方法論記事

微結晶の時間分解フェムト秒シリアル結晶学 x 線レーザーのための高粘度押出を改善

DOI：

10.3791/59087

⸱

2019年2月28日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Biology and Chemistry - Laboratory for Biomolecular Research, Paul Scherrer Institut, 2Photon Science Division - SwissFEL, Paul Scherrer Institut, 3RIKEN SPring-8 Center, 4Department of Cell Biology, Graduate School of Medicine, Kyoto University, 5Department of Biology, ETH Zürich

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

シリアル フェムト秒の時間分解構造解析実験の成功は、効率的なサンプル配信に依存します。ここでは、我々 は高粘度 404 マイクロ押出しインジェクターからバクテリオロドプシン微結晶の押し出しを最適化するためにプロトコルを説明します。方法論は小説 3 ウェイ カプラー サンプルの均質化と高速度カメラによる可視化に依存しています。

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

高粘度 404 マイクロ押出しインジェクターは、x 線自由電子レーザー (Xfel) でシリアル フェムト秒結晶構造実験 (特撮) のサンプル消費を飛躍的に短縮しています。一連の光駆動プロトン ポンプ バクテリオロドプシンを使用して実験がシリアル フェムト秒の時間分解結晶構造解析 (TR 特撮) の構造の変更を解決するための結晶を提供する希望のオプションとしてこれらのインジェクターを設立してさらにphotoactivation 後蛋白質。高品質の複数の構造スナップショットを得るためには、大量のデータを収集し、すべてのポンプ レーザー パルス間結晶のクリアランスを確認することが不可欠です。ここでは、我々 は我々 は最近 TR SFX 実験リニアック コヒーレント光ソース (ローレンスリバモア) でのバクテリオロドプシンの微結晶の押し出しを最適化する方法の詳細について説明します。メソッドの目的は安定的かつ継続的な流れの率を高めるため結晶の高密度を維持しながら押出を最適化、TR SFX で収集できるデータで実験します。我々 は高速で撮影した押出成形安定性の測定に基づくサンプル組成を調整することによって続いてデバイスのカップリング小説 3 ウェイ シリンジを用いた結晶の均一な分布を持つ脂質キュービック相を準備することによってこの目標を達成します。カメラのセットアップ。方法論は、他の微結晶の流れを最適化するために合わせることができます。セットアップは新しいスイスの自由電子レーザー施設のユーザーに対して利用可能になります。

概要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

シリアル フェムト秒結晶 (特撮) のほとんどを追い越すときのミクロン サイズの結晶の数千から x 線自由電子レーザー (XFEL) 部屋の温度構造を決定するためのユニークな特性を悪用する構造生物学手法です。「破壊の前に、回折」原則1,2,3による放射線被害。

特撮 (TR 特撮) の時間分解拡張機能、XFEL からフェムト秒パルスは蛋白質4、5の構造変化を研究に使用されます。興味の蛋白質は、ポンプ ・ プローブのセットアップで XFEL に撃たれる直前に光レーザー (または別のアクティビティのトリガー) でアクティブ化されます。ポンプ ・ プローブのパルス間の遅延を正確に制御するには、によって異なる状態で標的タンパク質をキャプチャできます。一時間で 11 桁構造変化の分子の映画はいくつか蛋白質ターゲット6,7,8,9、ダイナミクスを研究する新たな XFEL 源のパワーを発揮します。 10、11,12,13。主に、メソッドは、近くの原子分解能でのタンパク質ダイナミクスに垣間見ることを提供する 1 つに、動的な分光学的および静的構造技術を結合します。

TR SFX のシンプルなシステムが活性化バクテリオロドプシン (bR)9,10で網膜、光化学系 II12,13、発色団のような写真に敏感な部品の内因性のトリガーを含めることができます。イエロープロテイン (PYP)6,7可逆的スイッチング蛍光タンパク質の11、または photolyzable 一酸化炭素ミオグロビン8。まだ開発中の技術のエキサイティングなバリエーションはミックスに依存しており、注入方式14,15酵素反応や構造変化16を誘導するために使用される電界を研究します。XFEL 源のみ利用されている数年間、過去の成功を将来的に外挿する、表示方法の理解に関して実際のゲームチェンとして潜在的なタンパク質機能。

