方法論記事

高スループットの改善された呼吸器合胞体ウイルス (RSV) 微量中和試験

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DOI：

10.3791/59025

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2019年1月26日

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1Murdoch Children's Research Institute, 2Department of Paediatrics, University of Melbourne, 3School of Chemistry and Molecular Bioscience, University of Queensland, 4London School of Hygiene and Tropical Medicine

この記事について

サマリー

本研究は、高スループットを説明します呼吸器合胞体ウイルス (RSV) の中和抗体の力価を決定するためのマイクロ中和アッセイのイメージングに基づきます。このアッセイの形式は、別のサンプル タイプにテストされています。

要約

呼吸器合胞体ウイルス特異中和抗体 (RSV NAbs) は、RSV に対する保護の重要なマーカーです。さまざまな分析フォーマットの数が現在使用中世界中があるので RSV NAbs を測定する正確かつ高スループット方法に必要性。RSV サブグループ A でテストされています、RSV サブグループ B の別のサンプル タイプも適合できるイメージング ベース微量中和試験をご紹介します。このメソッドは、10% 未満のものをされている参照抗測定間変動と、再現性が高いです。この試金は比較的低コストで、世界中の研究所で容易に確立できると考えています。RSV NAbs を測定、向上、高スループットの測定法の開発は、将来的に新規の RSV ワクチン候補の評価のために重要なあることと同様、国際的にこの方法の標準化のための重要な一歩前進を表します。

概要

呼吸器合胞体ウイルス (RSV) は、小児人口世界1の下気道感染症の主要な原因です。その高い負担にもかかわらずありませんまだワクチンや治療。2013 年以降、世界保健機関 (WHO) は回 WHO 協議会議2,の3の主要な研究の優先順位として RSV ワクチンの開発を宣言しています。WHO は、保護4の主要な血清学的マーカーと見なされると、rs ウイルス中和抗体 (NAb) の測定を使用してワクチンの免疫原性を監視するに合意しました。NAbs 抗 rs ウイルス抗体 palivizumab、現在のみ予防戦略利用できる4の臨床試験と同様、研究の数の厳しい RSV 感染に対する保護するために示されています。

5,6,7、8に挑戦の標準化の努力をした細胞および分子ベースのアッセイを含む世界中の研究所で使用される複数の NAb アッセイ フォーマットがあります。ただし、RSV 型特異抗体の存在によって減らされたプラーク形成単位 (PFU) の数を測定する従来のプラーク減少中和 (PRN) アッセイまだ金本位制9のままです。ここで、RSV の異なる系統と増加測定スループットに多数の細胞に使用ことができます改善、簡素化、および高スループット PRN プロトコルを報告します。このプロトコルは、さまざまな設定からだけでなく、動物実験からのサンプルの臨床サンプルを使用してテストされています。

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プロトコル

注:すべての手順は、異なる記載がない限り BSL2 フードで行います。ウイルスの滴定は、PRN アッセイ PRN 試金で使用される最適の RSV の濃度を決定する前に必要です。一度解凍および各民放連試金のために使用される少量のウイルス株の約数を勧めします。1 つの研究からのすべてのサンプルの実行すべての民放連試金のため同じウイルス株を使用することをもお勧めします。文化メディアとリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) はセル板を追加する前に 37 ° C に温めていることを確認します。

1. RSV ウイルス滴定

注:ウイルス株の数は、重複の数によっては、図 1によると、アッセイ プレート設定できます。各ウイルス株は、最高のウイルス濃度 (すなわち、1:10) から始まるアッセイ プレートを 3 通で滴定する必要があります。シリアルの滴定が通常することができます 1:10。RSV 文化プロシージャと同様、A549 細胞培養およびメンテナンスを行う標準的な手順を使用して、このプロトコルには含まれません。

