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方法論記事

In Vivo 光シート顕微鏡観察に基づくアレルギー性炎症の実験的肺ホーミング ヒトリンパ球のイメージング高度な

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DOI:

10.3791/59043

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2019年4月16日

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1Department of Medicine 1, University Hospital of Erlangen, 2Department of Medicine 3, University Hospital of Erlangen

この記事について

サマリー

ここで導入されたプロトコルでは、体内の炎症性条件の下で主要な人間のリンパ球のホーミング肺活量の評価をことができます。アレルギー性炎症のマウス モデルの転送に対して人間の免疫細胞の肺の浸潤をイメージし、化学的にクリアされた肺組織の光シート蛍光顕微鏡による定量化できます。

要約

高活性の免疫細胞の組織蓄積を圧倒的な様々 な慢性炎症性疾患の特徴を表し、影響を受ける患者の臨床管理に魅力的な治療上のターゲットとして浮上しました。プロ炎症性免疫細胞の病理組織学的不均衡な組織浸潤の治療の規制を目指す戦略をさらに最適化するためには、病・臓器別に改良された洞察力を達成するために特に重要なこと末梢血リンパ球のホーミングのプロパティです。ここで説明されている実験的なプロトコルは、パパイン誘発肺炎症のコンテキストで蛍光に分類された、本人間のリンパ球の肺蓄積を監視できます。免疫細胞の移動と走化性の分析のために頻繁に使用される標準試験管内アッセイと対照をなして今導入された生体内の設定を組織のアカウント肺固有の側面と炎症性のコンプレックスの影響考慮します。シナリオ生物マウスで行われています。さらに、三次元断面光シート蛍光顕微鏡イメージングは免疫細胞の浸潤にだけ定量的なデータを提供しませんが、また炎症を起こした肺内免疫細胞局在化のパターンを示しています。全体的に、提供されているステップバイ ステップのプロトコルに従うことによって簡単に適用することができます慢性炎症性肺疾患における免疫学的研究価値の高い革新的な技術を導入することが。

概要

肺、気管支喘息や慢性閉塞性肺疾患 (COPD) などの古典的な炎症性疾患、肺組織1,2に活性化リンパ球の増加の採用によって駆動されるよく知られています。サイトカインはリンパ球リリース (例えば、IL 4、IL-5、IL 9、IL-13、IFN-γ、TNF-α) 自然免疫と適応免疫細胞の走化性を促進、線維症の気道リモデリング誘導や肺実質2の直接損害します。これまでのところ、肺組織内のリンパ球の病理学的蓄積のための責任の根本的なメカニズムはまだよくわかっていません。肺樹状細胞 (Dc) は明らかに首相の CCR4 発現誘導を介して少なくとも部分的の優遇肺癌浸潤の末梢 T 細胞にすることができる T 細胞の組織選択的刷り込み腸と皮膚ホーミングへの類似で、リンパ球3の表面。CCR4 は、以外にも気道浸潤 T 細胞も CCR5 と末梢血1,4,5内 T 細胞に比べて CXCR3 ケモカイン受容体の発現が特に増加によって特徴付けられます。全体的に、既存のデータが肺生理学的または炎症性条件の下で T リンパ球のホーミングが異なるケモカイン受容体とのそれぞれの配位子の数を含む、従って重大決まる概念と一貫性のある、密接に自然免疫と適応免疫細胞1間のコラボレーションを制御します。特に、病原体や抗原暴露の初期段階では、生得の免疫組織の細胞応答 TLR 刺激、LTB4CCL1、CCL17 のような異なる塩基の即時釈放によって架橋 igeCCL22、CCL20、CXCL10 PGD21,6,7。主な例として PGD2と走化性因子受容体の相互作用 CRTh2 は Th2 細胞の走化性にとって特に重要なが知られている、従って喘息の臨床管理に、有望な治療上のターゲットが登場します。確かに、中等度の喘息患者を示し, 症状の改善治療後 1 秒 (fev 社1) 強制呼気量の大幅な増加 CRTh2 の選択的拮抗薬プラセボ グループの8 と比較して、9。炎症反応のより進行した状態で既に採用の T 細胞が il-4, IL 13 のリリースを介して肺の Dc の強力な刺激としての肺リンパ球蓄積をさらに増幅することができます。その後、これらの骨髄由来の生得的な細胞を調整 STAT6 依存の方法1,10、11CCL17 ・ CCL22 式。 説明したシナリオの複雑さはまだホーミング T 細胞肺の完全な理解を妨げているが、炎症やアレルギー性の肺疾患の可能性があります最適治療制御の分子標的の茄多を提供しています。そのため、緊急の必要性を深めるおよび T 細胞走化性と肺ホーミングの分野で我々 の知識を補完することができる革新的な実験があります。

