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方法論記事

主なヒト cd4 陽性 T リンパ球から低ミトコンドリア DNA 汚染 ATAC seq 試金

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DOI：

10.3791/59120

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2019年3月22日

 ,  , 
1Department of Biology, Boston University, 2Department of Computer Science and Engineering, University of California San Diego, 3Bioinformatics Program, Boston University

この記事について

サマリー

ここでは、活性化 cd4 人間リンパ球を (ATAC seq) をシーケンス処理トランスポザーゼ アクセス クロマチンのアッセイを実行するプロトコルを提案します。プロトコルは、新しい換散バッファーの導入により 3% に 50% からミトコンドリア DNA の読み取りの汚染を最小限に変更されています。

要約

ATAC seq ゲノムワイド アクセス クロマチンのマッピングへの迅速かつ簡単なアプローチによるエピジェネティクスの研究で広く使われている方法論となっています。本稿ではミトコンドリア DNA の読み取りを汚染を減らす向上の ATAC seq プロトコルを提案する.以前の ATAC seq プロトコルに苦労している間ミトコンドリア DNA の汚染 50% の平均を読み取ると、この議定書で導入された最適化された換散バッファー 3% の平均にミトコンドリア DNA の汚染を軽減します。この改良の ATAC seq プロトコルは、シーケンシング コストに近い 50% 削減できます。データの分析を通じて全血からの cd 4 + リンパ球の隔離からのステップバイ ステップの手順を提供する活性化 cd4 リンパ球からこれらの高品質の ATAC seq ライブラリを準備できる方法を紹介します。改良されたこの ATAC seq プロトコルは細胞のタイプの広い範囲で検証されている、クロマチン接近性を勉強して研究者にすぐに使用されます。

概要

トランスポザーゼ アクセス クロマチン (ATAC seq) をシーケンス用急速にクロマチン アーキテクチャを尋問のため主要な方法となっています。ATAC seq は tagmentation、断片化、シーケンスが全ゲノムにわたってクロマチン アクセシビリティを判断できますライブラリを生成する、同じ酵素によって DNA のタグ付けのプロセスを介してアクセス可能なクロマチン領域を識別できます。この tagmentation プロセスは、のみ nucleosomic 立体障害によるクロマチンの開いている領域をカット非常に活発の Tn5 トランスポサーゼによって媒介されます。それはカット、Tn5 トランスポザーゼはまたを可能にする PCR による迅速なライブラリ構築およびゲノムワイド アクセス クロマチン1,2次世代シーケンス シーケンス アダプターを挿入します。

ATAC seq クロマチン アクセシビリティ比較的単純で高速なプロトコル、品質とその結果、および開始に必要な材料の少量から判断できる情報の範囲のための領域を特定する最寄りの方法となっています。MNase seq4 (オープン ゲノム領域のヌクレオソームの位置が決まります)、(これはまたゲノム クロマチン接近性を測定) DNase seq

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プロトコル

この改良されたプロトコルは、データ解析 (図 1) による全血の原料から cd4 陽性リンパ球の ATAC seq を実行するための手順を説明します。

1. 全血からの cd 4 + T 細胞の分離

注:このプロトコルのための開始材料は研究の要件に基づいて選択する開始材料の源の標準手続きを使用して収集した新鮮な全血の 15 mL です。必要に応じて、プロトコルをスケールします。リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) + 2% ウシ胎仔血清 (FCS) 部屋の温度 (RT) をあらかじめ暖かいし、cd4 陽性 T 細胞濃縮手順を開始する前に RT する遠心分離機を調整します。

  1. 50 mL コニカル チューブにおける全血 15 mL に人間 cd 4 + T 細胞濃縮カクテル 750 μ L を追加、逆転で軽く混ぜます。室温で 20 分間インキュベートします。培養が完了したときは、チューブに 15 mL の PBS + 2% の FCS を追加、インバージョンによる軽く混ぜます。
  2. 密度媒体の 15 mL と 50 mL の新鮮な円錐管を準備します。慎重に層形成密度媒体/血インターフェイスを混乱しないように確認して密度媒体の上に希釈した血液サンプル。設定 1 を降順のブレーキの加速g....

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結果

新鮮な全血の 15 mL からは、このプロトコルは 100 万の cd4 陽性 T 細胞の平均を生成します。これらは、後で処理するため冷凍またはすぐに使用できます。新鮮なまたは解凍、cd 4 + T 細胞の生存率は一貫して > 95%。Cd4 陽性 T 細胞分離のこの方法は、柔軟性、ソースの材料とコレクションの時間この改良の ATAC seq プロトコル シーケンスの 1 ng/μ L を超える最後のライブラリを生成します。市販のシステムを用いて品質管理は、200 〜 1000 bp (図 2) との間の DNA のフラグメントを示す必要があります。シーケンスは、高品質ライブラリでのみ実行してください。

すべてのライブラリは、4000 万サンプルあたりを読む以上の平均深さに配列されました。ミトコンドリア DNA 配列読み取り1合計の 50%.......

