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方法論記事

2 血管閉塞マウス脳虚血・再灌流モデル

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DOI:

10.3791/59078

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2019年3月1日

 ,  , 
1Research Center of Translational Imaging, College of Medicine, Taipei Medical University, 2Radiogenomic Research Center, Taipei Medical University Hospital, Taipei Medical University, 3Department of Radiology, School of Medicine, College of Medicine, Taipei Medical University, 4Department of Medical Imaging, Taipei Medical University Hospital, Taipei Medical University, 5Department of Medical Research, Taipei Medical University Hospital, Taipei Medical University, 6Department of Surgery, School of Medicine, College of Medicine, Taipei Medical University, 7Division of General Surgery, Department of Surgery, Taipei Medical University Hospital

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

脳虚血再灌流のマウス モデルを確立して、脳卒中の病態を調査します。我々 は遠位右中大脳動脈と右総頚動脈を結紮し、10 または 40 分間虚血後血流を復元します。

要約

本研究では中大脳動脈 (MCA) 閉塞マウス モデルを用いて、脳虚血・再灌流を検討します。再現性と信頼性の高いマウス モデル、脳虚血・再灌流の病態を調査し、脳卒中患者の潜在的な治療戦略の決定に役立ちます。ウィリスの c57bl/6 マウスのサークルの解剖学の変化は、虚血性脳傷害後梗塞体積を影響します。研究は、その遠位部の MCA 閉塞 (MCAO) することができますこの問題を克服し、安定した梗塞サイズに示されています。本研究では、右 MCA への血流遮断による脳虚血・再灌流の 2 血管閉塞マウス モデルを確立します。我々 は遠位方向右 MCA と右総頚動脈 (CCA) を縛るし、虚血のある特定の期間後に血流を復元します。この虚血再灌流傷害は、安定したサイズと行動の赤字の梗塞を誘発します。末梢の免疫細胞は、24 h 浸透期間内虚血性脳を潜入します。また、皮質の領域で神経細胞の損失より長い再灌流時間の少ないです。したがって、この 2 血管閉塞モデルは脳虚血後再灌流期間中に免疫応答と神経回復の調査に適しています。

概要

脳虚血・再灌流マウス モデルは、虚血性脳損傷1病態生理学を調査するための最も広く使用されている実験的アプローチの一つです。脳虚血・再灌流は、末梢の免疫系を活性化ため、末梢の免疫細胞は虚血性の脳に潜入し、引き起こす神経損傷2。したがって、脳虚血・再灌流を模したマウスの信頼性と再現性のあるモデルは、脳卒中の病態生理を理解する必要です。

C57bl/6 j (B6) マウスでは、遺伝的に操作する簡単にことができますストローク実験で最も一般的に使用されるひずみです。脳虚血再灌流の状態を模した MCAO/再灌流の 2 つの一般的なモデルがあります。最初のシリコン コーティング フィラメントを採用して巡って MCA; 血流を閉塞する近位の MCAO の腔内のフィラメント モデルです。遮蔽のフィラメントはその後血流3を復元する削除されます。閉塞期間が長い場合は、皮質と皮質下のエリアの梗塞を引き起こすに対し、短い閉塞期間は皮質領域の病変の結果します。2 番目のモデルは、管外結紮縫合と動脈瘤のクリップ4の取り外しによって後の血流が回復、MCA の血流を減らすために MCA と CCA を含む遠位 MCAO の結紮モデルです。このモデルで皮質野に、梗塞が生じるし、死亡率が低い。MCAO/再灌流モデルの結紮は頭遠位 MCA のサイトを公開する必要があるので、サイトを簡単に確認することができます、プロシージャ中遠位 MCA の血流が中断されるかどうかを調べることは簡単です。

B6 マウス展示; ウィリス動脈輪の解剖学にばらつき脳虚血・再灌流5,6、7の後梗塞ボリュームに影響を与える可能性があります。現在、遠位 MCA8の結紮によってこの問題を克服することができます。本研究では、MCA 血流を閉塞し、一定期間虚血後再灌流の方法を確立します。脳虚血-再灌流モデルの 2 血管閉塞は、虚血の一定の期間の後で復元の血流と右遠位 MCA と右の CCA の結紮による MCA 領域の一過性虚血を誘発します。この MCAO/再灌流モデルは、脳虚血-再灌流4後安定したサイズ、虚血性の脳と行動の赤字で脳浸潤の免疫細胞の一括の梗塞を誘発します。