生物試料は、ハイパワー XFEL パルスに単一の露出によって破壊されて、ためタンパク質結晶構造解析への新しいアプローチが必要でした。これらの手順の中で大量の制服微結晶を成長する能力開発17,18,19をする必要があります。XFEL でデータの収集を有効にするには、これらの結晶は、配信される必要があります破棄され XFEL パルスごとに更新し。Xfel 火 10 120 Hz でパルスを使用可能なことを考える、サンプル出荷はまた結晶そのままと制限消費量を維持しながら高速、安定した、信頼性の高いをある必要があります。最も成功したソリューションの中ではパルス x 線ビーム20室温結晶を含んだ脂質キュービック相 (LCP) の列をストリーミング連続を提供する高粘度 404 マイクロ押出しインジェクターです。ランダム配向結晶は、XFEL パルス散乱 x 線回折パターンが記録されている検出器の上に、受け取る LCP ストリームに埋め込まれます。膜タンパク質の結晶17,21,22,23、まだ他の高粘度キャリア メディアの成長媒体として多用される LCP サンプル配信媒体のための自然な選択だった24,25,26,27,28,29,30と可溶性タンパク質31もインジェクターの中に使用されています。高粘度インジェクター付き SFX は膜蛋白質13,32 G タンパク質共役受容体 (Gpcr)33,34,などの構造決定に成功しています。 35,36,37, ネイティブ位相38,39時間と効率的なサンプルでありながら十分なデータ品質。室温測定放射ソース28,30,40,41でだけでなくより多くのこれらの噴射装置がより日常的に使用されている現在、技術的にXfel9,10,13,42TR SFX 実験を要求しています。

匹敵する TR SFX 実験を行った流れで配信集中ノズル6,7,12液相のような他のインジェクターの種類を使用して、ただし、このメソッドは、多くの蛋白質量は使用できませんを必要とターゲットは生物学的に興味深い。液体ジェットの粘性押し出し 9.35 mg と比較して 10,000 インデックス付き回折パターンあたり蛋白質の 0.072 mg の平均消費量を使用して静的な構造の決定のためノズルは、(すなわち、約 130 倍以上サンプル報告されています。効率的な)20。高粘度インジェクターは、のみこのサンプル効率43のいくつかを犠牲にして TR SFX のための実行可能なサンプル配信デバイスに示されています。Nogly et al. (2018)10、たとえば、サンプル消費が平均サンプル消費された 10,000 人当たりのタンパク質の 74 mg と高く PYP を使用して同様の TR SFX 実験に遜色を 10,000 のインデックス付きパターンあたり約 1.5 mgインデックス付きパターン6。高粘度インジェクターは、利用できる蛋白質の量を制限する場合、または直接 LCP で結晶が成長したがって明確な利点を持っています。

対処する必要があります TR SFX 高粘度を使用して最も信頼性の高いデータをいくつかの技術的な問題に屈するインジェクター: 流れの速度が最小しきい値; 上記おく必要があります。ヒット率は、データ コレクションが遅いが表示されないレベルで維持されるべき (例えば、5% より大きい); サンプルで、過度の中断することがなく配信されます。理想的には、これらの条件が既に満たされて使用可能な XFEL 時間をできるだけ効率的に使用するスケジュールされた TR SFX 実験の前に長い。Pricipally、LCP ストリームの減速は、混合のアクティブな状態になり、1 つ以上の光レーザー パルスで活性化した結晶をプロービングまたはビームの umpumped 素材が予想される場合、励起物質をプロービングすることは可能です。インジェクションの事前テストの追加の利点は非押し出しのサンプルを変更する、詰まったノズルの取り付けに追いやられて時間として、XFEL でデータ収集時のダウンタイムを最小化し、他の保守タスクが減少します。

高粘度 404 マイクロ押出しインジェクター付き TR 特撮データ コレクションのサンプル配信を最適化する方法を紹介します。便宜上、説明方法に頼らない、x 線源へのアクセス29放射光ビームラインでの仕事とは、さらに情報予想的中率と結晶回折の。私達のプロトコル プロトン ポンプ バクテリオロドプシン10レチナールの異性化をキャプチャする実験を最適化するために開発された、押出、押出の監視が続く結晶試料の準備から始まる 2 つのフェーズで実施されます。高速カメラのセットアップを使用します。1 つの段階で結晶を含んだ LCP は最終的な混合物が目詰まりまたは減速せずサンプル環境に配信に適したことを確認する追加 LCP、低い転移温度脂質または他の添加剤を混ぜています。新しいスリーウェイシリンジ カプラーは、混合性能、サンプルの均質性を改善するために開発されました。2 番目のフェーズは、直接押出速度の安定性を測定するための高速カメラによって記録された押出試験で構成されます。ビデオのデータの分析の結果、調整させることができますサンプル準備のプロトコル実験的転帰を改善します。これらの手順は、TR SFX のデータ収集、最小限の変更で他の蛋白質を準備に適応することができ、限られた XFEL ビームタイムの効率的な使用に資する。その操作44,45とシンクロトロン28,30,40,41 にインジェクター ベースのシリアル データ収集方法の転送を始めて新しい XFEL 施設、今後数年間は確かに標的蛋白質のこれまでより広い範囲の構造ダイナミクスのエキサイティングな新しい洞察を提供していきます。