肺、人体内のリンパ球のホーミングは複数の細胞、体液性および物理的なパラメーター1によって影響を受け、という事実のために、既存の実験手法のほとんどはこの免疫学的プロセスの全体の複雑さをモデル化することがありません。代わりに、ホーミングが選択的に肺の解析の多くの標準的なプロトコルはリンパ球の魅力、接着、移行および保持のカスケードに関連する特定の側面に焦点を当てます。純粋に記述決定周辺機器または肺に浸潤リンパ球のインテグリンとケモカイン受容体の mRNA やタンパク質の発現パターンとそれぞれケモカイン、血中レベルの相補的な測定のほか気管支肺胞洗浄 (BAL) または肺組織12,13,14,15、老舗の in vitro における細胞培養の試金によりリンパ球の接着や走化性の機能解析実験条件16,17,18を定義します。原則として、静的体外付着の試金監視培養リンパ球内皮細胞の単層または組換え内皮細胞接着分子 (例えば、MAdCAM 1、VCAM 1) でコーティングされたガラスの結合容量標準体外走化性アッセイは、transwell システム19のケモカイン勾配に沿って移行するリンパ球の機能を定量化するために通常適用されます。体外の両方の設定は制御調整と実験条件の変調を有効にするが、一方で批判的に体内の走化性とリンパ球の接着に影響する知られている重要な変数がないです。主に、静的な細胞培養の試金は恒久的な血流19によりせん断力の影響を無視し、可能性のある周囲の免疫環境と相互作用する非リンパ球免疫細胞の関与を無視両方の生きている有機体の存在。これらの制限を克服するために静的なインビトロ走化性または付着試験で取得した結果の解釈に必要なさらにフロー条件20,21の下での動的付着実験で検証炎症性器官病理学19の生体モデル。確かに、T 細胞肺の炎症やアレルギー性の条件の下でホーミングの規制に関する結論動物の研究から重要な遺伝子分析変更異なる肺疾患3、に定義されたモデルのマウス22,23. 興味の特定の遺伝子が特定の細胞の影響を定義するためよく確立され、広く使用されているツールを表すため欠損マウスと野生型マウスのリンパ球の浸潤肺の定量的比較経路や T 細胞分布の病気の駆動パターン上の受容体。しかし、対照的に培養細胞培養の試金を議論する前に古典的な動物モデルに基づく研究デザインを欠いている分析し、主なヒト T 細胞血液または炎症性肺を患っている患者のバルから直接派生を監視する能力病気。したがって、それはまだ機能的診断によって指定された肺疾患が優遇肺トロピズムと臨床パラメーター可能性がありますこのシナリオに影響を与えるどの程度までの人間のリンパ球をインプリントすることができるかどうかを検証する挑戦的なままです。最近では、非常にエレガントな生体内でのアプローチは、これらの制限のほとんどを克服することができたし、腸管リンパ球ホーミング24 トランスレーショナル研究の新時代が開かれた炎症性腸疾患 (IBD) のコンテキストで導入されました。.強力なイメージング ツールとして断面光シート蛍光顕微鏡に続いて溶媒基づく組織クリアするためのプロトコルを活かし、浸潤に対して転送ヒト T 細胞の分布を視覚化する可能だった24合併免疫不全マウスの腸。特に、この実験の設定は 2 つの主要な技術革新を実装: 実験的定義の生体内での条件の下で (1) 主な人間の免疫細胞を分析できます(2) 病気にかかった器官の幾分大きい区域 (約 1.5 cm × 1.5 cm) の高画質、3 D 再構築が続くイメージを作成することができます。また、いくつかの最近の研究は、正常に肺癌25,26をイメージングのための重要なツールとしてオフ溶剤系組織と光シート蛍光顕微鏡の使用を設立しました。肺の免疫学の分野でこの技術の進歩から利益のために我々 は今肺ホーミングの分析システムを採用しました。