  1. 播種板 (日 1)
    1. ダルベッコ イーグルスの変更培地 (DMEM) + 10% 牛胎児血清 (FCS) + 4 × 105/mL で 1000 IU ペニシリン/ストレプトマイシン (ペン/連鎖球菌) A549 細胞を再懸濁します。シード 96年ウェル平底滅菌板 100 μ L/ウェル 4 × 104 A459 細胞を含みます。
    2. 一晩で 37 ° C、5% CO2版を孵化させなさい (ログ相成長でセルになります)。
      注:23 通路の後新しい A549 細胞バイアルを使用します。新しい細胞のバイアルは、最初の 3 つの通路にまだ場合に、実験開始しなかったりそれ勧めします。
  2. ウイルス感染 (日 2)
    1. ウイルス シリアル希釈の準備
      1. 37 ° C の水浴ほぼ完全に解凍し、すぐに氷の場所までに RSV の単一凍結バイアルを急速に解凍します。準備 3 複製各 RSV ウイルス ストック試金するし、1:10 の最初のウイルス ストック希釈を使用し 100 μ L 希釈ウイルス/ウェルの負の制御のための少なくとも 1 つの列をぜひご予約ください。
        注:図 1は、トリプリケートでネガティブ コントロールを示します。
      2. 1:10 96 ウェルの U 底の行 A の 3 通で希薄化後の各ウイルスの 100 μ L を追加滅菌プレート。H 行 B に DMEM + 1000 IU ペン/連鎖球菌 FCS なしの 90 μ L/ウェルを追加します。
      3. シリアル 1:10 を行う希釈下行行の上下に 5 回ピペッティング コンテンツによって B. ミックス ソリューションとそれぞれの最終的なボリュームは 90 μ L をよくされる行 H. 廃棄最終 10 μ L まで 10 倍希釈を続けるから 10 μ L を転送することによってプレート。
        注:それぞれの希釈のための新しいヒントを使用することが重要です。
    2. A549 細胞へのウイルス接種
      1. A549 cell plate(s) 前の日に準備を取得します。A549 細胞膜 96 ウェルのプレートの合流 ~ 80% であることを確認します。プレートを軽く反転と軽く滅菌吸水紙タオルの上にしみが付くことによってメディアを破棄します。
      2. すべての井戸を PBS 100 μ l を 2 回洗って、プレートを軽く反転して軽く各洗浄後滅菌吸水紙タオルの上にしみが付く過剰 PBS を破棄します。プレートを乾燥させるようにしてください。
      3. ウイルス滴プレート (図 1) からウイルスの希釈を転送すると、A549 細胞の版に対応する井戸。37 ° C、5% CO2で 1 h のプレートを孵化させなさい。1 時間培養後 (交差汚染を避けるため) にピペットを使用して上清をデカントします。90 μ L/ウェルを取り出します。
      4. 1 x 中 199 の 100 μ L を追加 (M199、材料表を参照してください) + 1.5% カルボキシメチル セルロース ナトリウム (CMC) 低粘度 + 2% の FCS を各ウェルにペン/連鎖球菌を含みます。
        注: 2 x M199 + 4% の FCS + 2% ペン/連鎖球菌と 3 %cmc は、事前に準備し、将来の使用のための 4 ° C で保存する必要があります。ソリューションは 37 ° C でプレートを追加する前にウォーム アップされていることを確認します。
        1. 2 x M199 ソリューションを準備: 1 袋/500 mL 蒸留水 20 mL FCS + 10 mL ペン/連鎖球菌 (2 を構成する x MI99)。0.22 μ m のフィルター ユニットを使用して、ソリューションをフィルター処理します。
        2. 3 の準備のため %cmc、蒸留水 500 mL をゆっくりと CMC の 15 g を追加。50 ° c で、準備の約 1 時間を取る金属撹拌機ヒーターを使うことで水の CMC を溶かします。ミックスに 3 %cmc とオートクレーブ ソリューション。
          注:解消するために水に固体の CMC を追加する必要があります。乾燥した固形に水を加えて溶解し非常ににくい固体の「塊」が生成されます。
