Method Article

マウス頭蓋組織および非除電骨の組織調製と免疫染色

DOI:

10.3791/59113

⸱

May 10th, 2019

 ,  , 
1The State Key Laboratory Breeding Base of Basic Science of Stomatology (Hubei-MOST) & Key Laboratory for Oral Biomedicine of Ministry of Education, School and Hospital of Stomatology, Wuhan University, 2Department of Biologic and Materials Sciences, School of Dentistry, University of Michigan

In This Article

Summary

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ここでは、マウス頭蓋組織を例に免疫染色することにより、頭蓋顔面形態/病因の間のタンパク質レベルを検出し、定量するための詳細なプロトコルを提示する。また、免疫染色のための若いマウスからの非デカル化された硬質組織の調製および凍結切除の方法について説明する。

Abstract

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組織免疫染色は、所定の組織内の目的のタンパク質の非常に特異的で信頼性の高い検出を提供します。ここでは、マウス頭蓋組織を例にした頭蓋骨形成/病因の間にタンパク質発現を検出するための完全で簡単なプロトコルについて説明する。このプロトコルは、組織の調製および凍結切除、間接免疫蛍光、画像取得、および定量化で構成されます。また、免疫染色のための非デカール化硬組織の調製および凍結切除のための方法が記載されており、例として頭蓋顔面組織および長骨を用いる。これらの方法は、頭蓋骨形成/病因の間に様々な組織におけるタンパク質発現および形態学的/解剖学的変化を決定する鍵となる。それらは適切な変更を加える他の組織にも適用可能である。血管学の知識とセクションの高品質は、実験的な結果から科学的な結論を引き出すために重要です。この方法論の潜在的な制限には、抗体の特異性および定量化の困難が含まれるが、これらに限定されない。

Introduction

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顔は人間のアイデンティティの重要な部分であり、上皮、筋肉、骨、軟骨、歯など、いくつかの異なるタイプの組織で構成されています。これらの組織は、外胚芽、内皮、中胚芽1、2の3つの胚芽層すべてに由来する。頭蓋組織の適切なパターン化と開発のためには、細胞増殖、死亡および分化は、Wnt、Fgf、HhおよびBmp経路3、4などの特定のシグナル伝達経路によって高度に調整され、調節される必要がある。、5.細胞の増殖、生存または分化の欠陥は、最も頻繁に発生する先天性先天性欠損の一つである頭蓋骨の奇形につながります。トランスジェニックマウスは、頭蓋骨形成および病態1、2、3、4、5のメカニズムを研究するのに有用なツールである。発達と病因の間の頭蓋の構造の変化を理解することは、主要な発達原理と頭蓋顔面奇形のメカニズムを明らかにする....

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Protocol

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すべてのマウス実験は、ミシガン大学のガイドラインに従って、動物の人道的ケアと研究における動物の使用をカバーして行われました。この研究で使用されるすべての動物の手順は、ミシガン大学の機関動物ケアおよび使用委員会(IACUC)によって承認されました(プロトコル#PRO00007715)。

1. 組織製剤

  1. 胚組織の調製
    1. 10cm皿1枚とリン酸緩衝生理食(PBS)を含む3.5cmの皿を1つと、妊娠マウスごとにPBSに2mL 4%パラホルムアルデヒド(PFA)を含む12ウェル培養プレートを1つ用意します。すべてのペトリ皿とプレートを氷の上に置きます。
      注:ヒュームフードで4%PFAを取り扱います。
    2. 前述の14.14のように、妊娠中のマウスから鉗子とはさみで氷冷PBSで胚を解剖する。
      1. 簡単に言えば、CO2で妊娠マウスを安楽死させ、鉗子で腹の中心の下の皮膚をつかみ、皮膚だけを切り取り、その後、腹部の筋肉壁の下からそれを分離するために皮膚を穏やかに引っ張る。
      2. 次に、皮膚切開の同じラインに続いて腹腔に切り込む。胚の文字列を含む子宮を取り除き、子宮壁をそっと切り取って胚を取り除く。黄身嚢やアムニオンなどの胚外組織が除去されます。

