 ° c 3 時間サーマルサイクラーで孵化させなさい。
  6. ライブラリの準備、次世代シーケンシング
    1. 1 μ L の DNA ポリメラーゼ、DNA ポリメラーゼ バッファー x 10 の 5 μ L を追加することによって PCR の反作用を設定 (材料の表を参照)、DMSO、プライマー (10 μ M) の各 1.5 μ L H2O の 34 μ L とステップ 2.5.4 から cDNA の 5 μ L の 2 μ L。
    2. 熱 cycler を次のように設定: 段階 2 分; 1) 95 ° C段階 2) 95 ° C、30 秒。ステージ 3) 60 ° C、30 秒。ステージ 4) 68 ° C、30 秒。30 サイクルのステージ 2 に戻ってステージ 5) ループステージ 6) 68 ° C、3 分。・ ステージ 7) 無限次のステップまで 4 ° C に保持します。
    3. 1.8% アガロースゲルを用いて、私アンプリコンを浄化します。
      注:PCR バンドは、ゲルで単一バンドとして表示されます。
    4. 標準的な断片化と文学6,26年結紮メソッドを使用して、ライブラリを構築します。
    5. サンプルあたり 1 x 75 シングル エンド読み取りを使用して約 1000 万を生成する次世代シークエンス装置上のシーケンスを読み取ります。
    6. ShapeMapper と SuperFold のソフトウェアを使用して結果を分析、週によって開発されたパッケージ グループ26。

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結果

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以前、変調器をスプライシング RNA、召 C2、SMN2 遺伝子の mRNA のエクソン 7 の AGGAAG をモチーフにした対話し、召 C26存在下で RNA の構造変化を評価するために図形を使用しました。召 C2 の結合部位は、FDA が承認したアンチセンス オリゴヌクレオチド (阿蘇) sma の nusinersen と縛りがイントロン 727,28 (図 1 a) イントロンのスプライシング サイレンサー (ISS) をブロックから区別されます。SMN2 エクソン 7 の最も知られているスプライシング因子 mRNA29; のエクソン 7 の ~ 100 ヌクレオチド範囲内にあります。したがって、140 と 276 ヌクレオチド長い RNA シーケンスを用いて in vitro およびセル内の...

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ディスカッション

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体外形で質の高い均一な RNA テンプレートを使用するが重要です。しかし、T7 転写、しばしば異種シーケンス36が得られます。特に、非取るにたらない利回り36と 3' 末端に ± 1 ヌクレオチドのシーケンスは、通常ポリアクリルアミド ゲルの浄化による除去が困難。異種の RNA テンプレートは、時々 難しく結果を解釈するプライマー拡張製品のシーケンス ゲル プロファイリングにおける信号の 1 つ以上のセットになります。リボザイムの両方の 5'-3' - RNA テンプレート式カセットの端は両端の同種を見つけ。

2'-ああ修飾試薬のインキュベーション時間は、in vitro およびセル内の図形、もう一つの重要な要因です。週間グループは少なくとも 5 回水焼入れ 2'-オハイオ州のアシル化試薬の半減期が使用される1であることと考えられました。NAI とインキュベート私たちの手で (T1/2 = 〜 20 ...

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開示事項

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著者は利益相反を宣言しません。

謝辞

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この作品は、NIH R01 グラント (NS094721、K.A.J.) によって可能になった。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
DNAオリゴヌクレオチドIDTgBlock for >200 bp DNA合成
Phusion Green Hot Start II High-Fidelity PCR Master MixサーモフィッシャーF566S
NucleoSpin ゲルおよびPCRクリーンアップキットタカラ740609.50
MegaScript T7 転写キットサーモフィッシャーAM133310x反応バッファー、T7酵素、NTPおよびTurbo DNaseが含まれています
DEPC 処理水サーモフィッシャー750023
2x TBE-尿素サンプルバッファーサーモフィッシャーLC6876
40% アクリルアミド/ビスアクリルアミド溶液 (29:1)バイオ・ラッド1610146
10x TBE バッファーサーモフィッシャー15581044
Nalgene Rapid-Flow™フィルターユニットサーモフィッシャー166-0045
KimwipeKimberly-Clark34133
TEMEDサーモフィッシャー17919
SYBR-Safe 染料サーモフィッシャーS33102
6% TBE-尿素ミニゲルサーモフィッシャーEC6865BOX
ChemiDocBio-Rad
T4 PNKNEBM0201S
&γ;-32P-ATPPerkin ElmerNEG035C005MC
Hyperscreen™強化スクリーンGEヘルスケアRPN1669タングステン酸カルシウム蛍光体 蛍光体
スクリーン 蛍光体保存スクリーン分子動力学BAS-IP MS 3543 E
アマシャム 台風GEヘルスケア
NAI (2M)EMD ミリポア03-310
グリコブルーサーモフィッシャーAM9515
SuperScript IV リバース転写酵素サーモフィッシャー180900105x RT バッファー、SuperScript IV
dNTP ミックス (10 mM)サーモフィッシャーR0192
ddNTP セット (5 mM)シグマGE27-2045-01
大型濾紙Whatman1001-917
ゲルドライヤーHoeferGD 2000
QIAamp DNA 血液ミニキットQiagen51104RNase AおよびプロテアーゼK
SMN2 minigene34Addgene72287
熱不活性化FBSサーモフィッシャー10438026
ペン連鎖球菌モフィッシャー15140122
Opti-MEM Iモフィッシャー31985062
FuGene HDPromegaE2311
TrpLEサーモフィッシャー12605010
Ca/Mg なしの DPBSサーモフィッシャー14190250
TRIzolサーモフィッシャー15596018
RNeasy ミニカラムQiagen74104RW1、RPEバッファー
RNase-Free DNase SetQiagen79254DNase IおよびRDDバッファー
を含む 脱イオンホルムアミドサーモフィッシャーAM9342
MnCl2•4H2OSigma-AldrichM3634
ランダムノナマーSigma-AldrichR7647
SuperScript First-Strand Synthesis SystemThermo Fisher11904-01810x RT buffer, SuperScript II reverse transcriptase
AccuPrime pfx DNA polymerseThermo Fisher12344024
NextSeq500Illuminaを含む
NucAwayカラムThermo FisherAM10070脱塩用
サーサー

参考文献

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