        3. M199 + 1.5 %cmc 低粘度 × 1 を準備 + ペン/連鎖球菌の混合で 1:1 を含む 2% の FCS M199 と 3% × 2 CMC 1.2.2.4.2 の手順で準備します。
      5. プレートを 37 ° C、5% CO2で 3 日間インキュベートします。
  3. アッセイ プレートと分析 (日 5) の開発
    1. 固定と発展途上のアッセイ プレート
      1. プレートを軽く反転 M199 + CMC + 2 %fcs 含むペン/連鎖球菌を破棄します。ゆっくりと追加 (避けるために細胞層を乱す) 200 μ L 固定バッファー (80% アセトン、20 %pbs、-20 ° C で保存) のセルを修正します。-20 ° c 20 分間インキュベートします。
      2. 固定バッファーを破棄し、優しく吸収紙タオルの上にしみ。プレートの顔を残してまで 10 分間乾燥させます。
        注:このステップから BSL2 フード外分析を実行できます。
      3. 準備 5% 牛乳希釈ブロッキング液 0.05% を含むフィルター選択された PBS のポリソルベート 20 (PBS ポリソルベート、材料表を参照してください)。1 つのプレートの計算に基づいてブロック/200 と 110 の井戸のために必要なボリューム: 200/ウェル x 110 井戸 = 22 mL (1.1 mL の濃縮ミルク 20.9 mL の希釈は、PBS ポリソルベートをフィルター選択)。この段階でまたブロッキング液の十分な第一次および二次抗体を作る。1 つのプレートの計算/50 と 110 の井戸に基づく各抗体ソリューションに必要なボリューム: 50/よく x 110 井戸 = 5.5 mL。したがって、単板の試金のために必要なソリューションをブロック牛乳希釈液の総量は 33 mL です。
      4. ブロッキング液の 200/well を追加します。30 分破棄ソリューションに対する室温 (RT) でプレートをプレートを軽く反転によるインキュベートし、吸水紙タオルの上にしみを付けなさい。
      5. 解決を妨げる希釈 1: 500 ヤギ X RSV 抗体 (mAb-一次抗体) を準備します。MAb ソリューションの 50/well を追加し、1 h. フィルター処理された PBS ポリソルベートで 3 回洗浄プレートの 37 ° C で孵化させなさい。
      6. ソリューションをブロック内の抗やぎ igg 抗体 (二次抗体) を希釈 1:5,000 Alexa Fluor ロバを準備します。二次抗体溶液の 50/well を追加し、1 h. フィルター処理された PBS ポリソルベートを使用して 5 回洗濯板の 37 ° C で孵化させなさい。
      7. フルオレセイン イソチオ シアン酸 (FITC) チャネルを使用して自動化されたスポット リーダーのプレートを読み、図 2に示すように、設定をカウントします。箔でプレートをラップし、4 ° C で保存未使用の 96 ウェル培養プレートを使用して、アッセイの前にカウント設定を入力する楽器を調整します。
        注:数日以内の再スキャンが必要な場合です。校正と count に設定保存でき、アッセイは、校正用プレートの同じタイプを使用する場合、将来のスキャンに使用します。
      8. アーチファクト プラークまたは細胞膜 (図 3) のための井戸の画像を確認してください。細胞膜と井戸を除外します。
        注:アーチファクトのプラクのサイズに応じて手動カウントは、これらの井戸に実行する必要があります。 またはこれらの井戸データ分析から破棄する必要があります。有効な結果の条件には、1 つ以上のレプリケーションも検出なし細胞単層またはアーチファクト斑と負ウェルズ (ウェルズ追加ウイルスなし) で検出されたない PFU が含まれます。
    2. ウイルス濃度を決定します。
      1. スポットすることができます明確にカウントされる最後の 2 つの希釈を選択します。同じ希釈でレプリケート井戸からのスポットの数の平均値を計算します。以下の数式を使用してストック サンプル (1 mL あたり PFU) ウイルス価を計算します。
        PFU/mL = プラークの数の平均値/(希釈係数 × 希釈ウイルス量も追加)
        注: RSV 銘柄ごとのウイルス濃度は、PRN アッセイ (手順 2) で今すぐ使用できます。