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プロトコル

制度上のアニマル ・ ケアおよび中央研究院、台北医科大学の使用委員会、実験動物の使用のためこのプロトコルを承認しました。

1. MCAO/再灌流モデル

  1. 手術までには、水と食事への無料アクセスとマウスを提供します。
  2. オートクレーブ手術ツールし、手術テーブルと 70% のエタノールを使用して機器を校正します。サージカル マスクと滅菌手袋を着用します。乾燥ビーズ滅菌器を使用して、複数マウス手術は 1 つの実験で行われます場合、手術器具を滅菌します。
  3. 8-12 週齢マウスの麻酔 (質量: 25-30 g) 0.8% 水クロラール、腹腔内注射を介してを使用しています。麻酔下のマウスがないペダル反射 (テストとしてしっかりつま先ピンチを使用して)、anesthetization の後を確認します。
  4. 麻酔下ではマウスの目の乾燥を防ぐために獣医軟膏を使用します。
  5. 非観血的血圧測定システムを使用すると、マウスの血圧を監視します。
  6. その直腸温と動脈血液ガスを監視するのに生理学的モニタリング システムを使用します。36.5 ± で体温を維持 0.5 の ° c.
  7. 予防的抗生物質 (25 mg/kg セファゾリン)8マウス皮下注入します。
  8. 仰臥位加熱パッドの上にマウスを配置します。
  9. 電気バリカンを使って、腹側頸部だけでなく、右目と右耳の間の領域でのマウスの毛皮を削って皮膚を公開します。
  10. 脱毛クリームを使用してマウスの体内から毛皮をクリアし、交互に povidione ヨウ素と 70% エタノール scrbus 手術部位を消毒します。
  11. アイリスはさみを使用して、首に 1 cm 長い正中切開をカットします。
  12. アイリス鉗子を使用して、慎重に物理的な損傷を引き起こすことがなく迷走神経から無料の CCA を解剖します。
  13. 5-0 絹糸を使用すると、CCA を分離します。
  14. 右目と右耳の中間点で頭皮で 0.3 cm の切開を行います。
  15. 刀を使用して、頬骨と squamosal 骨を公開する側頭筋をカットします。
  16. ステレオ解剖顕微鏡の下で、ドリルして右側に遠位 MCA の真上 2 mm 径の穴を作成します。
  17. 10-0 縫合糸を使用して右側に遠位 MCA のトランクを縛る。
  18. 非外傷性脳動脈瘤クリップを使用して右側に CCA をオクルードします。
  19. 虚血の 10 または 40 分後動脈瘤クリップと MCA と CCA に血流を復元する縫合を削除します。
  20. 頭に皮膚切開を密封するのに縫合クリップを使用します。
  21. 縫合やステープル9首の皮膚を閉じることによって続いて縫合を用いた頚部皮膚切開をシールします。
  22. 痛み救済9に対するブプレノルフィン (0.1 mg/kg) を皮下注入します。
  23. それは完全に麻酔から回復まで 36.5 ± 0.5 ° C 加熱パッドでマウスの体温を維持します。それは完全に回復するまで他の動物の会社に手術を受けた動物は返されません。それは十分な意識を取り戻すまで、無人すぎる動物は放置しないでください。
  24. 自由に水をアクセスし、チョウは完全に回復した後、オートクレーブのケージにマウスを配置します。

2. 塩化 2,3,5 トリフェニルテトラゾリウム染色

  1. マウス腹腔内注射を介して 0.8% 抱水クロラールとの麻酔します。
  2. 営業のはさみを使って、動物の首をはねます。
  3. 頭の皮膚に切開を行いますにアイリスのはさみを使って頭蓋骨を公開します。
  4. 前頭骨の前部をカットするはさみを営業に使用します。
  5. アイリスはさみを使用して、矢状縫合線に沿って頭蓋骨をカットします。
  6. 骨 rongeur を使用して、前頭部および頭頂骨を押しのけて、脳を公開します。
  7. アイリス鉗子を使用して、脳を解剖します。
  8. マウス脳マトリックスとかみそりの刃を使用して 2 mm コロナ スライスを取得します。
  9. 1 リン酸緩衝生理食塩水 x 2 %2,3,5 - 塩化トリフェニルテトラゾリウム) 37 ° C で 10 分間の脳切片を染色します。
  10. 2 脳をリンス 10% ホルマリンで x。
  11. 24 時間室温で 10% ホルマリンで脳を修正します。