浄化する方法と蛍光ラベル プライマリ ヒト T 細胞の肺炎症を誘導したマウスに転送するためと、また、光シートの後続のプロセスの詳細に説明します、ここで提示されたプロトコルが紹介の手順蛍光顕微鏡イメージング、器官の準備、画像処理など。全体的に、洗練された、生体内での条件の時にリンパ肺ホーミングを監視するためそれにもかかわらず可能、実験的モデルを導入することによって炎症やアレルギー性の肺疾患の分野で将来の橋渡し研究を支援していきます。

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プロトコル

エルランゲン (Regierung ・ フォン ・ Unterfranken、ヴュルツブルク、ドイツ) に関連する地方自治体によって承認されたプロトコルに従い動物を含む実験を行った。マウスに特定の病原体フリーの条件の下で収容されました。人間の血のコレクションは、ローカル倫理委員会とエアランゲン ・ ニュルンベルグ大学の倫理委員会によって承認されました。各患者は、書面によるインフォームド コンセントを与えた。

1. マウスのアレルギー性の肺の炎症を誘発します。

注:以前の研究27に記載されている、次の実験マウスのアレルギー性気道炎症を誘発することができます、したがって、BAL で自然免疫と適応免疫細胞の蓄積をトリガーします。記述されていたプロトコルは c57bl/6 j マウスで確立されていますが、他近交系標準に採用は可能なはず。

図 1生体内で実験手順の概要についてを参照してください。

  1. ケタミン ・ キシラジンの腹腔内投与によるマウスを麻酔します。
    注:    だけ少なくとも 16 g の体重と 6 週間以上古い c57bl/6 j マウスを使用します。
    1. PBS (12 mg/mL ケタミン; 1.6 mg/mL キシラジン) でケタミン ・ キシラジン ソリューションを準備し、マウスの正確な体重を決定します。
    2. ケタミン ・ キシラジン ソリューションの 8 μ L/g の体重で最初のマウスを腹腔内注入し、1.3 のステップに進む前に前足ピンチ反射の不在によって深い麻酔を確認します。
  2. たて 5 mg/mL の PBS のパパインを準備します。ゆっくりと鼻孔にパパイン液の 10 μ L (50 μ g) をピペットします。覚醒までマウスを注意深く監視します。
  3. 手順 1.1 と 1.2 を実験に含まれているすべてのマウス。連続 3 日間 1.1-1.3 の手順に従います。

