ここでは、異種系移植片対宿主病(xenoGVHD)モデルにおける疾患を誘導し、スコア付けするプロトコルを提示する。xenoGVHDは、ヒトT細胞の免疫抑制を研究するためのインビボモデルを提供する。さらに、免疫抑制を定量化するツールとしてデジタルPCRを用いて組織内のヒトT細胞を検出する方法について述べた。
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この記事について
サマリー
要約
急性移植片対宿主病(GVHD)は、血液学的欠乏および悪性腫瘍の治療として造血幹細胞移植を受けている患者にとって重要な制限である。急性GVHDは、ドナーT細胞が宿主組織を外来抗原として認識し、宿主に免疫応答をマウントするときに起こる。現在の治療には、患者が感染や再発を受けやすくする有毒な免疫抑制薬が含まれます。したがって、ドナーT細胞を効果的に標的にし、副作用を減らすことができる急性GVHD療法を提供するための継続的な研究があります。この前臨床研究の多くは、生体内系のマウス細胞ではなくヒト細胞に対する免疫抑制療法の試験を可能にする異種生成GVHD(xenoGVHD)マウスモデルを使用しています。このプロトコルは、xenoGVHDを誘導する方法と、一貫した結果を確実にするために臨床スコアリングを盲目にし、標準化する方法を概説します。さらに、このプロトコルは、デジタルPCRを使用してマウス組織内のヒトT細胞を検出する方法について説明し、その後、試験された治療の有効性を定量化するために使用することができる。xenoGVHDモデルは、GVHD療法をテストするモデルを提供するだけでなく、ヒトT細胞を抑制できる任意の治療法を提供し、多くの炎症性疾患に適用することができる。
概要
同種造血幹細胞移植(HSCT)は、予後不良の白血病などの血液学的悪性腫瘍に苦しむ患者の日常的な治療となっている。HSCTの有意な合併症は急性移植片対宿主病(GVHD)である。2012年の研究では、急性GVHDが兄弟ドナーから移植を受けているHSCT患者の39%と無関係なドナー1からの移植を受けている患者の59%で開発されたと報告されています。急性GVHDは、ドナー由来のT細胞がレシピエントの臓器を攻撃するときに起こる。GVHDの唯一の成功した治療法は、非常に毒性が高く、感染および腫瘍再発のリスクを高める高い免疫抑制薬2による治療である。したがって、近年3、4、5の急性GVHD生存率で行われた改善にもかかわらず、長期寛解を促進する毒性を最小限に抑えたGVHD療法の改善が依然として重要である。
以下の方法の全体的な目標は、異種系GVHD(xenoGVHD)を誘導し、スコア付けすることです。xenoGVHDモデルは、前臨床GVHD研究を臨床試験6に直接翻訳することを可能にするマウス細胞ではなくヒト細胞で急性GVHDを誘導するツールとして開発された。このモデ....
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プロトコル
すべてのマウス実験は、カンザス大学医療センター機関動物ケア・使用委員会の承認を得て、コンプライアンスに従って行われました。すべての健康なヒト血液サンプルは、インフォームドコンセントの下で、カンザス大学医療センターの機関審査委員会の承認を得ました。
1. NSGマウスの照射
- PBMC注射の1日前に、8〜12週齢のNSGマウスを照射する(どちらの性別も使用することができる)。滅菌バイオセーフティキャビネットに、マウスを滅菌パイケージまたはマイクロアイソレータに入します。Cs137源または小動物照射器(例えば、RS2000)でマウスを照射し、回転が遅い150cGyの総用量を有し、照射さえ確実にする。
- 無菌のバイオセーフティキャビネットにマウスを清潔なケージに入れなさい。
2. 注射のためのヒトPBMCの調製
- マウスあたり1.1 x 107 PBMCを分離するのに十分な健康なヒト血液を収集します。リン酸緩衝生理食生(PBS)で2%の胎児ウシ血清(FBS)の等しい体積でヘパリン化された血液を希釈する。
注:このプロトコルでは、PMBC収率は一般に全血10mL当たり0.5-1 x 107です。各マウスは100 μLのPBSで107 PBMCを受け取ります。マウスあたり1....
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結果
ヒトPBMCを受けた両男女の8〜12週齢のNSGマウスを、PBSのみを受け取った陰性対照マウスと比較して10日目のポスト注射の臨床徴候を示し始めた(図1A)。XenoGVHDマウスは23.5日の中央値生存期間を有した(図1B)。デジタルPCRを用いて、CD3イプシロン陽性ヒトT細胞は、ヒトPBMCを受けたマウスの肺および肝臓サンプルで検出することができた。PBSを注射したマウスからの組織サンプルを対照として用いた(図2)。
図1:GVHD疾患の進行。8-12週齢の雄および雌のN.......
