Method Article

シングル スループット複雑な天然有機物の混合物の評価の補完的な高解像度分析の手法

DOI:

10.3791/59035

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January 7th, 2019

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1Environmental Molecular Sciences Laboratory, Pacific Northwest National Laboratory, 2Department of Soil, Water and Environmental Science, University of Arizona, 3Department of Earth Ocean and Atmospheric Sciences, Florida State University, 4Bruker Daltonics Inc., 5Biological Sciences Division, Pacific Northwest National Laboratory

In This Article

Summary

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このプロトコルでは、相補的な分析とオミックス技術の天然有機物と異なる生態系における微生物のプロテオミクスの完全にペアの特性で最高潮に達する単一のスループットについて説明します。この方法は、代謝と環境変化への応答を予測する温室効果ガス生産を記述するため重要な変換を識別するための堅牢な比較を許可します。

Abstract

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天然有機物 (NOM) は、歴史的に、特徴付けることは困難証明する有機化合物の何千もの非常に複雑な混合物で構成されます。ただし、公称値の分解から生じる温室効果ガス (二酸化炭素 [CO2] と [4CH] メタン) 生産の熱力学的および速度論的コントロールを理解する分子レベルの特性と相まって微生物プロテオーム解析が必要です。さらに、気候や環境の変化は、有機物の基質の供給と、変換を実行する微生物に影響を与える複雑な相互作用を動揺させる可能性のある自然の生態系を混乱させると予想されます。有機物、微生物のプロテオミクスと経路および有機物の分解、変換の詳細な分子特性解析は、方向と環境変化の影響の大きさを予測する必要があります。直接注入するフーリエ変換イオン サイクロトロン共鳴質量分析法 (FTICR MS)、ガスクロマトグラフィー質量分析法 (GC/MS)、単一サンプルの包括的な代謝産物解析の方法論的スループットについて説明します核磁気共鳴 (NMR) 分光法、液体クロマトグラフィーの質量分析計 (LCMS)、およびプロテオミクス解析。このアプローチは、有機物の分解、結果 CO2 CH4生産率、環境変動への応答の経路を推定の統計的信頼度を向上させる完全にペアのデータセットの結果します。ここを提案する; の泥炭地帯から収集されたサンプルの公称値にこの手法を適用した結果ただし、プロトコルは、任意の公称サンプル(例えば泥炭、森林土壌、海洋堆積物等)に適用されます。

Introduction

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世界的に、湿地は、泥炭の沈殿物の1で埋められる有機 C 主として炭素 (C) の 529 の Pg が含まれてと推定されます。現在、このような泥炭地は、北アメリカ単独で1に 29 の Tg C y-1を隔離ネット C シンクとして機能します。しかし、流出、火災、干ばつ、気温などの環境外乱は、温室効果ガスの増加 C 損失を介して有機物分解を増やすことによってこの C シンクを相殺できる (二酸化炭素 [CO2] とメタン [4CH]) 生産1,2。気候変動より暖かい温度や乾燥条件微生物による高速 C 分解を刺激する場合 C の損失に貢献するかもしれない。また、高い温度と大気 CO2濃度の有機炭素 (OC) としてより多くの CO2を隔離する第一次生産を刺激するかもしれない。その OC は CO2に分解されます、どの程度、どのくらいの速と CH4電子ドナー基板、電子アクセプターの可用性および媒介微生物間の複雑な相互作用に依存、変換です。多くの場合、メカニズムよ特徴付けられた、従って環境変動への応答はよく制限されませんは、泥炭地生態系における炭素収支に気候変....

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Protocol

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1 有機物の土壌、堆積物、または泥炭からの抽出シーケンシャル

  1. 土壌、堆積物、または泥炭を介して掘削を収集し、(例えば深さ) テストされる仮説によるとコアを分割します。ポリテトラフルオロ エチレンでストア サンプル容器のコーティングし、分析の前にストレージ-80 ° C でフリーズします。
    注: このプロトコルの約 25 mg C が必要です。泥炭 (通常 45 %c)、乾燥した泥炭の 50 mg が必要です。低有機サンプル C によって鉱物や森林に覆われた台地土壌コンテンツ (5 g まで) のようなは、大量のサンプルが必要場合があります。有機溶剤による抽出は 2.4 の段階のイオン化に悪影響が、エキスに、ポリエチレング リコール (PEG) を引っ張ってくるためサンプル収集、保管中に任意の時点プラスチックに連絡することができますを避けるために重要ですか抽出します。
  2. サンプルを分析する準備ができたら、一定重量まで乾燥を凍結し、均質化と集計を破るステンレス スチール研磨ボールを使用して高速ボールミルのサンプルを挽きます。
    注:、プロトコルがこの時点で一時停止にできるし、材料は-80 ° C で保存
  3. ステンレス製調理器具のエタノール洗浄、乾燥のサンプルのそれぞれの分注 50 mg を各 2 mL ガラスバイアルに使用。これらのサンプルは、連続して各サンプルからますます非極性代謝物を抽出する溶媒の一連を使用して順番に抽出されます。....

