方法論記事

・ フット プリント分析とマウスのテスト ボックスをぶら下げの低コスト プロトコル適用慢性拘束応力

DOI：

10.3791/59027

⸱

2019年1月23日

 , 
1Division of Biology, Center for Molecular Medicine, Jichi Medical University

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

・ フット プリント分析から成ると拘束ストレスがマウス モデルの運動障害の評価に有用テスト ボックスをぶら下げの低コストのプロトコル。

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

歩行障害は運動障害の患者によく見られます。運動障害のため使用するマウス モデル、歩行分析はマウスが患者の症状を模倣するかどうかを判断する重要な行動テスト。運動障害は多くの場合ストレスによって誘導されるマウス モデルにおける自発運動表現型を認められなかったとき。したがって、ストレス負荷による歩行分析はマウスモデルのモーターの表現型を評価するため機密性の高いメソッドになります。しかし、研究者は歩行分析から自動的に量的な結果を取得する高価な装置の要件に直面します。ストレスは、高価な器具電気ショックを必要し、実行を強制することがなく簡単な方法で読み込みストレスが望ましいです。したがって、運動機能を評価するテストをボックスをぶら下げ、紙と墨、フット プリント解析から成るシンプルかつ低コストのプロトコルを紹介、応力が円錐管と拘束によって定義されます。マウスの運動障害は、このプロトコルが正常に検出されました。

概要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

運動障害は、過剰または自発的または自動の動き1の少なさを示す中枢神経系の障害として定義されます。特に、歩行障害頻繁運動障害2,3,4と患者の間で記載されています。したがって、歩行解析は運動障害の動物モデルの検証のための適切な行動のテストです。マウスで、トレッドミル6,7自然なスピード5と調整可能な速度での歩行の自動歩行行った。これらの解析では、歩行の定量的な結果を自動的に提供します。歩行障害を検出するための代替メソッドは、フット プリント分析と呼ばれます。インクと足の底をラベリングした後マウスを紙の上歩くし、足跡を分析します。当初は、ワセリンと粉末炭8フット プリントを視覚化するために使用され、ポリグラフ紙9インクと現像印画紙10によって取り替えられました。日付11インクと他の方法よりも紙を使用して安く、毒性の少ない方法が残っています。・ フット プリント分析は自動解析5,6,7と比較して安価と豊富な研究資金もなく研究者のためのマウス モデルにおける運動障害の評価に有用であります。.

吊りワイヤ ケージ蓋12を使用して 4 つの手足吊りテストの一種であり、ワイヤー メッシュ スクリーン13ボックス テスト。ボックスは、センター バーに沿ってボックスの上部にある回転メッシュふた付け装置です。歩行分析に加え、テスト安価かつ容易に実行できます。したがって、絞首刑を行ったボックスこのプロトコルのウォーターフット プリント分析にさらに握力とバランスを評価するテスト。

ストレスは運動障害14,15の症状を誘発します。運動障害は、運動障害16,17,18のマウス ・ モデルにおける自発運動表現型が観測されない場合でも多くの場合いくつかの慢性的なストレスによって誘導されます。拘束は、ストレス動物が物理的に無傷19ではなく、コストは専用装置による電気ショックなど他の方法と比較して少ないために、マウスで負荷の一般的に使用される方法の 1 つし、を搭載したトレッドミルの使用を強制します。封孔 50 mL の円錐管にマウスで行いますが、管による拘束は、ワイヤーなど他の方法メッシュ ストレーナ、録音された手足とガーゼ (見直し20) を持つ動物の折り返しより簡単です。本稿で我々 はフット プリントのプロトコルを要約分析およびぶら下げボックス拘束後チューブでのテストします。このプロトコルでは、自発的な運動表現なし運動障害疾患のマウスモデルを使用してくれます。

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プロトコル

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すべての動物実験は、人道的な方法で行われました。制度的動物実験委員会の自治医科大学は、研究を承認しました。研究を行った機関の規則に従って動物実験の基本的なガイドライン動物実験の適切な実施や学術研究機関で関連活動のため日本の文部科学省の管轄下にあります。マウスをこのプロトコルで使用されている前述の21。

1. ぶら下げボックス テスト

  1. それぞれのマウスの体重を記録します。個々 の差別のためのペンのマーキングが、尾をマーク (例えば.、線、二重線、およびトリプル ライン)。
    注:成長曲線は、一般的な健康22のインデックスに使用されます。
  2. 行動テストの前に実験室の少なくとも 30 分にマウスを配置します。(図 1) の上に回転メッシュふた付けクリア ボックス (25 x 25 x 40 cm3) から成っているハンギング ボックスを設定します。メッシュの蓋は、上部に 180 度反転されますので、中央バーに沿って回転できます。
  3. メッシュのふたの中央にマウスを置きます。サイドをメッシュ蓋を下げて慎重に。
  4. メッシュの蓋からマウスの秋の遅延 (時間掛かる) を測定します。
    注:マウスが 5 分以内でない場合は、5 分遅延時間を記録します。
  5. マウスを家のケージに戻ります。すべてのテストの後、70% エタノールをぶら下げボックスをきれい。