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プロトコル

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1. タンパク質結晶サンプル調製

  1. サンプルが注入される前に約 30 分結晶を含んだモノオレインの負荷 50 μ L は、100 μ L のシリンジに LCP を基づいています。
  2. 大気圧で注入のため: 2 つ目の注射器の背面に流動パラフィンのロード 10 μ L。注射器を垂直方向に押しながら、シリンジから空気の泡を放出します。
    1. 真空注入用: マグ 7.9 と 2 回目の注射器の背面に流動パラフィンの 5 μ L の負荷 5 μ L。注射器を垂直方向に押しながら、シリンジから空気の泡を放出します。
  3. パラフィン/マグ 7.9 標準的なシリンジ カプラーと注射器を接続、少量までプランジャーを軽く押すカプラーから空気をパージ (< 1 μ L) パラフィン/脂質はカプラー針の先端に表示されます。
  4. サンプル注射器をサンプルに空気を導入しないように注意しながら注射器カプラーに接続します。複数回カプラーを通じて試料を渡すことによって脂質/パラフィンのミックスします。
  5. 別の 100 μ L のシリンジに予 LCP (27 %peg、100 mM ソレンセン pH 5.6 + MO) の 20 μ L をロードします。必要に応じて空気の泡を削除します。
  6. カプラーから空の注射器を外し、注射器の標準的なシリンジのカプラーを使用してを含む結晶に予の LCP を取り付けます。100 回カプラーを介してサンプルを渡します。
    注: サンプルの混合サンプル発熱わずか46。混合されるべきである遅い速度で、サンプルの温度が一定に保たれる合理的に。
  7. 光のソースに対する透明効果のサンプルを検査します。明確な均一 LCP が形成されている場合は、1.9 の手順に進みます。
  8. キュービック相にサンプルを持って、モノオレインの 3 μ L を追加し、50 倍 (前述) を混ぜます。モノオレインの過剰を避けるために透明な相が形成されるまでにだけは、この手順を繰り返します。
    注: LCP の形成は温度依存47で、最良の結果が 20 ° C をやや上回る達成追加生体の量に必要な結晶から引き継がれる沈殿液の残留量によって異なります。
  9. 予備としてサンプル剛性 (LCP フェーズから期待どおり) と押し出す能力テスト、注射器カプラーから空の注射器を切り離すし、少量の試料を絞る注射器を垂直に保持 (< 2 μ L) カプラーを介して。押し出しのサンプルは、直立したシリンダーを形成する場合このサンプルは押出成形テストの準備です。
  10. (手順 1.5) のようにより予 LCP を追加して合計 100 μ L のサンプル量を調整します。
  11. サンプル注射器と 2 つの空の注射器を (前に連結器から空気をパージ) スリーウェイシリンジ カプラーに接続します。ミックスまで均質な少なくとも 50 倍 (または) 2 番目の注射器にサンプルの半分を渡し、同時に 3 つ目の注射器にサンプルの両方の半分を押します。
  12. 結晶の均一な分布を確認するステレオ顕微鏡下で混合サンプルの入った注射を配置します。