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Results

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記述の相補的な分析のプロトコルを行いアメリカ、ミネソタ州のトウヒと泥炭地の応答の下を変更する環境 (トウヒ) サイトに S1 沼の深さが付いている泥炭を比較します。これらの結果は、サイトが代謝物質および酵素活性の異なる場合がありますどのように見るには北欧から永久凍土湿原と湿原からのそれらと比較されます。プロテオミクス解析で 3,312 酵素を同定しました。深さと酵素活性の解析では、15 cm と 45 cm スプルース湿原 (図 1) の酵素の数が急激に低下を明らかにします。

プロテオミクスが示唆されたどの蛋白質を表現、代謝のデータを示すどの反応が実際に発生しています。全体的にみて、NMR、FTICR MS の組み合わせから泥炭のサンプルのすべての 67,040 の代謝物質 (脂質を含む) がわかりました GC-MS と LC MS 解析。これらの分子式を 15,385 化合物 (図 2) に割り当てることができました。データを結合代謝酸化状態、固まり、および化合.......

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Discussion

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シングル スループット代謝産物とプロテオームを特徴付けるために使用完全連成解析ストリームは、複雑な生態系の循環が発生して C によって経路への洞察を提供します。異種の行列は、泥炭土、したがって、このメソッドの重要な手順の 1 つは開始泥炭または土材料は均質な高度を確保する上で最初のステップで行われます。集計は、抽出効率を減らすことができますだけでなく、サンプルを粉砕することをお勧めします。これは低 C と十分に均質化するステンレス鋼ボール グラインダーを使用する必要があります高のミネラル内容集約された土壌と土壌の特定問題。実験サイト内の泥炭土壌の空間的異質性が高くなる可能性があります、ため生物学的複製は強くお勧めします。

この方式では 3 つの溶剤: 水, メタノール, 及びクロロホルム、バイアス型化合物を抽出することが可能です。原則として、この逐次抽出法が化合物の極性の広い範囲をカバーを可溶化する必要があります。ただし、これらの溶媒は有機無機複合体または非常に安定した錯体を抽出する最適化されていません。このような化合物は、関心のある、強い酸や塩基など厳しい溶剤が好ましいが厳しい抽.......

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Disclosures

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著者が明らかに何もありません。

Acknowledgements

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泥炭のサンプルを収集することが支援のため j. p. Chanton、J.E. コストカと MM のコルトンに感謝したいと思います。この作品の一部は、DOE のオフィスの科学ユーザー施設オフィスの生物と環境研究主催の環境分子科学研究所行った。バテル契約 DE AC05 76RL01830 下 DOE のなりが運営しています。この作品は、米国エネルギー省科学局、オフィスの生物学・環境研究によって支えられた (付与: デ SC0014416、・ デ ・ SC0012088、DESC0010580 ・ デ ・ SC0004632 ・ デ ・ AC05 00OR22725)。

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
メトキシアミン塩酸塩グマアルドリッチ226904誘導体化剤
5mm三重共鳴耐塩性コールドプローブ ブルカー計装
キャピラリーGCカラムHP-5MSカラム(30 m × 0.25 mm × 0.25 μm)AgilentAG19091S-433計装
逆相荷電面ハイブリッドカラム (3.0 mm × 150 mm × 1.7 μm 粒度)ThermoFisher計装
2 mL ガラスバイアルVWR International46610-722サンプルバイアル
オートサンプラーバイアルVWR International97055-324; 9467671サンプルバイアル
クロロホルムVWR インターナショナルJT9174-3溶媒
エタノールVWR インターナショナルBDH67002.400溶媒
メタノールVWR インターナショナルBDH85681.400溶剤
ピリジンVWR インターナショナルBDH67007.400溶剤
2,2-ジメチル-2-シラペンタン-5-スルホン酸-d6シグマ アルドリッチ178837標準
C8-C24 脂肪酸メチルエステルシグマ アルドリッチCRM18918標準
N-メチル-N- (トリメチルシリル) トリフルオロアセトアミドシグマ アルドリッチ24589-78-4標準
スワニー川 フルボ酸標準国際腐植物質学会2S101F標準
トリメチルクロロシランシグマ アルドリッチ89595標準
チューニングソリューションアジレント
FTICR-MS 分析ソフトウェアブルカーコンパス DataAnalysis 4.1
フォーミュラリティソフトウェアパシフィックノースウエスト国立研究所フォーミュラリティ、次の場所でダウンロードできます: https://omics.pnl.gov/software/formularity
GC-MSAgilentAgilent GC 7890A with MSD 5975C
silica-based sorbentPhenomenex (Torrance, CA)Strata C18-E (PN 8E-S001-DAK)
NMR TUBE 3MM 8 150 CS5VWR InternationalKT897820-0008NMR tube
Varian Direct Drive 600 MHz NMR 分光計 Varian InovaVarian Direct Drive 600-MHzNMR 分光計
Chenomx NMR Suite 8.3ChenomxChenomx NMR SuiteNMR ソフトウェア
超高速液体クロマトグラフ watersAquity UPLC H 液体クロマトグラフ 
Velos-ETD Orbitrap質量分析計 ThermoFisherThermo Scientific LTQ Orbitrap Velos質量分析計 
シは

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bridgham, S. D., Megonigal, P. J., Keller, J. K., Bliss, N. B., Trettin, C. The carbon balance of North American wetlands. Wetlands. 26 (4), 889-916 (2006).
  2. Wilson, R. M., et al. Greenhouse gas balance over thaw-freeze cycles in discontinuous zone per....

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