2. 浄化し、人間の末梢血 CD4 の蛍光ラベル+ T 細胞

注:無菌条件下でプロセスのセルです。

  1. 末梢静脈から 18 ミリリットルの血液を完全に人間を収集します。末梢血単核球 (PBMC) の一部を選択するために Ficoll 後腹勾配遠心を実行します。
    注:主なひと由来の材料の収集と分析はローカル倫理的な当局によって承認される必要があります。末梢静脈から血液を収集するために十分な医療資格を持つ人だけとなっています。
    1. エチレンジアミン四酢酸 (EDTA) に採血の凝集を避けるために monovettes (1.6 mg/mL の EDTA 血) を含みます。
      オプション:バフィー コート血、血寄付完了の静脈血ではなく、白血球の濃縮の副産物を使用します。
    2. 50 mL の円錐管に血液を移すし、リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) で 1:2 を希釈します。慎重に Ficoll 培地 10 mL を追加 (密度 1.077 g/mL) 希釈血液の下底層として。遠心分離機のサンプル (800 x gブレーキしなくても室温で 15 分間)。
    3. 慎重に遠心分離機からチューブを削除し、新しい 50 mL の円錐管に PBMC を含む中間期を転送します。上と下のレイヤーを破棄します。PBS と遠心分離機 (300 x g 4 ° C で 10 分間) PBMC を含む管を埋めます。上澄みを除去します。
      注:必要に応じて、必要に応じて、残りの赤血球の溶解を行います。慎重に再懸濁細胞ペレットと渦サンプル 3 mL のアンモニウム塩化カリウム (ACP) 換散バッファー (155 mM 塩化アンモニウム; 19 mM カリウム水素炭酸と 0.68 mM EDTA、pH 7.27) を追加します。3 分の管を振る。ACP の換散バッファーを削除するには、40 mL の PBS の遠心分離機 (300 x g 4 ° C で 10 分間) を追加します。上清を捨てます。
  2. CD4 を浄化+ T 細胞の CD4 ビーズを介して。
    注:一般に、人間の CD4 の浄化用磁気ビーズのいくつかの代理店がある+細胞は、細胞の純度の同等のレベルになります。製品の選択は、個人の好みをに基づく必要があります。プロトコル (2.2.2–2.2.7) の次の手順は、定義された CD4 ビーズ製品と材料表のとおりさらにそれぞれ分離カラムに調整されます。プロトコルのいくつかの変更は、代替の CD4 ビーズ製品が選択されている場合必要があります。
    1. 最低 0.5% ウシ胎児血清 (FBS) と 10 に 2 mM EDTA (PBS、FBS EDTA-バッファー) を含む 80 μ L の PBS の PBMC ペレットを再懸濁します7 PBMC。使用約 30 × 106約 3 x 106 6 × 106終わるのための PBMC の開始人口精製ヒト CD4+ T 細胞。
    2. CD4 ビーズ 10 あたりの 20 μ L を追加7 PBMC、穏やかに混合し、4 ° C で 20 分間インキュベートPBS/国債/EDTA-バッファー (4 ° C まで冷却) と遠心力 (300 x g 4 ° C で 10 分間)、管を埋めます。上清を除去します。
    3. 磁気フィールドに分離カラムを配置します。3 mL の PBS/国債/EDTA-バッファーの列をすすいでください。500 μ L の PBS/国債/EDTA-バッファー (4 ° C まで冷却) で細胞ペレットを再懸濁し、磁気フィールド内に配置するリンス分離列に細胞懸濁液を転送します。
    4. 3 回に 3 mL の PBS/国債/EDTA-バッファー (4 ° C まで冷却) 分離カラムを洗浄し、排水を破棄します。
    5. 磁気フィールドから分離カラムを削除し、15 mL チューブに入れます。溶出が CD4+プランジャーを使用して PBS/国債/EDTA-バッファーの 5 mL の細胞画分。
    6. PBS および遠心分離機 (300 x g 4 ° C で 10 分間) で管を埋めます。上清を除去します。この洗浄工程を 2 回繰り返します。
    7. 選択 (例えば、ノイバウアー商工会議所) の標準メソッドによって返されたセルの数を決定します。
  3. CD4 をラベル+ T 細胞蛍光細胞増殖染付。
    1. CD4 を再懸濁します PBS の+ T 細胞 (細胞/ml7 10 まで; 未満 500 μ L の PBS を使用しないでください)。
    2. 赤色光興奮性細胞増殖の 6 μ M 溶液を調製 PBS (部屋の温度で加温) で (材料の表を参照) を染めます。このソリューション 1:2 をミックス、前に作製した細胞懸濁液と渦徹底的に (3 μ M 最終濃度)。
    3. (光から保護) 37 ° C で 10 分間インキュベートします。その後、RPMI 培 10% の 5 巻を追加 FBS (光から保護) 氷の上 5 分間インキュベートし、。
    4. 洗浄標識 RPMI で 3 回細胞媒体含む 10 %fbs (300 x gで 4 ° C で 10 分間遠心)。PBS の標識細胞を再懸濁します、氷の上を格納に使用されるまでを光から保護します。
      注:細胞を長期保管 (> 60 分) 細胞の生存に悪影響を及ぼす可能性があります。
      オプション:CD4 の純度を決定する+フローサイトメトリーによる細胞分画とラベリングのプロシージャの有効性。0.5 x 10 を再懸濁します6 1 x 106 CD4 に+細胞のバッファー (1 %fbs、2 ミリメートルの EDTA PBS で) を 100 μ l 添加し好みの蛍光色素を結合した抗 CD4 抗体を追加。4 ° C で 30 分間インキュベートします。1 mL のバッファーと遠心分離機 (300 x g 4 ° C で 10 分間) を追加します。上清を捨てます。サンプルの流れフローサイト メーターによる測定を続行 (代表的な結果は、図 1B、Cに描かれている)。