2. フット プリント分析

注:ハンギング ボックス テスト、フット プリント解析を実行します。

  1. 設定、滑走路(図 2 a)。
    1. ホワイト ペーパーの部分をカット (29.7 cm × 42 cm × 0.09 mm) 縦方向の等しい幅の 3 つの長さに。テーブルの上に一枚の白い紙 (9.9 cm × 42 cm) を設定します。
    2. 紙の遠位端で暗い目標箱を置きます。その他を入れてボックス (約紙と同じ長さ) のマウスの逃げを防止する、滑走路の両側に壁。
    3. 独立したシャーレ (直径 35 mm) に黒インク、赤インクを入れてください。
  2. トレーニング セッション。
    注:4 週齢でトレーニング セッションを実行します。
    1. (顔の目標ボックスに向かう) 紙の近位端にマウスを置きます。徒歩近位端の目標ボックスにマウスをしましょう。目標ボックスから、マウスを削除します。紙の上でマウスが停止した場合は、指でマウスを目標ボックスにプッシュ優しく。
    2. 前肢の動きを制限する親指と人差し指で首筋をつかんでマウスを保持します。その後、前後のつまみのボールと後肢の動きを制限する他の指と尾を把握します。
      注:服にインクのしみのマウスの結果が不足して開催。
    3. 赤インクで前肢の底と黒のインクで後肢のボトムを浸します。すぐに紙 (顔の目標ボックスに向かう) の近位端にマウスを置きます。徒歩近位端の目標ボックスにマウスをしましょう。紙の上でマウスが停止した場合は、指でマウスを目標ボックスにプッシュ優しく。
    4. 目標ボックスから、マウスを削除します。テスト セッションに行きます。
  3. セッションをテストします。
    1. 次のトレーニング セッションは、ホワイト ペーパーの新しいカット部分で足跡の滑走路を設定します。
    2. 前肢の動きを制限する親指と人差し指で首筋をつかんでマウスを保持します。その後、前後のつまみのボールと後肢の動きを制限する他の指と尾を把握します。
    3. 赤インクで前肢の底と黒のインクで後肢のボトムを浸します。すぐに紙の近位端にマウスを置きます。徒歩近位端の目標ボックスにマウスをしましょう。
      注:マウスは、暗闇を好む、ので歩くマウス暗い目標ボックスに近づくとより安定になります。紙の上でマウスが停止した場合は、指でマウスを目標ボックスにプッシュ優しく。その後、分析のために信頼性の高いフット プリントが得られない場合 (ステップ 2.4 を参照してください。マウスが停止しているために、再試行テスト セッションのフット プリントの解析の詳細)。
    4. ホームのケージに目標ボックスからマウスを返します。各テスト セッションの後に、目標ボックスで 70% エタノールをきれい。足印刷用紙を風乾します。
  4. 足跡の分析
    1. 各パラメーターの 3 つの測定値を得る (前肢と後肢の前部および後部の基本幅の長さを歩幅、前肢と後肢、図 2 bの間重複) 足印刷用紙から定規で。
      注:近位および遠位端の足跡頻繁に停止のために大きな変化を表示したり足跡の着実な歩行パターンを持つ部分を選択を実行しています。足印刷用紙の中央部、通常分析に適しています。
      1. ストライドの長さ (例えば、足パッドまたはつま先) 足の同じ部分の間の距離を測定します。
      2. フロント ベース幅の連続の右 (または左) フロントの足跡のけじめ。その後、左 (または右) フロントのフット プリントのパッドから右 (または左) の足跡を結ぶ線の縦線の長さを測定します。
      3. 後肢のベース幅の連続の右 (または左) 後肢の足跡のけじめ。その後、左 (または右) 後肢のフット プリントのパッドから右 (または左) の足跡を結ぶ線の縦線の長さを測定します。
      4. 重複、左 (または右) のパッドの前面と後部の足跡の間の距離を測定します。
    2. 個々 のそれぞれのための 3 つの測定の平均値します。各パラメーターの個々 の平均を使用して、統計の分析のため。
      1. 歩幅の左と右の進歩の個々 の平均値の平均値を使用します。
      2. ストライド長の非対称性は、左下肢の個々 の平均値と右下肢のストライドの長さの差の絶対値を使用します。
      3. その他のパラメーター (フロント ベース幅、後肢のベース幅と重複) の統計分析、直接個々 の平均を使用します。