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ディスカッション
疾患の進行は、一般的に異なるドナーからのPBMCの注入であっても、xenoGVHDモデルで一貫しているので、複数の実験を組み合わせることができます。この一貫性を維持するために必要な重要な手順は、適切なi.v.インジェクション技術、ブラインドと一貫性のあるスコアリングです。Nervi et al.25による研究は、静脈内尾静脈注射と比較して、PBMCのレトロ軌道注射がより一貫性のある生着生着生着生およびより重度のGVHDをもたらすことを実証した。Leon-Rico et al.26はまた、レトロ軌道注射が尾静脈注射と比較してマウスにおける造血幹細胞の生着生着生がより一貫していることを実証した。しかし、必要に応じて、尾静脈注射は、xenoGVHDモデル27、28、29の代替方法として使用することができる。
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開示事項
利益相反は宣言されていません。
謝辞
レーン・クリステンソンの研究室では、これらの実験で使用されるデジタルPCRマシンを提供し、提供される技術サポートを提供することを認めしたいと思います。また、トーマス・ヤンキー博士の指導と指導に感謝します。これらの研究は、トリップファミリー財団によって支援されました。
....アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 1.5 mL エッペンドルフ チューブ | フィッシャー | 05-408-129 | |
| 10 mL 血清ピペット | VWR インターナショナル | 89130-898 | |
| 10mL BD Vacutainers - ヘパリンナトリウムでキャップされたグリーン | ベクトン ディキンソン | 366480 | |
| 250 & マイクロ;L Raninピペットチップ | レイニン | 17001118 | 液滴発生には他のピペットやピペットチップを使用しないでください |
| 50 mL コニカルチューブ | VWR International | 89039-656 | |
| 96-Well ddPCR plate | Bio-Rad | 12001925 | |
| ACK(塩化アンモニウムカリウム) 溶解バッファー | Lonza | 10-548E | オプションの |
| アルコールワイプ | Fisher Scientific | 6818 | |
| 麻酔室 | ワールド精密機器 | EZ-178 | 動物施設提供 |
| 麻酔器 | パークランド・サイエンティフィック | PM1002 | 動物施設提供 |
| BD Vacutainer Safety-Lok採血セット | ベクトン・ディキンソン | 367281 | |
| DG8 QX100/QX200液滴発生器用カートリッジとガスケット | バイオ・ラッド | 1864007 | |
| DNAseおよびRNAseフリー 分子グレードH2O | Life Technologies | 1811318 | |
| エチルアルコール、ピュア、200プルーフ、分子生物学用 | Sigma-Aldrich | E7023-500ML | |
| ウシ胎児血清 | アトランタバイオロジカルズ | S11150 | |
| フィコール | ッシャーサイエンティフィ | 45001750 | |
| インスリンシリンジ | フィッシャーサイエンティフィック | ||
| イソフルラン | Sigma-Aldrich | CDS019936 | 動物施設提供 |
| 液体窒素 | N/A | N/A | |
| マウス照射器 パイケージ | Braintree Scientific, Inc. | MPC 1 | 最大 11 匹のマウスを保持 |
| Nexcare Gentle Paper Tape (a.k.a. 3M Micropore Surgical Tape / 3/4") | Fisher Scientific | 19-027-761 | |
| P1000 pipetman | MidSci | A-1000 | |
| P200 pipetman | MidSci | A-200 | |
| Pierceable Foil Heat Seal Bio-Rad | |||
| Pipetaid Gilson Macroman | Fisher Scientific | ||
| Pipet-Lite マルチピペット L8-200XLS+ | レイニン | 17013805 | 液滴発生に他のピペットやピペットチップを使用しない |
| Qiagen DNeasy 血液および組織キット | Qiagen | 69506 | |
| qPCR プレート | VWR International | 89218-292 | |
| QX200 Droplet Digital PCR System | Bio-Rad | 12001925 | 液滴発生器、液滴リーダー、ラップトップコンピューター、ソフトウェア、関連コンポーネント消耗品、EvaGreenまたはプローブベースのデジタルPCRアプリケーション用 |
| QX200 液滴生成オイル、EvaGreen | Bio-Rad | 1864006 | |
| QX200 ddPCR EvaGreen Supermix | Bio-Rad | 1864033 | |
| RNaseおよびDNaseフリープレートシール | Thermo Scientific | 12565491 | |
| RPMI Advanced 1640 | ライフテクノロジー | 12633012 | |
| 滅菌ガーゼパッド(2 "x 2"、12プライ) | フィッシャーサイエンティフィック | 67522滅菌 | |
| リン酸塩緩衝生理食塩水 | フィッシャーサイエンティフィック | 21040CV | |
| 滅菌リザー | バーVWRインターナショナル | 89094-662 | |
| 外科はさみケン | トサイエンティフィック | INS600393-4 | |
| 外科用鉗子 | Kent Scientific | INS650914-4 |
参考文献
- Jagasia, M., et al. Risk factors for acute GVHD and survival after hematopoietic cell transplantation. Blood. 119 (1), 296-307 (2012).
- Bolanos-Meade, J., et al. Phase 3 clinical trial of steroids/mycophenolate ....
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