3. 本人間の CD4 を転送パパイン公開受信者 Mmice に+ T 細胞

注:図 1生体内での概要は、実験の手順を実行して参照してください。パパインの最後の経鼻投与後 1 日セル転送を実行します。

  1. 蛍光に分類された人間 CD4 のサスペンションを調整+ T 細胞 (手順 2.3.4) PBS で 1 × 107細胞/ml の濃度にします。1 mL/30 G に細胞懸濁液を 100 μ l 添加を埋める-注射器。
  2. 慎重に尾静脈注射用拘束デバイスに最初のパパイン公開 c57bl/6 j マウス (手順 1.1-1.3) を配置します。尾静脈を穿刺し、1 × 106ヒト CD4 をラベルを含む細胞懸濁液を 100 μ l 添加をゆっくり注入する準備の注射器 (ステップ 3.1) を使用して+細胞。すぐに引っ張らないで針を注入後、しかし、細胞懸濁液の排出を防ぐためにさらに 5 秒間待ちます。
  3. 拘束デバイスからマウス ボタンを離します、次の動物に進みます。光シート蛍光顕微鏡用のネガティブ コントロールとして機能する蛍光標識細胞の伝達が発生しない、少なくとも 1 つのパパインにさらされた動物を維持します。

4. 光シート蛍光顕微鏡の肺組織を準備します。

注:次の手順は、転送蛍光標識ヒト細胞 (ステップ 3.2) 後 3 h が実行されます。肺組織の採取を含む記載されている実験手順、固定・消去溶剤ベースの組織現在記述されていたプロトコル24,28から適応されました。

  1. 二酸化炭素 (C02) 吸入によるマウスを犠牲に。
  2. 5 mM EDTA を含む PBS でその場での肺を灌流します。
    1. 中心部を公開する胸骨に沿って切断によって胸郭を開きます。点状 21 G カニューレと右心室は、カテーテルに接続されています。
    2. 切断することによって左心室を開いて終了する血と血流の流体を許可します。ゆっくりと 20 ml のカテーテルを介して 5 mM EDTA を含む氷冷 PBS の肺を灌流します。
  3. 肺の場固定を実行するためにカテーテルを右心室から削除しないでください。ゆっくりと 2 ml の冷たい 4% パラホルムアルデヒド (PFA) PBS で解決の肺を灌流します。カテーテル、カニューレを削除します。
    注:肺組織の場固定の PFA ベースは、後続の顕微解析29,30マウス肺組織を準備するために確立された技術を表します。
    注意:PFA は、ケアのフードの下で処理することは有毒であります。
  4. その場で 0.75% の agarose で肺を満たしなさい。
    1. PBS の 0.75% の agarose を準備しておく固体サーモ シェーカーで 50 ° c まで使用。マウスの唾液腺を削除、胸骨舌骨筋をカット、スライドの下に鉗子で気管を公開します。
    2. 30 G 針気管を露出を強調し、agarose の望ましくない漏れに気管のさらなる損傷を防ぐために鈍 30 G カテーテルで置き換えます。挿入したカテーテルと針ホルダーを使用する気管との間の接合部をシールします。
      オプション:ここにバル コレクション詳細31記載として最近バルで浸透したヒトの細胞を分析するための手順が説明されている結合 (図 2Eの代表的な結果を参照してください)。
    3. (体の温度冷却) 0.75% の agarose が付いて、肺の完全な展開までカテーテルを介して気道を慎重に記入します。agarose の凝固が完了まで待機します。カテーテルを外し、4% 暗い 2 mL チューブに肺を慎重に収穫 PFA。
  5. 追加固定孵化 4 %pfa は、連続回転 (31 rpm) 下 4 ° C で 2 時間 PBS の解決でサンプルのため。
  6. 50% エタノール (pH 9)、70% エタノール (pH 9) で 4 ° C でその後連続回転 (31 rpm) の下でサンプルの孵化によって組織を脱水し、100% エタノール;少なくとも 4 時間の各ステップ。最後に、4 h の新鮮な 100% エタノールで 2 番目のインキュベーションを実行します。
  7. 桂皮酸エチル (ECi) を使用して組織の溶剤ベースのクリアを実行します。したがって、ECi にサンプルを転送します。インキュベート組織半透明 (図 1Dの代表的な画像を参照してください) が表示されるまで (一定の回転) の下で室温で一晩。
    注:常温 (光から保護) ECi に格納されているサンプルは数ヶ月に数週間にわたって安定しています。