3. 拘束応力

  1. 拘束チューブの準備。
    1. スケール疵に沿って 16 穴 (直径約 2 mm) 50 ml コニカル チューブ (直径 x 115 mm 長さ 30 mm) を作る (5、10、15、20、25、30、35、40 mL) と角ドリル (図 3) でマークそれぞれのスケールの裏面。先端を切り落とすことにより呼吸の 50 mL のコニカル チューブ (直径約 5 mm) の先端に穴を作る。マウスの尾を通過するチューブ キャップの穴 (直径約 4 mm) を作る。
  2. 応力
    1. 実験室のマウスを置きます。
    2. 親指と、人差し指で首筋をつかんでマウスを保持します。拘束チューブに頭からマウスを入力します。キャップの穴を尾を通過します。キャップを閉じる。
      注:前肢の運動を制限するマウスは、前肢でチューブを入力を拒否するため。
    3. 室温で机の上に 2 時間囲まれたマウスを保持します。拘束チューブからマウスを取り外して家のケージに戻ります。
      注:洗浄後、乾燥、拘束チューブを再利用できます。

4. 実験スケジュール (図 4)。

  1. ここでは絞首刑を実行 4 週齢で同じ日にテストとフット プリント解析をボックス (手順 1 を参照してください。ハンギング ボックス テスト、ステップ 2。詳細についてはフット プリント分析) 'ストレス グループ' と '非ストレス群' にグループ化する前にすべてのマウスのベースライン測定値として。
    注:約 8-10 2-3 リットルにマウス実験で使用するが適さない場合があります。4 週齢でフット プリント解析は、トレーニングとテストのセッションで構成されます。
  2. ストレス団と非ストレス団にマウスをランダムに分割します。
    注:マウスを使用するには、いくつかの仔から成る、同腹子を両方のグループに均等に分割します。各グループの数は、約で構成されています 4 月 5 日マウス。
  3. (手順 3 を参照してください 2 週間にわたって 'ストレスのグループの 6 回拘束応力に適用します。拘束ストレス負荷詳細については)。
    注: 6 時間拘束が適用されて 2 週間ごとぶら下げ続いてボックスの 6-12 週齢からテストとフット プリント分析。絞首刑のテストの日に拘束ストレスを加えないでボックス テストとフット プリント分析。
  4. ここでは絞首刑を実行ボックスのテストとフット プリント解析のテスト セッション、同じ曜日に 6, 8, 10, 12 週齢。

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結果

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Atp1a3のヘテロ接合体の男性マウス (Atp1a3+/−) マウス モデルである急速な発症性ジストニアに対するパーキンソニズムと野生型同腹子をこのプロトコルで使用されました。Atp1a3+/− の 4 週齢 (図 5 aと図 5 b円と正方形を開く) の野生型よりも前肢と後肢の大幅に短いストライドの長さを示した。'を強調したAtp1a3+/−よりも '非強調' 両方の手足の大幅に短いストライドの長さを示したAtp1a3+/−は 8 週齢 (図 5 aと図 5 b、閉じた状態と開いた円)。両方の手足のストライド長の非対称性認められなかったマウスのすべてのグルー...

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ディスカッション

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

・ フット プリント分析とテストぶら下げボックス マウスの運動機能のシンプルで安価な行動テストです。いくつかのマウス モデルにおける神経行動学的表現型は、これらのテストによって正常に検出されています。たとえば、筋萎縮性側索硬化症24、毛細血管拡張性運動失調25ハンチントン病26とジストニア27重複の高められた長さの非対称的な歩幅の増加の長さでストライドの長さを短くし、広げられた基地運動失調28,29、アンジェルマン症候群30とジストニア31 ・ フット プリント分析によって示した。さらに、コントロール マウスよりも掛かる時間の短縮は、デュシェンヌ型筋ジストロフィーの32のマウスモデルで観察さ...

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開示事項

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者が明らかに何もありません。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

この作品は、(学術振興会) 日本学術振興会科研費 (費補助金科学研究 C)、によって支えられた番号 18 K 07373 (継手) と私立大学への補助金を付与します。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
ハンギングボックスO'ハラ&共。http://ohara-time.co.jp/products/wire-hanging-test/
マーキングペンZEBRAMO-120-MC-BK
ゴールボックスO'ハラ&共。http://ohara-time.co.jp/products/balanced-beam-test/バランスビーム試験装置用アクセサリー
ボックスO'ハラ&共。●滑走路側壁
黒インク新旭
・赤インク丸山工業BC-6
使い捨てシャーレコーニング351008シャーレ(直径35mm)
アスクル マルチペーパー スーパーホワイト Jモノクロ A3アスクル701-712白書(29.7cm×42cm×0.09mm)
50mL コニカルチューブコーニング
角ドリル角栗コーポレーションDIY FACTORY(K32-0313)
430829

参考文献

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