3. 梗塞サイズの測定

  1. きれいなプラスチック スライドのセクションを配置し、吻側から尾側のセクションの向き。
  2. スキャナーを使用してスライドをスキャンします。メトリック定規を置き、スキャンした画像に表示されていることを確認します。スライドを裏返して裏面をスキャンします。
  3. ImageJ のソフトウェアを使用して各セクションの梗塞領域を計算します。
    1. イメージファイルを開き、イメージのスケールを設定します。
    2. フリーハンド選択範囲を使用して、領域の梗塞部位を選択します。
    3. 利益 (率 ROI) マネージャーの領域を使用して、関心のある領域を測定します。
  4. 各セクションの梗塞領域を合計し、結果総梗塞体積を推定する切片厚を掛けます。

4. 統計解析

  1. グラフパッド プリズム 6 を使用して、学生のtの統計的有意性を決定するためのテストします。
    注: バー グラフの誤差範囲 (SEMs) 平均値の標準誤差を表しています。
  2. 使用 G * 電力 3.1 適切なサンプル サイズを計算し、電力解析10を実行します。

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結果

この MCAO/再灌流手順は、右 MCA 周辺皮質梗塞を生産し、行動の赤字の原因します。虚血性梗塞量 (図 1 a, B) と (図 1d) 神経細胞の損失の程度が異なるが結紮期間の増加を通じて右 MCA 領域の大脳皮質で作成されました。この MCAO/再灌流障害は、MCAO 灌 (図 2) 後 48 h で動物の自発運動を減少しました。末梢免疫細胞 (CD45高細胞) の一括は、虚血性脳 (同側半球) を潜入しても、脳虚血-再灌流後 (図 3)。また、MCAO モデルでこの 2 血管閉塞モデルを比較し、これらの 2 つのモデルの梗塞体積が大幅に異なる (図 4) でなかったことを発見しま...

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ディスカッション

MCAO 灌マウス モデル採用して人間の一過性虚血を模倣する動物モデルであります。この動物モデルは、脳卒中の病態を検討するトランスジェニック、ノックアウト マウス系統に適用できます。プロトコルのいくつかの手順は、特に重要です。(簡単に MCA から出血を引き起こす不適切な行動で、頭蓋骨に穴を作成するときは、1) ドリルを慎重に使用する必要があります。(2) の MCA が破損していない必要がありますと結紮プロシージャの前後に出血回避する必要があります。MCA の損傷7脳虚血再灌流のレベルに影響を与えます。MCAO 後 MCA 再灌流状態を確認する必要があります。咬合と MCA に血流の回復は、レーザーのドップラーを使用して分析できます。(3) CCA は、CCA 分離中に出血する必要があります。(これは梗塞サイズと死亡率の確率を高めることができるので、4) 迷走神経を CCA 分離中に破損していない必要があります。(5) マウスの体温は、36.5 ± で維持されるべき 0.5 の ° c.温熱療法には、梗塞サイズと死亡率11の確率が増加します...

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開示事項

著者が明らかに何もありません。

謝辞

この作品は、省の科学と技術、台湾 (最も 106-2320-B-038-024, ほとんど 105-2221-E-038-007-MY3 と最も 104-2320-B-424-001) と台北医科大学附属病院 (107TMUH-SP-01) によって支えられました。この原稿は、ウォレス学術編集することによって編集されました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
ボーンロンジャーディーナーフリードマン
ブプレノルフィンΣB-044
セファゾリンΣ1097603
クロラール水和物Σ C8383
解剖顕微鏡ニコンSMZ-745
電動クリッパーペットプロ
10%ホルマリンシグマF5304
Germinatorドライビーズ滅菌器Braintree Scientific
Iris ForcepsKarl Klappenecker10 cm
Iris ScissorsDiener9 cm
Iris Scissors STRKarl Klappenecker11 cm
MicrodrillStoeltingFOREEDOM K.1070
マイクロハサミ-VannasHEISSH-4240刃 7mm、8cm
マウス脳マトリックスワールド精密機器
非侵襲的血圧システム室町MK-2000ST
手術ハサミ STRカール・クラッペネッカー14cm
生理モニタリングシステムハーバード大学装置
カミソリブレードEver-Ready
Stoelting げっ歯類ウォーマーStoelting53810加熱パッド
縫合糸クリップStoelting
ピンセットIDEALTEKNo.3
Vetbond3M15672外科用接着剤
10-0 縫合糸UNIKNT0410
2,3,5-トリフェニルテトラゾリウム塩化物SigmaT8877

参考文献

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