このプロトコルでは、リジン ・ チロシン ・ フェニルアラニン (KYF) トリペプチドで安定したオレイン酸 acids-platinum(II) 共役のナノエマルションを合成するための効率的な方法について説明します。穏やかな条件合成を介しての自己集合、KYF と共役ナノエマルション フォーム。
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この記事について
サマリー
要約
オレイン酸 acids-Pt(II) コアとリジン-チロシン ・ フェニルアラニン (KYF) コーティング (KYF Pt NE) から成るナノエマルションを生成する方法について述べる。KYF Pt NE は、107 ± 27 nm と負の表面電荷の直径を有する 10 重量 % で Pt(II) をカプセル化します。KYF Pt NE は安定した水と、血清と生物学的活性します。KYF に fluorophore の活用により生体イメージングに適した蛍光ナノエマルションの合成ができます。水溶液環境と短い KYF ペプチドおよびオレイン酸 acids-platinum(II) 共役の自己集合による KYF Pt NE フォームで、ナノエマルションの合成を行います。自己組織化プロセスは、ソリューションの温度、基板のモル比と基質添加の流量に依存します。重要なステップは、合成の際に最適な撹拌速度を維持し、自己組織化のための十分な時間を許可する、ナノエマルションを遠心濃縮器に徐々 に集中して事前に含まれます。
概要
近年では、ナノ粒子ドラッグデリバリーとバイオ1,2,3,4としてこのような医用工学における関心の高まりがあった。ナノ粒子ベースのシステムの多面的機能はしばしば 1 つの定式化の内で複数のコンポーネントを組み込むことを必要とします。しばしば脂質またはポリマーに基づくビルディング ブロックは、その物理化学的特性、生体適合性、生分解性は、最終的にナノ構造1,の機能に影響を与える可能性があります点で異なる5,6。タンパク質やペプチドなどの生物学的派生材料は長い多機能ナノ構造、シーケンス柔軟性7,8のための有望なコンポーネントとして認識されています。非常に発注された超分子構造体形成ヘリカルに自己組み立てるペプチド リボン9,10、線維性足場
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プロトコル
1. オレイン酸 Acids–Platinum(II) 共役の合成
- シスプラチンの活性化
- 60 ° C で 50 mg (0.167 モル) 4 mL の水 (例えば、nanopure) にシスプラチンを中断します。
- シスプラチンのソリューションに 0.5 mL の水にアグノ3滴 55.2 mg (0.325 ミリ モル) を追加し、60 ° C で少なくとも 2 時間の反応をかき混ぜる反応の進行状況を示す塩化銀の白色沈殿物を形成します。
- 活性化反応は完了するには、10% のテストを行う無料 Ag+イオンの存在の hcl が掲載。テストは負の値にする必要があります (追加 AgCl の沈殿物を形成する必要がありますなし)。
- 3,220 × g 10 分で反応混合物を遠心分離し、塩化銀の白色沈殿物を削除します。
- 上清を収集し、0.2 mm のシリンジ フィルターを介してフィルターします。プラチナの有無を清をテストするには、新規2結晶をパスツール ピペットで溶液の 2 〜 3 滴を適用します。検査結果が陽性の場合はプラチナでスズの座標複合体の色は濃い黄色/オレンジ色です。
- 2 番目のステップの活性化 Pt(II) の上澄みを使用します。
- オレイン酸活性化 Pt(I....
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結果
このプロトコルを使用して準備 KYF Pt NE の代表の TEM 像を図 2 aに示します。KYF Pt ファミコン、球状形態、よく分散していると均一の大きさの。KYF-白金-ファミコン、200 測定、最低 3 つの TEM 画像から直接測定のコア径は、107 ± 27 nm です。KYF-白金-NE、動的光分光法 (DLS) を使用して分析の流体力学的直径が 240 に発見された 0.156 の多分散性のインデックスを持つ nm。-60.1 の平均値と 3 つの独立した合成 KYF Pt 水 - NE のゼータ電位を測定した mV。ポテンシャルの高い等級を示します、定式化のコロイド安定性良いと負の表面電荷はオレイン酸のイオン COO-表面グループに起因します。KYF の等電ポイント 8.59 であり従ってそれが正荷電中性 pH で。
蛍光に分類された FITC KYF.......
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ディスカッション
ナノエマルション合成で重要な手順は、基板のモル比を調整、オレイン酸 acids–Pt(II) 追加中の温度と流量制御の維持、自己組織化のための十分な時間を提供すること、使用して製品を浄化、遠心濃縮器列。これらのパラメーターに影響を与える KYF Pt NE; の形態とサイズしたがって、特に適切なモル比を維持し、正しく合成条件を調整することが重要です。
ナノエマルション合成 (ステップ 3) の際に基板の比は、自己組織化プロセスの重要な製品の最終的なサイズを決定します。KYF オレイン酸 acid-Pt(II) のモル比は 1:3 と水で KYF tripepide の最適濃度は 0.2 mM。さらに、3.1 の手順でオレイン酸 acid-Pt(II) 共役を溶解するために使用される有機溶剤は水、ろ過システムとの互換性と混和性で、室温で簡単に蒸発します。
重要な手順の 1 つは、KYF ソリューション (ステップ 3.4) オレイン酸 acid-Pt(II) 共役の滴下です。流れはならない低速 0.1 mL/min 以下と 0........