5. Wwhole マウス肺野光シート蛍光顕微鏡を実行します。

注:光シート蛍光顕微鏡と対応するソフトウェアは、次の手順を実行の基になる詳細については材料の表を参照してください。ただし、他のメーカーで同等のシステムは以下のプロトコルの開発者固有の変更にも使用できます。始める前に、特定の顕微鏡の操作マニュアルに慣れるし、サイトの責任者から技術的な指示に従います。

  1. 光シート顕微鏡を設定します。
    1. 光シート顕微鏡をオンにし、対応するコンピューター上のソフトウェアを画像を開きます。フィルター処理された ECi (100 μ m フィルター) と試料室を埋めるし、レーザー ビーム間の位置にそれを置きます。
    2. サンプル ホルダーに肺を固執するのに有機溶媒に安定な接着剤の小さなドロップを使用します。光シートの必要な溶け込みを可能な限り小さく保つために、直立した肺葉, 肺区域を設定します。次に、その商工会議所のサンプル ホルダーを配置します。
    3. 試薬をクリアとして ECi を使用すると、目的の屈折を 3.5 に設定します。
  2. 全臓器のコンテキストで人間の細胞を検出する光シート顕微鏡で設定を調整します。
    1. 必要なレーザーを選択 (測定用フィルター > 必要なレーザーのチェック ボックスをアクティブにする) 制御ソフトウェアで適切な強度を選択し、(レーザ伝送制御 >レーザー強度を設定するスライダーを使用して >適用)。488 の励起波長を使用して検出される肺組織と 640 nm (525/50 フィルター) nm (680/30 フィルター) 赤いスペクトルの蛍光体発光の付いた人間の細胞を刺激します。
    2. 488 に興奮のサンプルに焦点を当てる nm と 640 の励起波長で「色収差補正」ツールを使って焦点を合わせる nm (色収差補正を設定するスライダーを使用 > 適用).
    3. 適切な倍率を選択します。低倍率の概要を使用して、(例えば、6.3 x) 詳細なローカリゼーションのため肺組織と拡大画像 (例えば、32 x) 内の標識細胞の全体的な分布を決定します。
    4. 全体の器官または興味の特定のセクションを均一に解明のシート幅を選択 (光学 > シート幅を設定するスライダーを使用; 20-40% の間に通常)。鮮明な画像を作成する高い NA とシート開口数 (NA) を定義 (光学 > シート NA を設定するスライダーを使用; マウス肺葉 0.025% の NA を使用多くの場合ことができますその生理学的なサイズに拡張)。
    5. 「高度な計測設定」で使用する光シートの数を選択します。双方向の照明の場合マージゆく照らされたイメージを作成する左と右の光-シート (高度な > lightsheets をマージ > 選択ブレンド モード > スライダーを使用して、両方の光シート間の重複を定義します)。
      注:光 - 3枚各サンプルの双方向照明の活用することをお勧めします。
      オプション:さらに画質が向上、動的なフォーカス操作を使用します。これにより、画像取得時に x 方向にフォーカスを移動します。
    6. 測定およびステップ サイズを 5 μ m に設定する z スタックの開始と終了の位置を定義 (xyz テーブル Z > スキャン範囲)。
      注:Z スタックの開始と終了の位置は試料室内肺葉のサイズや位置に依存します。しかし、約 300 に 800 z スタックは通常単一の肺葉 (5 μ m ステップ サイズ) を取得します。
    7. [自動設定] を使用してファイルを保存し、画像をキャプチャする測定を開始します。仕上げのデータ集録後 ECi 汚染試料ホルダーと流水の下で部屋をきれいに。
      注:同じ設定を使用すると、その後の比較になっている複数の肺葉をイメージします。

6. 後画像処理とひと細胞の肺蓄積の定量化

注:3 D 解析、次の手順が基づいているの後のイメージング ソフトウェアの詳細については材料の表を参照してください。ただし、代替ソフトウェアを撮影後を同様に使用できます。