2. 高速カメラのセットアップを使用してサンプル押し出しのテスト

  1. 実験的パラメーターを決定します。
    1. テスト用ノズルのサイズを選択します。
      注: ノズルのサイズ、通常 50 または 75 μ m 内径 (ID) が、ID が考慮されるかもしれないおよそ 30-100 μ m から任意のサイズです。選択は平均目詰まり時、背景の散乱、サンプル消費、およびヒット率のバランスに基づいています。
    2. レーザー スポット サイズ (1/e2の直径)、および XFEL で使用されるデータ コレクション方式 (例えば、インターリーブされた光と闇) に基づいて最適な流れの速度を計算します。
    3. 所望の流量を計算する (figure-protocol-1) 最適流速からサンプルの (figure-protocol-2) と選択したノズル径 (figure-protocol-3)。
      figure-protocol-4
      流量を決定する (figure-protocol-5) 増幅率に基づく HPLC ポンプが入力されるように (figure-protocol-6) のインジェクター。
      figure-protocol-7
      最大圧力を計算 (figure-protocol-8) ノズル付属品の定格圧力から (figure-protocol-9) とインジェクターの増幅率 (figure-protocol-10)。
      figure-protocol-11
  2. 図 1に示すように、オフラインで使用する高粘度押出インジェクターのセットアップ。
    注意: 油圧押し出しによるインジェクター関数は高速液体クロマトグラフィー ポンプによって供給やガス調整器によって制御される流れの可視化ヘリウム ガス シースを使用しています。ポンプとレギュレータのセットアップは、このプロトコルでは説明しません。第 4 章の詳細なマニュアルのジェームズ (2015)48を参照してください。
    1. ポンプと、流量が正確なことを確認するすべての水行を削除します。インジェクターの油圧式の段階をパージします。
    2. フレーミングと高速ビデオのための焦点を促進する 3 軸ステージのインジェクター (またはカメラ) をマウントします。対物レンズ、照明、反射、画面使用済サンプルをキャッチする小さなビーカーに挿入ポイント周辺の領域を残します。
    3. 「ダミー ノズル」を構築 (付属ノズル付き空タンク)、位置決め、フォーカス、および照明容易にするインジェクターにインストール。
    4. ノズル先端の対物レンズの集光点近傍での高速カメラをマウントします。
    5. インジェクターの後ろ反射のスクリーンを置き、フロント ライト ノズルに照明を調整します。
    6. オンに、付属のソフトウェアでカメラに接続します。視覚的なフィードバックを実行しているライブ ビデオ、フレームの中央にノズル先端部の位置し、3 軸ステージで焦点に持参しています。
    7. ノズルがはっきりと見えるし、背景が均等に点灯している照明を調整します。
  3. 高速コマ撮りビデオを記録するカメラを設定します。
    1. 1000 fps にフレーム レートを設定します。512 x 512 ピクセルの解像度を設定します。
    2. フレーム レートを設定する露光時間、照明レベルを調整ノズルが表示されるまで (すなわち、下ではない- または露出オーバー)。ノズル先端中心になるので、位置は、左から右へとフレームの上部 3 分の 1 であります。
    3. バック グラウンド補正やホワイト バランスの操作を実行します。
    4. タイムラプス モードにカメラを設定します。設定した間隔30 sを繰り返すと40 倍、ランダム(またはランダム リセット)、トリガー モードを設定し、 1000に記録するフレーム数を入力します。
  4. テスト サンプルの 20 μ L で貯水池をロード、キャピラリー ノズルを取り付けます。
  5. インジェクターに充填タンクを取り付けます。ノズルのポートにガス管を接続し、ガスの流れを開始します。
  6. ラインのバルブを開き、注射器を押して、ピストンを手動で進めます。ピストンが貯水池内のサンプルが付いている固体接触を作成するときは、バルブを閉じます。
  7. 計算された流量とポンプをプログラムし、計算値に最大圧力を設定 (手順 2.1.3 を参照してください)。
  8. 同時にポンプ、カメラの記録を開始します。
  9. 押し出しが開始すると、安定性を高めるガスの圧力を調整します。流体は、列ではなくノズルの先端にドロップを形成する場合は、ガス圧を上げてください。押し出しがガスの流れから過剰なせん断による切断が急速に不安定か減少圧力 (鞭)。
  10. 押し出しを監視 (10 分は通常均一な流動状態を認識するのに十分な) と、ポンプの圧力は鋭く予想終了時間近くランプアップ、記録、ポンプ、オフにシャット ダウンを停止し、リリーフ弁を開いて、システムの圧力をぶちまけます。
  11. ビデオ ファイルの分析
    注: ははっきりと不十分なサンプル押し出しでは、詳細な分析は必要ありません。ただし、サンプルを最適化可能性があります故障モードを識別するのに役立ちますです。
    1. 解析ソフトウェア (例えば、フィジー49) でビデオ ファイルを開き、測定ツールを調整します。
    2. 線選択ツールでビデオのイメージで知られている長さの行を選択することにより測定値を調整します。分析による縮尺の設定ウィンドウを開きます |縮尺を設定既知の距離と測定単位を入力します。
      注: ノズルの径はこれらの測定の適切な校正長さを提供します。
    3. ビデオのフレームを見つける押し出しで追跡可能な機能の表示 (例えば、結晶) があります。フレーム番号を記録します。
    4. 同じ機能は表示されますが、前のステップでその位置から移動しましたフレームにビデオを進みます。フレーム番号を記録します。
    5. エンドポイントを介して分析、機能の開始からの距離を測定直線測定ツールを使用して |メジャー。
      注: より長い追跡可能な距離、測定のエラーの減少が計算に影響します。
    6. 測定距離と経過時間 (経過フレームのフレーム レートで割った値の数。) ジェット速度を計算します。
    7. ビデオのすべてのセグメントのための手順 2.11.3-2.11.6 に数回を繰り返します。
    8. 図 2のようにデータ系列をプロットします。