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開示事項
著者には、利益相反を開示するはありません。
謝辞
我々 は感謝して SC2CA206194 を付与国立がん研究所からの財政支援を認めます。競合する金銭的な利益が宣言されていません。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 2-(1H-ベンゾトリアゾール-1-イル)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウム テトラフルオロホウ酸塩(TBTU) | アナスペック: | AS-20376 | SPPS |
| 4-well chamber confocal dish | Lab-Tek II, Thermo Fisher Scientific | 154526 for | imaging |
| 6-bromohexanoic acid | Chem-Impex INT'株式会社エル | 24477 | ペプチド |
| A2780 | マウントサイナイ病院のジョン・マルティネッティ教授による寛大な寄付 | 卵巣がん細胞株 | |
| 5811F | 白金錯体分離用 | ||
| シス-ジクロロジアミン白金 (II) 99% | Acros Organics | 19376-0050 | in vitro tests |
| CP70 | マウントサイナイ病院のジョン・マルティネッティ教授が寛大に提供 | 卵巣がん細胞株 | |
| ブルックヘブン・インスツルメンツ・コーポレーション | ナノ粒子径測定用 | ||
| ES-2 | ATCC | CRL-1978 | 卵巣がん細胞株 |
| Fmoc-L-Lys(Boc)-OH 99.79% | Chem-Impex INT'株式会社エル | 00493 | SPPS |
| Fmoc-L-Phe 4-アルコキシベンジルアルコール樹脂 (0.382 meq/g)、 | Chem-Impex INT'株式会社エル | 01914 | SPPS |
| Fmoc-LTyr(tBu)-OH 98% | Alfa Aesar | H59730 | SPPS |
| HERACELL 150i CO2 インキュベーター | Thermo Scientific Fisher | インキュベーター | |
| 高圧シリンジポンプ | New Era | 1010-US | ナノ粒子合成における白金錯体添加用 |
| ホットプレート/スターラー | VWR | 12365-382 | サンプルの攪拌および加熱用 |
| LAMP-1 抗体(Alexa Fluor 647と共結合) | Santa Cruz Biotechnology | sc-18821 AF647 | イメージング用 |
| N,N-ジイソプロピルエチルアミン(DIPEA) | オークウッドケミカル | 005027 | SPPS |
| ニンヒドリン 99% | Alfa Aesar | A10409 | カイザー試験 |
| オレイン酸 | Chem-Impex INT'株式会社エル | 01421 | 白金錯体合成用 |
| OV90 | ATCC | CRL-11732 | 卵巣がん細胞株 |
| PBS | コーニング | 21-031-CV | 細胞洗浄用 |
| パーマウント封入剤 | フィッシャーケミカル | SP15-100 | イメージング用 |
| フェ | ノールフィッシャーケミカル | A92500 | カイザー試験 |
| リンタングステン酸 | フィッシャーケミカル | A248-25 | TEM |
| ピペリジン 99% | BTC | 219260-2.5L | SPPS |
| プラチナ AAS 標準 soultion | アルファ エーザー | 88086 | 1000ug/ml 検量線用 |
| 臭化プロパルギル 97% | アルファ エーザール | L10595 | フルオレセインのアルキン修飾用 |
| サイエンティフィック バイオ キャビネット | サーモ サイエンティフィック フィッシャー | 1385 | バイオフード細胞培養用 |
| セルフクリーニング 真空システム | ウェルチ | 2028 | 回転式蒸気用真空ポンプ |
| 硝酸銀 | アクロス・オーガニクス | 19768-0250 | シスプラチン活性化 |
| SKOV3 | ATCC | HTB-77 | 卵巣がん細胞株 |
| 水酸化ナトリウム | フィッシャー・サイエンティフィック | S313-1 | 白金錯体合成用 |
| スズ(II) | プラチナの存在のためのシグマAldrich | の208256 | テスト |
| TOV21G | ATCC | CRL-11730 | 卵巣癌の細胞株 |
| トリフルオロ酢酸99% (TFA) | Alfa Aesar | L06374 | SPPS |
| トリイソプロピルシラン(TIPS) | Chem-Impex INT'株式会社エル | 01966 | SPPS |
| Triton-X | Sigma Aldrich | T8787-100ML | イメージング |
| 用 ウラニン粉末 40% | フィッシャー サイエンティフィ | S25328A | フルオレセイン |
| ビバスピン 20 (10000 MWCO) | Sartorious | VS2001 | ナノ粒子洗浄および凝縮 |
| VWR 倒立顕微鏡 | VWR | 89404-462 | 細胞培養モニタリング用 |
参考文献
- Agrahari, V., Agrahari, V., Mitra, A. K. Nanocarrier fabrication and macromolecule drug delivery: challenges and opportunities. Therapeutic Delivery. 7 (4), 257-278 (2016).
- Anselmo, A. C., Mitragotri, S. Nanoparticles in the clinic. Bioengineering & Translat....
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