  1. Z スタックの最初のイメージを読み込む (越えのボタン、ファイル > 開く > 選択イメージ) 選ばれた z スタックとその自動 3次元再構成の他のすべてのイメージの開始を開始するために。
  2. X を正しく表示するには、y と z の寸法は、ボクセル サイズをチェックに応じてそれらを調整して、(編集 > 画像のプロパティ > ボクセル サイズを手動で入力する)。Z のボクセル サイズ、2 つのイメージ (ここで 5 μ m) の間選ばれたステップ サイズを入力します。
  3. 各チャンネルを個別の色で表示 (編集 > ディスプレイの調整を表示)。好みの色を定義する他の後の 1 つ各チャンネルをクリックして (図 2A、B、C、D蛍光信号は灰色に表示され、人間の CD4 をラベル赤細胞の+ )。
  4. 強度、黒レベルと各チャンネルのコントラストを調整 (編集 > ディスプレイの調整を表示) チャンネル バーの三角形を使用してまたはチャネルの設定で正確な数値を入力します。強度の調整、直角三角形を使用します。黒レベル調整、左の三角形を使用し、コントラストの調整、真ん中の三角形を使用します。
    注:肺の使用は携帯転送 (ステップ 3.3) 特定のひと細胞由来の信号と非特異的背景を区別せずコントロール マウスに由来します。
  5. 定量化する肺組織内標識細胞 'の新しいスポットを追加」ツールバーの使用と選択 '自動作成をスキップ, 手動で編集' 手動セルをカウントするため。
    注:    また、数える 'スポット' 下ツール自動セルを使用します。ただし、特定と不特定の信号をより正確に区別することができます手動カウントします。
    1. 3 D 切削工具を使用して、特定のボリュームで肺キューブを定義の異なるサンプルの間で、人間の細胞の蓄積を比較する (編集 > 作物の 3 D) (ここで 813 μ x 813 μ x 1,000 μ m)。
    2. 640 nm チャンネル蓄積されたセルを選択をカウントし、10 μ m の '半径スケール' を定義します。「編集」をクリックして、ポインター メニューで「選択」をチェックし各セル マウスの左ボタンと shift クリックでドットをマークします。全体的な統計情報に表示されるカウントのセル数を見つけます。
      注:カウントの肺容積の科学者依存性選択の肺葉 (ここ 5) 結果の信頼性を確保し、補償にあたりいくつかのキューブをカウントする勧め (定量化の戦略と代表の結果はで表示されます2 D を図)。
  6. 'スナップショット' ツールを使用してイメージをキャプチャおよび/または 'アニメ' ツールを使用してビデオを取る。保存調整 .ims ファイルとしてファイル (ファイル > エクスポート)。
    注:代表的な目的の表示またはツールバーのフレームをオンまたはフレームを非表示。さらに、画像の表示は最大強度の投射 (MIP) のいずれかとして (ツールバー > ボリューム > モード > MIP をチェック) '表面 'モードを使用または (ツールバー > 新しいサーフェスを追加)。'表面モード' が組織アーキテクチャおよび/または細胞体 (代表的な画像が表示されます図 2C) を強調する各チャンネルで個別にアクティブ化されます。

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結果

提案するプロトコルは、監視と定量化ライト シート蛍光顕微鏡を介して肺に対して転送ヒト T リンパ球の蓄積を可能にするマウスの実験的モデルをについて説明します。図 1A実験スケジュールの生体内での手順の図式的な概観を提供します。信頼性の高い結果を保証するためには相当な重要性、分離および蛍光良い品質を確保するのにラベル付けヒト CD4+ T 細胞は、その後マウスに転送されます。図 1B、C、ビーズを利用した細胞濃縮とその後蛍光ラベル化通常のため上記の説明手順に代表して描かれる流れ細胞の結果決定 CD4+ T 細胞純度 > 95%すべての CD4 の成功した蛍光標識と+ T 細胞。光シート蛍光顕微鏡の質および浸透の深さは批判的に組織の清算の適切な等級によって異なります。図 1Dで示されているよう...

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ディスカッション

ここで説明されている実験の設定提供古典的な体内の炎症性条件およびそれにより適切補完したプライマリ人間免疫細胞のホーミング肺活量を監視する機会を実行体外密着性と走化性試金。肺のアカウント特定の解剖学的な臓器特性を考慮に、臨床的意義および集録したデータの譲渡 (標的臓器内の走化性、細胞の分布) を含むホーミング免疫細胞の重要な側面を撮りました3 技術的なキー機能の活用: (1); マウス生物内ひと初代細胞の解析(2) の肺炎症; パパインを介する誘導クリアされた肺組織の (3) の光シート蛍光顕微鏡。