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Results

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胚頭蓋組織切片
上記のステップに続いて、頭部を対照(P0-Cre)または変異体(神経堤細胞におけるBmpr1a、P0-Cre;caBmpr1a)胚(E)16.5または18.5で解剖した。 4時間のPFAで4%PFAを固定した後、サンプルをOCTに埋め込み、冠状動脈に凍結切除した。得られた切片は、pSmad1/5/9(下流BMPシグナル伝達因子)またはKi67(細胞増殖マーカー)に対する抗体で免疫染色し、プロトコルに従って抗原検索を行わずに行った。図に示すように、pSmad1/5/9(図1A)およびKi67(図1C)は対照胚の前頭骨において陽性であった。変異胚では、pSmad1/5/9のレベルが増加し(図1B)、Ki67のレベルは前頭骨で減少した(図1D)。これら.......

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Discussion

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ここでは、マウスヘッドと非デカル化された骨組織の調製のための詳細なプロトコルと、細胞増殖、細胞死、およびBMPシグナル伝達マーカーの免疫染色のための凍結切除を提供する。また、免疫蛍光画像から定量的データを得るための戦略についても詳しく述べる。これらの方法は、適切な修飾を有する他の組織にも適用可能である。

組織調製の条件は、組織の大きさと種類によって異なります。固定と凍結保護時間は、通常、一晩に数時間を必要とします。固定後、組織はパラフィンに埋め込まれ、マイクロトーム16で切断することもできる。パラフィンとOCTの両方が免疫染色のためにうまく動作しますが、それらの間にいくつかの違いがあります。パラフィンブロックはRTで複数年保持することができ、OCTブロックは-80°Cで1年間保持できます。パラフィンは組織形態を保持し、OCT埋め込み中に形成された氷結晶は組織構造に悪影響を及ぼす可能性がある。パラフィンは時々抗原のエピトープをマスクし、OCTは酵素活性と抗原エピトープを保存します。したがって、4%PFAで4時間以下で固定し、OCTに埋め.......

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Disclosures

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著者は何も開示していない。

Acknowledgements

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この研究は、国立衛生研究所(R01DE020843 to Y.M.)、国際FOP協会(Y.M.)、および中国国立自然科学財団(31500788からJ.Y.)からの助成金によって支援されました。

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
粘着テープLeica#39475214
Alexa Fluor 488-ヤギ 抗ウサギ二次抗体InvitrogenA-11034
DAPI入り退色防止剤P36931
ウシ血清アルブミンSigmaA2153
カバースリップフィッシャー ブランド12-545-E
クライオスタットライカCM1850
EDTASigmaE6758
蛍光顕微鏡オリンパスBX51
ゼラチンSigmaG1890
In Situ 細胞死検出キットミリポアS7165
顕微鏡スライドフィッシャーブランド12-550-15
OCT化合物フィッシャーヘルスケア23-730-571
パラホルムアルデヒド(PFA)シグマP6148 
リン酸緩衝生理食塩水(PBS)SigmaP4417
ポリエチレングリコール tert-オクチルフェニルエーテルSigmaT9284Triton X-100
Proteinase KInvitrogenAM2542
Rabbit anti-Ki67 antibodyCell Signaling Technology9129Lot#:3;RRID:AB_2687446
ウサギ抗pSmad1/5/9抗体細胞シグナル伝達技術13820ロット#:3;RRID:AB_2493181
クエン酸ナトリウムΣ1613859
ショ糖ΣS9378
トリスシグマ10708976001

References

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  1. Trinh, L. eA., Fraser, S. E. Imaging the cell and molecular dynamics of craniofacial development: challenges and new opportunities in imaging developmental tissue patterning. Current Topics in Developmental Biology. 115, 599-629 (2015).
  2. Marcucio, R., et al.

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