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ディスカッション

この記事で紹介した修正の ATAC seq プロトコルは、最小限のミトコンドリア DNA 汚染で再現性のある結果を提供します。人間プライマリ PBMCs10、ひと単球 (未発表) マウス樹状細胞のクロマチン アーキテクチャの特性し、培養メラノーマ細胞線11正常にプロトコルが使用されています。この改良の換散を見込んで条件他のセルタイプのために働く可能性があります。それはまたこの核の隔離のプロトコルが単一核 ATAC seq プロトコル、シーケンス処理の結果を改善するために、ミトコンドリアの DNA 汚染を最小限に抑えることと互換性があることが予想されます。

この修正されたプロトコルの追加の利点は、患者サンプルの可用性に応じて異なる時点で PBMCs から孤立した cd4 陽性 T 細胞のバッチを凍結する能力です。すべてのサンプルに合わせて ATAC seq が同時に実行されることができます、潜在的なバッチ効果バイアス トランスポザーゼ反応とシーケンスは最小

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開示事項

著者が明らかに何もありません。

謝辞

テクニカル サポート Atsede Siba にありがちましょう。C.S.C. は、NIH グラント 1R61DA047032 によってサポートされます。

....

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
1x PBS、滅菌済みGibco10010023他の同等の製品を使用できます。
5810/5810 R Swing Bucket 50 mL、15 mL、1.5 mLチューブバケット付き冷蔵遠心分離機Eppendorf22625501他の同等の製品を使用することができます。
96ウェル丸底プレートThermo Scientific163320他の同等の製品を使用できます。
Agilent 4200テープステーションシステムAgilentG2991AA品質評価に推奨されます。
クライオチューブThermo Scientific374081他の同等の製品を使用できます。
DMSOSigmaD8418他の同等の製品を使用できます。
Dynabeads ヒト T-アクチベーター CD3/CD28Invitrogen Life Technologies11131Dクリティカルコンポーネント
Dynabeads 手つかずのヒト CD4 T 細胞キットInvitrogen Life Technologies11346Dクリティカルコンポーネント
ダイナマグネットInvitrogen Life Technologies12321Dクリティカルコンポーネント
FCSGemini Bio Products100-500他の同等のものを使用できますプロダクツ。
高感度DNAキットアジレント50674626品質評価に推奨されます。
塩化マグネシウム、六水和物、分子生物学グレードシグマM2393同等の製品を使用できます。
MinElute PCR Purification Kit (Buffer PB, Buffer PE, Elution Buffer)Qiagen28004クリティカルコンポーネント
Mr. FrostyThermo Scientific5100-0001他の同等の製品を使用できます。
NaCl、分子生物学グレードシグマS3014他の同等の製品を使用できます。
NEBNext High Fidelity 2x PCR Master MixNew England BioLabsM0541クリティカルコンポーネント
Nextera DNA ライブラリ調製キット (2x TD バッファー、Tn5 酵素)IlluminaFC1211030クリティカルコンポーネント
ヌクレアーゼフリー 滅菌 dH20Gibco10977015他の同等の製品を使用できます。
ポリソルベート20(Tween20)SigmaP9416他の同等の製品を使用できます。
PowerUp SYBR Green Master MixApplied BiosystemsA25780クリティカルコンポーネント
プレシジョンウォーターバスThermo ScientificTSGP02他の同等の製品を使用できます。
QIAquick PCR精製キットQiagen28104クリティカルコンポーネント
Qubit dsDNA HS Assay KitInvitrogen Life TechnologiesQ32851品質評価に推奨されます。
Qubit FlouroMeterInvitrogen Life TechnologiesQ33226品質評価に推奨されます。
ロゼット Sep Human CD4+ Density MediumStem Cell Technologies15705クリティカルコンポーネント
ロゼット Sep Human CD4+ Enrichment CocktailStem Cell Technologies15022クリティカルコンポーネント
RPMI-1640Gibco11875093他の同等の製品を使用できます。
滅菌済み ResevoirThermo Scientific8096-11他の同等の製品を使用できます。
T100 サーモサイクラー 加熱蓋付きBioRad1861096他の同等の製品を使用できます。
Tris-HCLSigmaT5941他の同等の製品を使用できます。
他の

参考文献

  1. Buenrostro, J. D., Giresi, P. G., Zaba, L. C., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. Transposition of native chromatin for fast and sensitive epigenomic profiling of open chromatin, DNA-binding proteins and nucleosome position. Nature Methods. 10 (12), 1213-1218 (2013).
  2. Buenrostro, J. D., Wu, B., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J.

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