2. RSV 中和試験

  1. 播種板 (日 1)
    1. DMEM + 10 %fcs + 1000 IU ペン/連鎖球菌 4 x 105/mL で A549 細胞を再懸濁します。シード 96年ウェル平底滅菌プレート 100 μ L/ウェル 4 × 10 の4 A459 を含む細胞し、一晩で 37 ° C、5% CO2版を孵化させなさい (ログ相成長でセルになります)。
      注:23 通路の後新しい A549 細胞バイアルを使用します。通路番号 3 の前に A549 細胞を使用することはお勧めできません。
  2. ウイルスと血清の準備 (日 2)
    注:サンプルの種類に応じて、NAb の試金の前に前処理サンプルに必要な手順があります。今生物学的標準とコントロール (NIBSC) 国立研究所からリクエスト承ります RSV 国際標準的な血清を使用することをお勧めします。
    1. 血清希釈の準備
      1. 人間 RSV 参照抗血清 (REF 参照血清) を解凍し、血清 RT。 熱不活化血清のサンプルをテストし、使用する前に 30 分の 56 ° c の水浴の抗血清を参照します。プレートのテンプレート (図 4) に従って希釈液を準備します。
      2. 準備参考準備の 1: 100 希釈 DMEM + ペン/連鎖球菌 FCS なしアッセイ プレートあたりで希釈した REF の 110 μ L の最小値 (例えば、 150 μ L の総ボリュームで REF の 1.5 μ)。1: 100 の 110 μ L 希釈 96 ウェルの U 底も A12 で REF を追加滅菌プレート。
      3. 井戸 B12 H12 12 欄に DMEM + FCS なしペン/連鎖球菌の 55 μ L を追加します。55 μ L を行 A から B の行に転送する、上下に 5 回ピペッティング コンテンツによるソリューションを混合とそれぞれの最終的なボリュームは 55 μ L をよくされるメディアの最後の 55 μ L 行 h. 破棄まで継続、シリアル プレートを 1:2 の希釈を実行します。それぞれの希釈のための新しいヒントを使用します。
      4. 1: 100 希釈血清のテスト サンプルを準備します。すべての血清サンプルは 3 通と、準備 3 = 330 x 110 μ L/ウェルの最小ボリューム血清テスト サンプルあたり μ L。
      5. 各希釈血清テスト サンプル (1: 100; 110 μ L を追加します。S1 = 血清 1、S2 = 血清 2、等.)A9、また図 4によると 96 ウェル滅菌プレートの E9 に E1 に対応する井戸 A1。
      6. DMEM の 55 μ L を追加 + ペン/連鎖球菌 FCS なしすべてのウェルにラベル X. 実行シリアル 2.2.1.3 の手順に従って 1:2 希釈 (1、2、および 3 のサンプル) の行 D まで。55 μ L 各ウェルの最終的なボリュームがあるので、メディアの最後の 55 μ L を破棄します。同様に、4、5、および 6 行 E h のサンプルのシリアル希釈 1:2 を実行します。
        注:それぞれの希釈のための新しいヒントを使用することが重要です。
      7. 列 10 および 11 の井戸に DMEM + FCS なしペン/連鎖球菌の 55 μ L を追加します。
    2. ウイルスの作製
      1. 37 ° C の水浴ほぼ完全に解凍し、すぐに氷の場所までに RSV の単一凍結バイアルを急速に解凍します。
      2. 1.3.2 ステップで決定した RSV 因数の濃度に基づく FCS なし DMEM + ペン/連鎖球菌性ウイルスを希釈します。約 200 PFU/ウェルは、希釈を適用します。(井戸) を 5.5 mL の容量を準備します。
    3. ウイルス血清混合物の調製
      1. 1-9 の列のすべての井戸と井戸 10 および 11 (肯定的な制御) プレートのテンプレート (図 4) に従って列の行 E H の希薄ウイルスの 55 を追加します。
      2. 10 および 11 (マイナス コントロール) の列の行 A ~ D のすべてのウェルに DMEM + FCS なしペン/連鎖球菌の 55 を追加します。37 ° C、5% CO2で 1 h のプレートを孵化させなさい。
    4. A549 細胞へのウイルス接種
      1. 潜伏期間の完了する前に準備した 2.1.1 A549 cell plate(s) を取得します。A549 細胞膜 96 ウェルのプレートの合流 ~ 80% であることを確認します。
      2. プレートを軽く反転と軽く滅菌吸水紙タオルの上にしみが付くことによってメディアを破棄します。すべての井戸を PBS 100 μ l を 2 回洗って、プレートを軽く反転して軽く各洗浄後滅菌吸水紙タオルの上にしみが付く過剰 PBS を破棄します。プレートを乾燥させるようにしてください。
      3. 加温 37 ° C、5% CO2で 1 h 用プレート板テンプレートに従って A549 細胞の版に対応する井戸にウイルス血清の混合物の 100/well を転送します。
      4. 後、ピペットを使用して、1 時間 90/よく取り出し、追加の 100 prewarmed M199 + 1.5 %cmc + 2% の FCS + ペン/連鎖球菌 × 1 です。プレートを 37 ° C、5% CO2で 3 日間インキュベートします。
        注:ソリューションは 37 ° C でプレートを追加する前にウォーム アップされていることを確認します。
  3. アッセイ プレートと分析 (日 5) の開発
    1. 手順 1.3.1.1 に 1.3.1.8 固定・ アッセイ プレートを開発します。
    2. 50% 中和抗体価を決定します。
      1. 50% 中和抗体価計算の上記相互血清希釈と 50% 以下」には血清' コントロールの距離に比例した井戸 (肯定的なウイルス制御 - 10 列、行 E H) を決定します。
      2. PFU (すなわち斑) の数をカウントする血清井戸とない血清制御井戸個々 のウイルス感染から生じる。ないの血清制御井戸の PFU の平均数を計算し、50% の値を決定します。
      3. すぐにない血清制御井戸の 50% 値の上下である数と血清希釈を識別します。片対数グラフまたはスプレッドシート テンプレートを使用して、プロット (リニア スケール) x 軸と y 軸 (ログ10スケール) に相互血清希釈 PFU の数です。2 点間線を引き、この線からテストの 50% 中和抗体血清サンプルを読みます。
        注:RSV PRN 分析ワークシート (ワークシートの補足)、50% 中和抗体価を決定する使用されます。