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結果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ここで説明する手順 (図 3) 最適な開始材料は、インジェクター粘性キャリア媒体に組み込まれて微結晶の高密度です。各準備のため結晶積んだキャリアの約 50 μ L のプロシージャを呼び出します。これらは bR9,10 (図 4)、例としてここでは、使用または従来の蒸気拡散設定で成長した結晶を使用して準備として LCP で直接育てることができます。気密性の注射器で直接結晶化に優れたビデオ ガイド見つけることができます Ishchenko ら (2016)37。BR、結晶板の最適径は回折電源とポンプ レーザーによる均質活性化の間の良い妥協案として約 20 μ m です。タンパク質の結晶は、上述のように、プロトコルを使用して準備は、光子の吸収 (図 5

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ディスカッション

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TR SFX 粘性押し出しインジェクターによるバクテリオロドプシン9,10と光化学系 II13の構造ダイナミクス研究の現実的な手法であると証明したし、今他を運転する蛋白質を研究する準備ができています。写真光駆動イオン輸送や知覚5,50などの生物学的プロセス。上記プロトコルがバクテリオロドプシン、TR 特撮データ コレクションの成功を最大化するために設計された、まだ他のサンプルでのデータ収集を最適化するためにテンプレートとして使用できると考えています。このように、貴重な課題の多くは現在目詰まりのため失ったまたは貧しいサンプル押し出し以上の時間遅れでより良いデータの収集に使用できます。

プロトコルの最も困難で、重要なステップは、キュービック相 (ステップ 1.8) に脂質のマトリックスをもたらすモノオレイン...

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開示事項

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者は矛盾した興味を宣言しません。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

我々 は、PSI の高粘度注入器の使用をサポートするためゲプハルト Schertler、ラファエル Abela、クリス ・ ミルンを認めます。リチャード Neutze と彼のチームを時間分解構造解析と高粘度のインジェクターを使用してサンプル配信に関する議論を認めています。金融サポート、我々 を認める 31003A_159558 (バッハ) に助成金 31003A_141235 のスイスの全米科学財団と (P.N.) に PZ00P3_174169。このプロジェクトは、欧州連合のホライゾン 2020年研究とキュリー マリアスクウォドフスカ助成契約なし 701646 の下で革新プログラムからの資金を受けています。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
モスキートLCPシリンジカップリングTTPラボテックストア3072-01050
ハミルトンシリンジ1710 RNR、100&マイクロ;lハミルトンHA-81065
ハミルトン シリンジ 1750 RNR、500 & マイクロ;lハミルトンHA-81265
モノオレインNu-Chekプレップ株式会社M-239
7.9 MAGアバンティポーラーリピッド株式会社850534O
50% w/v PEG 2000分子寸法MD2-250-7
パラフィン(液体)Sigma-Aldrich1.07162
ハイスピードカメラフォトロンフォトロンミニ AX
高倍率レンズNavitar12倍ズームレンズシステム
三軸ステージThorLabsPT3/M
ファイバーライトThorlabsOSL2
溶融シリカファイバーMolex / PolymicroTSP-505375
タッチフェルールIDEXLT-100
ASU高粘度インジェクターアリゾナ州立大学ウーヴェWeierstallから購入可能(weier@asu.edu)
HPLCポンプ島津LC-20AD
電子ガスレギュレータープロポーションエアGP1
ライト

参考文献

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