受容体リガンドの相互作用マウスと男性の一般的な概念との間に関連する可能性の非互換性のためのいくつかの側面で生マウス体内で免疫細胞機能学に対して人間転送が限定されます。ヒト化マウスモデルのいるトランスレーショナル医学の分野で重要な実験ツールとして正常に中に確立されて、最後の数十年24,32,

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開示事項

M. f. ノイラートはペンタックス、ジュリアーニ、MSD、Abbvie、ヤンセン、武田、ベーリンガーの顧問として役立った。残りの著者は、任意の競合を開示しません。

謝辞

著者は、DFG 共同研究センター SFB 1181 TRR 241 で感謝します。光学イメージング センター エルランゲン (入居) と特定のラルフ パルミサーノ ・ フィリップ ・ Tripal ・ ティナ Fraaß (DFG CRC 1181 のプロジェクト Z2) 光シート蛍光顕微鏡イメージングのエキスパート技術サポートのために認めています。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
Agarose NEEO UltraCarl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany2267.4
AlexaFlour594 anti-human CD45 antibodyBioLegend, San Diego, USA304060
Ammoniumchloride Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, GermanyK2981
Cannula 21 GBecton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, USA301300
Cell proliferation dye eflour670eBioscience Inc., San Diego, USA65-0840-85
CD4 MicroBeads, humanMiltenyi Biotech GmbH, Bergisch-Gladbach, Germany130-045-101
EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid)Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany8043.1
Potassium-EDTA blood collection tube, 9 mLSarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany21066001
Ethly cinnamate (ECi)Sigma-Aldrich, Steinheim, Germany112372-100G
Ethanol ≥ 99.5% (EtOH)Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany5054.3
FBS (feal bovine serum) Good FortePAN-Biotech GmbH, Aidenbach, GermanyP40-47500
Filter 100 µm VWR International Germany GmbH, Darmstadt, Germany732-2758
Imaris Image Analysis Software 9.0.2Bitplane AG, Zurich, Switzerlandn.a.ImspectorPro
softwareAbberior Instruments GmbH, Göttingen, Germanyn.a.Ketamin
 Inresa Arzneimittel GmbH, Freiburg, Germany3617KET-V
LaVision UltraMicroscope IILaVision BioTec GmbH, Bielefeld, Germanyn.a.MACS
MultiStandMiltenyi Biotech GmbH, Bergisch-Gladbach, Germany130-042-303
Multifly cannula 20 GSarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany851638035
30 G needleB. Braun Melsungen AG, Melsungen, Hessen, Germany9161502
Neubauer counting chamberneoLab Migge GmbH, Heidelberg, GermanyC-1003
Pattex GlueHenkel AG &共同、Düドイツ、セルドルフPSK1C
LS カラムMiltenyi Biotech GmbH, Bergisch-Gladbach, Germany130-042-401
リンパ球分離培地 (密度 1,077 g/mL)anprotecAC-AF-0018
PapainMerck1,071,440,025
PBS Dulbecco (リン酸緩衝生理食塩水)Biochrom GmbH, Berlin, GermanyL182-10
PerCP/Cy5.5 anti-human CD4BioLegend, San Diego, USA317428
PerCP/Cy5.5 mouse IgG2b, κ isotype CtrlBioLegend, San Diego, USA400337
PFA (パラホルムアルデヒド)Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany0335.1
炭酸カリウムCarl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, GermanyP7481
血清学ピペット 10 mLSarstedt AG & Co., Nümbrecht, ドイツ86.1254.001 
シリンジ 1 mLB. Braun Melsungen AG, Melsungen, Hessen, Germany9166017V
シリンジ 5 mLBecton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, USA260067
シリンジ 20 mLBecton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, USA260069
Tube 1.5 mLSarstedt AG & Co., Nümbrecht, ドイツ72,706,400
チューブ 2 mLSarstedt AG & Co., Nümbrecht, ドイツ72.695.400 
チューブ2 mL、茶色Sarstedt AG&Co.、Nümbrecht, ドイツ72,695,001
チューブ 15 mLSarstedt AG & Co., Nümbrecht, ドイツ62.554.502 
チューブ50 mLSarstedt AG & Co., Nümbrecht, ドイツ62.547.254 
QuadroMACS SeparatorMiltenyi Biotech GmbH, Bergisch-Gladbach, Germany130-090-976
Xylazin (Rompun 2%)Bayer Vital GmbH, Leverkusen, GermanyKPOBD32
の

参考文献

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