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結果

ウイルス ストックの滴定を 1:10 1:10 から行った8希釈 PRN アッセイ (典型的な結果を図 5に示すように) 前にウイルス ストック濃度を決定します。図 5から PFU カウントされることが確実に 1:10 の希釈液で4と 1:10 の5。同じ希釈で帳票の井戸から PFU の平均数を算出しました。1:105希釈された 14 のスポットの数の平均値、以来このウイルス株のウイルス価はとおり決定いた

14 (スポットの平均数)/[10-5 (希釈) 0.1 mL (菌量) x] 1.4 x 10 =7 PFU/mL

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ディスカッション

我々 は開発し、ほとんどの実験室に容易に合わせることができるシンプルかつ効率的なの RSV マイクロ中和のアッセイを最適化します。この試金はコンピューター化されたイメージのスキャンを使用して細胞レベルで民放連によるウイルス感染の阻害を測定し同様、ウイルスの感染能力を測定することができます。イメージング ベースのプラットフォームおよび特定抗体ベース システムの使用は、特異性と伝統的なプラーク検出方法6,7と比較してスポットの検出の感度を増加しています。これにより RSV の評価低い感染性を持つ株し、も PRN 試金で使用前に rs ウイルス濃度の定量の正確さを提供します。

RSV 株式間すべてバッチごとにバリエーションを最小限に抑えるため、各研究のウイルス ストックの同じバッチを使用することをお勧めします。アッセイの他の重要な側面は、ウイルス入力濃度、A549 細胞膜と同じカウントの設定を使用して試金の一貫性と正確性を確保するための整合性の整合性を含めます。プレートに...

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開示事項

著者が明らかに何もありません。

謝辞

著者は、関与するすべての参加者をありがとうございます。我々 は、ビクトリア朝の政府の運用インフラストラクチャ サポート プログラムを認めます。PVL は、NHMRC キャリア開発フェローシップ受領者です。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
Cell line
A549ATCCCCL-185by Dr Keith Chappell, University of Queensland
Viral strains
RSV A2ATCCVR-1540ロット番号 60430286
Reagents
AcetonMerck1000142511
Alexa-Fluor ロバ抗ヤギ IgG (4 °C;C)Life TechnologiesA11055
CMC ナトリウム塩粉末Sigma-AldrichC5678-500G
DMEM (無血清、3.7 g/L NaHC、P/S) (4°C;C)科学サービス–在宅組織培養MCRI 内
Fetal calf Serum (-20 °C で 50 mL アリコートに保存;C)InterpathSFBS-F
Goat X RSV antibodyMerckAB1128
ヒトポリクローナル抗血清 呼吸器合胞体ウイルス (RSV) (45 µL アリコート -20 °C)BEI ResourcesNR-4022登録時にBEI Resourcesを通じて無料注文。この血清は、RSV(NR-32832)
M199粉末Life Technologies31100035
ミルク希釈剤ブロッキング溶液(4°Cで保存;C)Australian Biosearch50-82-01
ニシリン/ストレプトマイシン(-20°Cで6mLアリコートに保存;C)Life Technologies15140122
s.d.H2O Milli-Q dispenserMerck社内分注
培養用 1x PBS 滅菌 (4 °C;C)科学サービス–家庭用組織培養MCRI
Tween 20 polysorbateSigma-Aldrich9005-64-5
General 消耗品
Conical Falcon チューブ (50 mL)Invitro TechnologiesFAL352070
フィルターユニット 0.22 μm (500 mL)Thermo FisherNAL5660020
滅菌済み Eppendorf チューブ (1.5 mL)オーストラリア PLAM12400
滅菌済み平底プレート (96 ウェル、蓋付き)Interpath655180
滅菌済み U 底プレート (96 ウェル、蓋付き)Interpath650180
5 mL 血清学的ピペットSigma-AldrichCLS4487-200EA
10 mL 血清学的ピペットInterpath607180
25 mL 血清学的ピペットSigma-AldrichCLS4251-200EA
Tip Pipette 1-200 µL クリア マキシマム リカバリー ラック 滅菌済み 10RACKS x 96TIPS PKG960フィッシャー バイオテックTF-200-L-R-S
チップピペット 5-20 & マイクロ;L クリア マキシマム リカバリー ラック 滅菌済み 10RACKS x 96TIPS PKG960フィッシャー バイオテックTF-20-L-R-S
チップピペット 100-1,000 & マイクロ;LClear Maxymum Recovery Racked 滅菌済み 10RACKS x 100TIPS PKG1000Fisher BiotecTF-1000-L-R-S
Tip Pipette 1-10 & micro;L クリア マキシマム リカバリー ラック 滅菌済み 10RACKS x 100TIPS PKG1001Fisher BiotecTXLF-10-L-R-S
Equipments and softwares
ELISpot リーダ システムAID iSpot, Autoimmun Diagnostika GmbH, Strasburg, Germany
AID ELISpot software version 5.0AID iSpot, Autoimmun Diagnostika GmbH, Strasburg, Germany
マイクロソフトエクセル 2007
ペ

参考文献

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